천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

요약

생물막 감염은 화학요법에 대한 내성이 높습니다. 단일 분석법으로 생물막의 복잡성을 파악할 수 없습니다. 대신, 보완적인 분석이 필요합니다. 우리는 생존력, 바이오매스 및 생물막 매트릭스에 대한 분석을 결합한 스크리닝 플랫폼(S. aureus를 위해 개발됨)을 제시합니다. 이를 통해 장기적인 화학 요법 효과 평가를 포함한 항생물막 약물 발견을 할 수 있습니다.

초록

바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 잠재적으로 항생제 내성 감염의 80 %에 대한 책임이 있습니다. 바이오 필름은 인성 생각된다 화학 요법에 대한 매우 높은 공차를 표시하고있다. 예를 들어, 행렬은 생물막으로 항생제의 침투를 감소 물리적 장벽을 제공한다. 또한, 생물막 내에서 세포 표현형 다양하다. 가능성, 생물막 탄력성이와 다른, 아직 알려지지 않은 메커니즘의 조합에서 발생한다. 현재 기존 항생제 모두 단일 세포 (플랑크톤) 박테리아에 대해 개발되어왔다. 따라서, 지금까지 분자의 매우 제한된 레퍼토리는 선택적 성숙한 생물막에 작용할 수있는. 이러한 상황은 방지 생물막에 대한 검색이 더 눈에 띄는 자리를 차지하도록 촉구되어있는 신약 개발의 진보적 인 패러다임의 변화를 주도하고있다. 추가 과제는이 때문이다매우 생물막 연구를위한 표준화 된 방법, 화학 라이브러리의 대규모 스크리닝에 사용될 수있는 특히 수를 제한했다. 여기, 화학 검사에 대한 실험 안티 바이오 필름 플랫폼이 제공됩니다. 폴리 N의 아세틸 글루코사민, PNAG의 그것은 밀 배아 응집소를 사용하여 생물막 (레사 주린 염색과) 가능성, (크리스탈 바이올렛 염색) 총 바이오 매스 및 바이오 필름 매트릭스 (측정하는 세 가지 분석을 사용 WGA-형광 기반의 염색 , 분수). 모든 분석은 모델 박테리아 포도상 구균을 사용하여 개발 하였다. 플랫폼 일차 스크리닝뿐만 아니라 식별 항 생물막 히트 기능적 특성화에 사용될 수있는 방법의 예를 제시한다. 이 실험 순서는 또한 측정 된 엔드 포인트에 기초하여 히트 분류 할 수 있습니다. 또한 특히 단기 화학 요법의 효과에 비해 장기에, 행동의 자신의 모드에 대한 정보를 제공합니다. 따라서, 매우 ADVA은다양한 생명 의학 애플리케이션을위한 출발점을 제공 할 수 고품질의 히트 화합물의 빠른 식별을위한 ntageous.

서론

박테리아는 생물막이 가장 일반적인 예입니다있는 두 개의 매우 다른 생활 양식, 플랑크톤 및 정착, 사이를 전환 할 수 있습니다. 생물막에서 세균은 자체 제작 매트릭스 ^1에 포함 된 구조화 된 사회를 형성한다. 이 자동 생성 행렬은 세균 및 외부 환경 사이에 장벽이며, 근접을 유지하면서 균체를 보호한다. 생물막 매트릭스의 조성 사이에도 종 내에서 변화하지만, 대부분은 리포 폴리 사카 라이드, 세포 DNA와 단백질의 긴밀한 네트워크로 구성된다. 행렬은 유해한 제제의 입사를 억제하는 물리 장벽으로서 역할뿐만 아니라 탈수 생물막을 보호하고, 전지 ^(2)을 빠져 나가는 영양분을 방지한다.

바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 항생제 내성 감염 ^(3)의 80 % 이상에 대한 소문에 책임이 있습니다. 그들은 DISP습도, 삼투압, 기계적 응력 ^4, 열, 자외선 ^5, 살균제, 항균제, 호스트 면역 체계 ¹ : 외부 위협에 대한 본질적으로 높은 내성을 배치합니다. 예를 들어, 바이오 필름을 죽이기 위해 필요한 필요한 항균제의 농도는 플랑크톤 박테리아를 죽이기 위해 요구되는에 비해 최대 1000 배....

프로토콜

1. 박테리아 성장

1. 사전 문화 (220) rpm으로는 (16 ~ 18 시간)을 흔들어 37 ° C에서 트립신 콩 국물 (TSB)에서 하룻밤 박테리아.
2. 신선한 TSB에 (여기에서, 1000 배 S. 구균에 이용되는 박테리아의 성장 속도에 따라) 및 (이 급성장 도달하도록 37 ° C, 200 rpm에서 성장 광하게 예비 배양을 100-1,000 배 희석 0.2 및 0.6) 사이의 595 nm의 (OD _595)에서 밀도.
   참고 :이 단계는 균주 별 최적화가 필요합니다.

2. biofilm 형성 : 사전 및 사후 노출

1. (이 밀리리터 당 약 ¹⁰⁶ 콜로니 형성 단위 (CFU / ㎖)와 동일)가 기하 급수적으로 성장한 배양 100 배 희석.
2. 노광 전 프로토콜
   1. 처리되지 않은 대조군 샘플의 경우, 멸균 96 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 희석 세균 배양 200 μl를 추가합니다.
   2. 시험 화합물 또는 제어 4 μl를 추가항생제 (50 배 원액) 잘 당 희석 세균 배양의 196 μL.
   3. 18 시간 동안 200 rpm에서 플레이....

결과

제안 된 플랫폼에서, 생존, 바이오 매스 및 바이오 필름 행렬에 미치는 영향은 정량화된다. 작업 시퀀스 (도 1)에서, 하나의 샘플 플레이트를 동시에 세균 생물막의 생존과 총 생물막 미생물에 대한 영향을 평가하기 위해 크리스탈 바이올렛으로 레사 주린과이어서 염색된다. 이 레사 주린과 제 염색 크리스탈 바이올렛 플레이트 사이의 최대 신호 흡광도 단위의 비교를 위해 크리스탈 바이올렛 염색 결과 (p = 0.4149에 유의 한 효과가 없었다 별도로 염색 이전 것이 입증 되었기 때문에 두 분석은 동일한 플레이트에서 연속으로 수행 될 수있다 레사 주린 - 염색, N = 20) ⁽²⁶⁾ 후. 박테리아 플랑크톤에 대한 영향을 동시에 평가 될 수있다.

안타는 생존 또는 바이오 매스 기반 분석 중 하나에서 발견.......

토론

동시에 생존, 바이오 매스 및 생물막 행렬의 화합물의 효과를 측정 할 수있는 하나의 방법은 없다. 따라서, 바람직하게는 일차 스크리닝 단계에서 세 개의 엔드 포인트에 영향을 검출하기 위해 분석을 조합이 필요하다.

레사 주린는 산화 환원 프로브의 첨가로 이루어지는 매우 간단한 염색 프로토콜이다. 그러나, 레사 주린과 생물막 최적의 배양 시간을 설정하는 것은 상기 분석의 성공에 중요하다. 다른에서 몇 시간 ^{19 지속될} 수 있지만 일부 균주에서 분홍색 형광 레조 루핀 (resorufin)으로 레사 주린 프로브의 감소는 매우 신속하게 발생한다. 또한, 동일 균주 내에서, 또한 플랑크톤 박테리아와 바이오 필름 사이에 상당한 차이가있을 수 있습니다. 플랑크톤 박테리아는 일반적 쉽게 세균 밀도 생물막 PO보다 플랑크톤 집단 낮고 주로 때문에 도달반응의 빠른 회전율을 촉진 pulations. 생물막 생존 염색법 프로브 게시 비교하여, 레사 주린이 가장 정확하고 사용이 간.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Resazurin	시그마 알드리치	R7017
크리스탈 바이올렛	시그마 알드리치	HT90132
밀 배아 Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	W11261
LIVE/DEAD BacLight	분자 프로브	L7012	SYTO 9 생존 세포 염색 용 녹색 및 프로피듐 요오드화물 염색 죽은 세포 적색
인산염 완충 식염
트립톤 콩 한천	Lab M, Neogen	LAB011
트립틴 콩 국물	Lab M, Neogen	LAB004
F96 웰 플레이트 폴리스티렌 멸균 투명 평면 바닥	Thermo Fisher Scientific	161093
브랜드 캡, 8 스트립	Sigma Aldrich	BR781413-300EA
Branson CPX 시리즈 초음파 수조	Sigma Aldrich	Z769428-1EA
멀티피펫	Thermo Fisher Scientific
멀티드롭 디스펜서	Thermo Fisher Scientific
Biomek 3000	Beckman Coulter
Varioskan 플래시 멀티플레이트 리더	Thermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureus	ATCC	25923

수 년