이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

된 유의 메틸화 측정

5.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54838

⸱

2016년 12월 21일

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

이 논문에서

요약

Islet β 세포 사멸은 제1형 당뇨병의 발병보다 먼저 발생하며, 이 과정을 감지하면 조기 치료 개입이 가능할 수 있습니다. 여기에서는 세포 사멸의 바이오마커로서 인간 혈청에서 차등 메틸화된 INS DNA 종을 측정하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다β.

초록

섬 β 세포의 사멸은 거의 모든 형태의 당뇨병의 발병 기전의 기저에 있는 것으로 생각되며, 특히 제1형 당뇨병에서 솔직한 고혈당증의 발병에 선행하는 것으로 생각됩니다. β세포 사멸에 대한 민감하고 신뢰할 수 있는 바이오마커의 개발은 당뇨병의 발병을 예방하거나 지연시키기 위한 조기 치료 개입을 가능하게 할 수 있습니다. 최근, 우리 자신을 포함한 여러 그룹에서는 혈액 순환 중 프리프로인슐린(INS)을 인코딩하는 세포가 없고 차등적으로 메틸화된 DNA가 1형 당뇨병 전단계 당뇨병 및 새로 발병하는 1형 당뇨병의 세포 사멸β 상관관계가 있다고 보고했습니다. 여기에서는 -69bp 위치(전사 시작 부위 기준)의 시토신에서 차등 메틸화되는 cell-free INS DNA를 측정하기 위해 디지털 PCR을 사용하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 당사는 이 분석법이 -69bp 위치에서 메틸화된 시토신과 메틸화되지 않은 시토신을 구별할 수 있고, 여러 자릿수에 걸쳐 선형이며, DNA 복제 수의 절대 정량화를 제공하고, 새로 발병한 제1형 당뇨병 및 무질병 대조군을 가진 개인의 인간 혈청 샘플에 적용할 수 있음을 입증합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 순환 또는 분리된 세포 및 조직에서 차등적으로 메틸화된 사이토신의 검출이 필요한 모든 DNA 종에 적용할 수 있으며 DNA 단편의 절대 정량화를 제공할 수 있습니다.

서론

제 1 형 당뇨병 (T1D)은 자기 반응성 T 세포를 1 β 세포의 인슐린 - 생성 췌장의 파괴를 특징으로하는자가 면역 질환이다. T1D의 진단은 일반적으로 인슐린 결핍의 증거로 케톤 산증으로 야기 될 수 있습니다 린, 젊은 개인에 고혈당 (혈당> 200 밀리그램 / DL)의 측정에 따라 이루어집니다. T1D의 진단시, β 세포 기능 및 질량의 상당한 감소에 대한 증거가있다 (50 - 90 %)이. 임상 연구에서, 진단시 제정 된 여러 면역 조절 성 약물, 질병의 임상 적 관해 이어질 β 세포 기능 (그리고 아마도 질량), 그러나 아무도의 안정화 개발을위한 전화를 제기 한 연구 결과를 초래 질병의 초기 탐지와 대한 바이오 마커의 조합의 효과의 길이 추적 3,4 치료. 국제 컨소시엄의 노력, 이러한히스 (5)의 국립 연구소에서 인간의 작은 섬 연구 네트워크 컨소시엄이야, T1D의 β 세포 스트레스와 죽음에 초점 바이오 마커의 개발 필요성을 강조했다.

9 - 이러한 노력에 맞춰, 우리 그룹 등 최근 β 세포 6 죽어 주로 발생, 후 성적 변형 된 DNA 조각을 순환 측정 바이오 마커 분석을 개발했다. 지금까지 발표 된 검정 모두에서, 초점이 다른 세포 유형에 비해 코딩 및 프로모터 영역의 비 메틸화 된 CpG 부위의 큰 정도를 보여주는 인간 유전자 부호화 preproinsulin (INS)의 정량에있다. 메틸화 INS DNA 단편의 해방은 (괴사, 세포 사멸) β 세포를 죽음에서 주로 발생으로 가정 하였다. 우리의 최근의 연구는 청소년, 위치 -69 bp의에서 메틸화 및 메틸화 모두 INS의 DNA에 고도는 (상대가 마에 것으로 나타났다그는 새로운 발병 T1D에서 관찰되었다) 사이트를 시작, 함께이 인구 6과 같은 특정 바이오 마커를 제공 전사. 이러한 바이오 마커 분석이 분리 된 DNA의 중아 변환 다음에 상용 스핀 키트를 사용하여 혈청 또는 혈장에서 무 세포 DNA의 분리를 포함 (우라실에 비 메틸화 된 시토신을 변환하는 그대로 메틸화 된 시토신을 떠나).

이 보고서에서 우리는 차별적 메틸화 INS DNA에 대한 혈청 샘플 수집, 혈청에서 무 세포 DNA, 중아 변환 및 (이제부터는, 디지털 PCR) 방울 디지털 PCR의 성능 분리의 기술적 측면에 대해 설명합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

윤리 선언문: 프로토콜은 인디애나 대학교 기관 검토 위원회(Indiana University Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 피험자의 부모는 서면 동의서를 제공했으며, 7세 이상의 아동은 참여에 동의했습니다.

1. 혈청 가공

참고: 설명된 분석은 다음과 같이 분리된 인간 혈청을 사용하여 엄격하게 테스트되었습니다.

  1. 하나의 빨간색 상의(무첨가, 코팅되지 않은) 혈액 채취 튜브에 혈액을 수집합니다.
  2. 혈전이 형성될 수 있도록 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.
  3. 2,000 x g의 원심분리기 튜브를 실온에서 10분 동안 사용합니다. 상층액(혈청)을 혈청 보관용으로 지정된 새 튜브(폴리프로필렌 나사 상단 튜브, 샘플에 따라 크기에 따라 다름)로 옮깁니다.
  4. DNA 분리가 준비될 때까지 -80ºC에서 샘플을 보관하십시오.

2. 혈청 DNA 추출

참고: DNA는 50μl의 혈청(권장)을 사용하는 DNA 추출 키트로 추출되며, 일부 수정이 가해진 제조업체의 프로토콜에 따릅니다.

  1. 마이크로 원심분리 튜브에 시료당 200μl 용해 완충액 + 1μl 폴리(A)(5μg)를 준비합니다. 15초 동안 소용돌이 2.3단계까지 따로 보관하십시오.
  2. -80ºC 냉동고에서 혈청 샘플을 채취하여 실온에서 해동합니다. 인산염 완충 식염수(PBS, 염화칼슘 및 염화마그네슘 포함)를 사용하여 총 200μl의 혈청 시료량을 가져옵니다.
  3. 샘플에 20μl 프로테아제(1.4 Anson units/ml)를 첨가한 다음 200μl 용해 버퍼/폴리A 혼합물(단계 2.2)과 8초 동안 볼텍스를 첨가하여 샘플을 용해합니다.56°C에서 10분 동안 샘플을 배양한 다음 마이크로 원심분리기(>10,000 x g)에서 최고 속도로 7초 동안 잠시 원심분리합니다.
  4. 샘플에 230μl, 100% 에탄올을 첨가하고 8초 동안 와류를 일으켜 DNA를 침전시킵니다. 최고 속도(>10,000 x g)로 7초 동안 짧게 원심분리합니다.
  5. 미니 스핀 컬럼에 600μl 샘플 혼합물을 추가하여 DNA를 스핀 컬럼에 적용합니다. 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리기 플로우스루(flow-through)를 버리고 깨끗한 튜브에 컬럼을 넣습니다.
  6. 컬럼에 500μl 세척 완충액 1을 추가하여 DNA를 세척합니다. 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리기 플로우스루(flow-through)를 버리고 깨끗한 튜브에 컬럼을 넣습니다. 500μl의 세척 버퍼 2를 컬럼에 추가하고 최고 속도(>10,000 x g)로 3분 동안 원심분리합니다. 새 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣고 다시 1분 동안 최고 속도로 원심분리합니다.
  7. 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 컬럼을 넣고 필터에 직접 60μl 용리 완충액을 추가하여 DNA를 용리합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 시료 간에 팁을 전환하는 것이 중요합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 60μl의 용리 완충액을 추가로 추가하고 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
  8. 나중에 사용할 수 있도록 DNA를 -20ºC에 보관하거나 즉시 중아황산염 전환을 진행하십시오.

3. 중아황산염 변환

참고: 중아황산염 변환은 중아황산염 변환 키트를 사용하여 수행되며, 제조업체의 프로토콜에 따라 약간의 수정이 가해집니다.

  1. 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 전환하려면 PCR 튜브(단일 0.2ml PCR 튜브 또는 8-스트립 PCR 튜브)에서 2.7단계의 DNA 20μl에 130μl의 중아황산염 전환 시약을 추가합니다. 나중에 사용하거나 복제 반응에 사용할 수 있도록 나머지 40μl의 DNA를 저장하십시오. 위아래로 피펫팅하여 20회 혼합하고 짧게 원심분리하여 측면이나 뚜껑에 방울이 떨어지지 않도록 합니다. 다음과 같이 수조 또는 열 순환기에서 배양하십시오 : 98 ° C 8 분 동안, 54 ° C 60 분, 4 ° C 5 분 동안.
    1. 3.2단계로 진행하거나 4°C에서 최대 20시간 동안 보관하십시오.
  2. 600μl의 결합 완충액을 스핀 컬럼에 추가하고 제공된 수집 튜브에 컬럼을 놓습니다. bisulfited DNA를 컬럼에 적용하고 위아래로 10회 피펫팅하여 혼합합니다. 최고 속도(>10,000 x g)에서 30초 동안 원심분리기 폐기 플로우 스루(flow through) 폐기.
  3. 컬럼에 세척 완충액 100μl를 첨가하고 최고 속도(>10,000 x g)로 30초 동안 원심분리기하여 DNA를 세척합니다.
  4. 컬럼에 200μl의 탈sulphonation buffer를 추가하여 unmethylated cytosine의 uracil로의 전환을 완료하기 위해 desulphonation을 수행합니다. 실온에서 20분 동안 그대로 두었다가 최고 속도(>10,000 x g)로 30초 동안 원심분리합니다.
  5. 컬럼에 200μl의 세척 버퍼를 첨가하여 DNA를 세척하고 30초 동안 최고 속도로 원심분리합니다. 플로우 스루(flow-through)를 폐기하고 이 세척 단계를 반복합니다.
  6. 컬럼을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 10μl 용리 완충액을 컬럼 필터에 직접 첨가하여 DNA를 용리합니다. 1분 동안 배양합니다. DNA를 용리하기 위해 최고 속도로 30초 동안 원심분리기를 사용합니다. A260.
    참고: 분광광도계로 검출된 DNA는 주로 위의 2.3단계에서 추가된 캐리어 polyA DNA를 나타냅니다. 일반적으로 polyA의 회수율은 입력의 ≥85%(>4.25μg)입니다.
  7. 디지털 PCR을 진행할 준비가 될 때까지 DNA를 -20°C에서 보관하십시오.

4. 멀티플렉스 디지털 PCR

  1. 각 시료 및 대조군에 충분한 용액으로 마스터 믹스를 만듭니다. 물을 함유한 시료 1개 이상(음성 대조군), 메틸화되지 않은 INS를 함유한 플라스미드 시료 1개(1pg, 양성 대조군), 메틸화 INS를 함유한 플라스미드 시료 1개(1pg, 양성 대조군) 및 플라스미드의 1:1 혼합물을 함유한 시료 1개를 포함합니다.
    1. PCR 마스터 믹스를 준비하기 위해, PCR 완충액의 반응당 12.5 μl(예: 10 샘플당 125 μl), 반응 프라이머/프로브 믹스당 1.25 μl(예: 10 샘플당 12.5 μl), 반응수 당 8.25 μl(예: 10 샘플당 82.5 μl), 반응 EcoR1 효소당 0.5 μl(예: 10개 샘플당 5μl).
      참고: 여기에 사용된 프라이머 및 프로브는 다음과 같습니다: 포워드 프라이머: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTAGTTTTTTTGT-3'; 리버스 프라이머: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; FAM 프로브: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; VIC 프로브: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. 96웰 플레이트에서 멀티플렉스 PCR 반응을 설정합니다. 각 웰에 마스터 믹스 19.5μl를 추가합니다. 2.5 μl의 중아황산염 변환 DNA 샘플을 각각의 적절한 웰에 추가합니다 (나머지 7.5 μl의 중아황산염 변환 DNA를 저장하거나 복제 반응에 사용). 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    알림: 행의 모든 8개의 웰에는 s가 포함되어야 합니다.amp르 또는 버퍼 제어.
  3. 우물 측면에 액체가 없을 때까지 플레이트 실러와 플레이트 스피너에서 원심분리기를 사용하여 호일 씰로 밀봉합니다.
  4. 터치스크린에서 자동 액적 생성기를 설정합니다.
    알림: 카트리지의 모든 8개 웰에는 s가 포함되어야 합니다.amp르 또는 버퍼 제어.
    1. 4.2단계에서 96웰 플레이트에서 샘플이 로드되는 행을 터치하여 사용 중인 행 수를 설정하고 행을 파란색으로 강조 표시하여 활성 행을 나타냅니다.
    2. 오염을 방지하기 위해 소모품을 뒤에서 앞으로 적재하십시오. 시작하려면 기기의 뒷줄을 따라 카트리지를 추가합니다. 기기의 중앙 줄에 팁을 로드합니다.
      알림: 카트리지는 올바른 방향으로만 홀더에 들어갈 수 있습니다.
    3. 96웰 플레이트를 기기에 놓습니다. -20 °C 냉동고에서 콜드 블록을 제거하고 새 스커트 96웰 플레이트를 놓습니다. 기기 내부에서 시료가 주입된 96웰 플레이트 옆에 놓습니다.
    4. 기기 전면에 있는 디스펜서에 오일을 추가합니다. 터치스크린에서 오일 유형을 선택합니다.
    5. 파란색 시작 버튼을 터치하여 실행을 시작합니다. 플레이트 설정을 확인하고 실행 시작 버튼을 터치하여 시작합니다.
  5. 완료되면 새로 형성된 액적이 포함된 96웰 플레이트를 제거하고 플레이트 실러를 사용하여 호일 씰로 밀봉합니다.
  6. 뒤에 오는 프로그램을 사용하여 열 cycler에 PCR10를 실행하십시오: 10:00 분 동안 95 °C; 40 주기: 00:30 분 동안 94 °C, 01:00 분 동안 57.5 °C, 10:00 분 동안 98 °C, 10 분 동안 12 °C 또는 24 시간까지.
  7. 액적 판독기에 플레이트를 놓고 판독기를 설정합니다.
    1. 설정 탭을 클릭합니다. Template > new(새로 만들기)를 클릭하여 새 템플릿을 엽니다. 파일 이름을 입력합니다.
    2. 웰 편집기를 사용하여 각 샘플에 대한 매개변수를 설정합니다. 각 샘플에 고유한 이름을 지정하고, 실험을 R-RED(R-RED)로 설정하고, 마스터 믹스를 4.1단계에서 사용된 믹스로 설정합니다.
    3. 타겟 1에 이름(즉, 메틸화되지 않음)을 부여하고 타겟 1을 알 수 없음(U)으로 설정합니다. 타겟 2에 이름(즉, 메틸화)을 지정하고 타겟 2를 참조(R)로 설정합니다.
    4. 실행 탭을 클릭하여 실행을 시작합니다. 실행 옵션 창에서 검출 화학(FAM/VIC)을 선택합니다.

5. 데이터 분석

  1. 분석 탭에서 결과를 열고 양성 대조군을 기반으로 하는 2차원 플롯을 사용하여 분석합니다(그림 1 참조).
  2. 데이터 분석을 위해 드롭릿 리더에서 생성된 CSV 파일을 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다.
  3. 혈청의 "μl당 사본"을 생성하려면 (농도*250)/(DNA 분리에 사용되는 혈청의 부피(μl)) 공식을 사용하십시오. 6
    참고: 데이터는 일반적으로 정규 분포를 보장하기 위해 인간 혈청에서 획득할 때 로그10으로 변환됩니다. 또는 데이터를 로그10 척도에 표시하고 비모수 통계량으로 분석할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

적절하게 데이터를 해석하기 위해, 우리는 각 디지털 PCR 실행의 메틸화 및 메틸화 대상 INS의 DNA 모두 플라스미드 컨트롤을 사용합니다. 이러한 컨트롤은 메틸화 및 비 메틸화 된 DNA에 대응하는 신호가 명확하게 구별되어 있는지 확인하십시오. 도 1은 바이 설 파이트 변환 메틸화 INS DNA (도 1a)를 포함하는 플라스미드 컨트롤 메틸화 INS DNA (도 1b)에 대한 물방울에 대응하는 2-D 산점도를 나타내고, 1 개의 플라스미드 (도 1C) 1 혼합물. 메틸화 INS를 포함하는 플라스미드 플라스미드는 INS가 VIC 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다 메틸화 함유하는 반면, 6 카르복시 (FAM) 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다. 1 년 : ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

DNA의 methyltransferases에 의해 시토신의 메틸화는 많은 유전자의 전사의 후생 유전 학적 제어 할 수 있습니다. 인간의 INS 유전자는 거의 독점적으로 세포 β 섬으로 표현, 그 전사 (11)의 침묵에 INS 유전자의 시토신 메틸화의 주파수 사이의 상관 관계가있을 나타납니다. 13 - 따라서, 대부분의 세포 유형은 세포를 11 β에 비해 다양한 사이토에서 INS 유전자의 메틸화가 실질적으로 높은 주파수를 나타낸다. 이는 β 세포 사멸의 빈도가 DNA 12 해방 β 세포 죽음에서 크게 발생하는 것이다 무 세포 INS 메틸화 DNA의 혈청 농도의 분석에 의해 모니터링 될 수 있다고 제안되었다.

바이 설 파이트 반응은 14 변경 메틸화 된 시토신을 떠나, 우라실에 비 메틸화 된 시토신 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 UC4 DK104166(RGM으로)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P30 DK097512의 지원을 받는 인디애나 당뇨병 연구 센터(Indiana Diabetes Research Center) 번역 핵심(Translation Core)의 도움에 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
레드 탑 Vacutainer Beckon Dickinson366441첨가제 없음, 코팅되지 않은 내부, 10ml
극저온 튜브SimportT310-3A폴리프로필렌, 나사 캡 튜브, 모든 크기의
QIAamp DNA 혈액 미니 키트Qiagen51106
Poly(A)SigmaP9403TE 버퍼(10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA)에서 5 µ g/&마이크로; 엘 
절대 에탄올 (200 proof)Fisher ScientificBP2818-500
DPBS (CaCl2 및 MgCl2 포함)SigmaD8662
0.2 ml PCR 8-strip TubesMidSciAVST
8-strip Caps, DomeMidSciAVSTC-N
EZ DNA 메틸화-라이트닝 키트ZymoD5031
프로브용 ddPCR Supermix(dUTP 없음)프로브용 Biorad1863024
버퍼 제어Biorad1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mixLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirtedEppendorf951020346
피어싱 가능한 호일 열 밀봉Biorad1814040
PX1 PCR 플레이트 씰러Biorad1814000
QX200 AutoDG 액적 디지털 PCR 시스템Biorad1864101
프로브용 자동 액적 생성 오일Biorad186-4110
자동 액적 발생기용 DG32 카트리지Biorad186-4108
자동 액적 발생기를 위한 피펫 팁Biorad186-4120
자동 액적 발생기용 피펫 팁 빈Biorad186-4125
C1000 터치 열 순환기Biorad1851197
QX200 액적 판독기Biorad186-4003
ddPCR 액적 판독기 오일Biorad186-3004

참고문헌

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

차등 메틸화 DNA디지털 PCR베타 세포 사멸비설파이트 전환전프로인슐린 DNA제1형 당뇨병절대 정량세포 유리 DNA메틸화 비메틸화
된 유의 메틸화 측정
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.