Islet β 세포 사멸은 제1형 당뇨병의 발병보다 먼저 발생하며, 이 과정을 감지하면 조기 치료 개입이 가능할 수 있습니다. 여기에서는 세포 사멸의 바이오마커로서 인간 혈청에서 차등 메틸화된 INS DNA 종을 측정하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다β.
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이 논문에서
요약
초록
섬 β 세포의 사멸은 거의 모든 형태의 당뇨병의 발병 기전의 기저에 있는 것으로 생각되며, 특히 제1형 당뇨병에서 솔직한 고혈당증의 발병에 선행하는 것으로 생각됩니다. β세포 사멸에 대한 민감하고 신뢰할 수 있는 바이오마커의 개발은 당뇨병의 발병을 예방하거나 지연시키기 위한 조기 치료 개입을 가능하게 할 수 있습니다. 최근, 우리 자신을 포함한 여러 그룹에서는 혈액 순환 중 프리프로인슐린(INS)을 인코딩하는 세포가 없고 차등적으로 메틸화된 DNA가 1형 당뇨병 전단계 당뇨병 및 새로 발병하는 1형 당뇨병의 세포 사멸β 상관관계가 있다고 보고했습니다. 여기에서는 -69bp 위치(전사 시작 부위 기준)의 시토신에서 차등 메틸화되는 cell-free INS DNA를 측정하기 위해 디지털 PCR을 사용하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 당사는 이 분석법이 -69bp 위치에서 메틸화된 시토신과 메틸화되지 않은 시토신을 구별할 수 있고, 여러 자릿수에 걸쳐 선형이며, DNA 복제 수의 절대 정량화를 제공하고, 새로 발병한 제1형 당뇨병 및 무질병 대조군을 가진 개인의 인간 혈청 샘플에 적용할 수 있음을 입증합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 순환 또는 분리된 세포 및 조직에서 차등적으로 메틸화된 사이토신의 검출이 필요한 모든 DNA 종에 적용할 수 있으며 DNA 단편의 절대 정량화를 제공할 수 있습니다.
서론
제 1 형 당뇨병 (T1D)은 자기 반응성 T 세포를 1 β 세포의 인슐린 - 생성 췌장의 파괴를 특징으로하는자가 면역 질환이다. T1D의 진단은 일반적으로 인슐린 결핍의 증거로 케톤 산증으로 야기 될 수 있습니다 린, 젊은 개인에 고혈당 (혈당> 200 밀리그램 / DL)의 측정에 따라 이루어집니다. T1D의 진단시, β 세포 기능 및 질량의 상당한 감소에 대한 증거가있다 (50 - 90 %)이. 임상 연구에서, 진단시 제정 된 여러 면역 조절 성 약물, 질병의 임상 적 관해 이어질 β 세포 기능 (그리고 아마도 질량), 그러나 아무도의 안정화 개발을위한 전화를 제기 한 연구 결과를 초래 질병의 초기 탐지와 대한 바이오 마커의 조합의 효과의 길이 추적 3,4 치료. 국제 컨소시엄의 노력, 이러한히스 (5)의 국립 연구소에서 인간의 작은 섬 연구 네트워크 컨소시엄이야, T1D의 β 세포 스트레스와 죽음에 초점 바이오 마커의 개발 필요성을 강조했다.
9 - 이러한 노력에 맞춰, 우리 그룹 등 최근 β 세포 6 죽어 주로 발생, 후 성적 변형 된 DNA 조각을 순환 측정 바이오 마커 분석을 개발했다. 지금까....
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프로토콜
윤리 선언문: 프로토콜은 인디애나 대학교 기관 검토 위원회(Indiana University Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 피험자의 부모는 서면 동의서를 제공했으며, 7세 이상의 아동은 참여에 동의했습니다.
1. 혈청 가공
참고: 설명된 분석은 다음과 같이 분리된 인간 혈청을 사용하여 엄격하게 테스트되었습니다.
- 하나의 빨간색 상의(무첨가, 코팅되지 않은) 혈액 채취 튜브에 혈액을 수집합니다.
- 혈전이 형성될 수 있도록 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.
- 2,000 x g의 원심분리기 튜브를 실온에서 10분 동안 사용합니다. 상층액(혈청)을 혈청 보관용으로 지정된 새 튜브(폴리프로필렌 나사 상단 튜브, 샘플에 따라 크기에 따라 다름)로 옮깁니다.
- DNA 분리가 준비될 때까지 -80ºC에서 샘플을 보관하십시오.
2. 혈청 DNA 추출
참고: DNA는 50μl의 혈청(권장)을 사용하는 DNA 추출 키트로 추출되며, 일부 수정이 가해진 제조업체의 프로토콜에 따릅니다.
- 마이크로 원심분리 튜브에 시료당 200μl 용해 완충액 + 1μl 폴리(A)(5μg)를 준비합니다....
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결과
적절하게 데이터를 해석하기 위해, 우리는 각 디지털 PCR 실행의 메틸화 및 메틸화 대상 INS의 DNA 모두 플라스미드 컨트롤을 사용합니다. 이러한 컨트롤은 메틸화 및 비 메틸화 된 DNA에 대응하는 신호가 명확하게 구별되어 있는지 확인하십시오. 도 1은 바이 설 파이트 변환 메틸화 INS DNA (도 1a)를 포함하는 플라스미드 컨트롤 메틸화 INS DNA (도 1b)에 대한 물방울에 대응하는 2-D 산점도를 나타내고, 1 개의 플라스미드 (도 1C) 1 혼합물. 메틸화 INS를 포함하는 플라스미드 플라스미드는 INS가 VIC 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다 메틸화 함유하는 반면, 6 카르복시 (FAM) 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다. 1 년 : .......
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토론
DNA의 methyltransferases에 의해 시토신의 메틸화는 많은 유전자의 전사의 후생 유전 학적 제어 할 수 있습니다. 인간의 INS 유전자는 거의 독점적으로 세포 β 섬으로 표현, 그 전사 (11)의 침묵에 INS 유전자의 시토신 메틸화의 주파수 사이의 상관 관계가있을 나타납니다. 13 - 따라서, 대부분의 세포 유형은 세포를 11 β에 비해 다양한 사이토에서 INS 유전자의 메틸화가 실질적으로 높은 주파수를 나타낸다. 이는 β 세포 사멸의 빈도가 DNA 12 해방 β 세포 죽음에서 크게 발생하는 것이다 무 세포 INS 메틸화 DNA의 혈청 농도의 분석에 의해 모니터링 될 수 있다고 제안되었다.
바이 설 파이트 반응은 14 변경 메틸화 된 시토신을 떠나, 우라실에 비 메틸화 된 시토신 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 UC4 DK104166(RGM으로)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P30 DK097512의 지원을 받는 인디애나 당뇨병 연구 센터(Indiana Diabetes Research Center) 번역 핵심(Translation Core)의 도움에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 레드 탑 Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | 첨가제 없음, 코팅되지 않은 내부, 10ml |
| 극저온 튜브 | Simport | T310-3A | 폴리프로필렌, 나사 캡 튜브, 모든 크기의 |
| QIAamp DNA 혈액 미니 키트 | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | TE 버퍼(10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA)에서 5 µ g/&마이크로; 엘 |
| 절대 에탄올 (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (CaCl2 및 MgCl2 포함) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA 메틸화-라이트닝 키트 | Zymo | D5031 | |
| 프로브용 ddPCR Supermix(dUTP 없음) | 프로브용 Biorad | 1863024 | |
| 버퍼 제어 | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| 피어싱 가능한 호일 열 밀봉 | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR 플레이트 씰러 | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG 액적 디지털 PCR 시스템 | Biorad | 1864101 | |
| 프로브용 자동 액적 생성 오일 | Biorad | 186-4110 | |
| 자동 액적 발생기용 DG32 카트리지 | Biorad | 186-4108 | |
| 자동 액적 발생기를 위한 피펫 팁 | Biorad | 186-4120 | |
| 자동 액적 발생기용 피펫 팁 빈 | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 터치 열 순환기 | Biorad | 1851197 | |
| QX200 액적 판독기 | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR 액적 판독기 오일 | Biorad | 186-3004 |
참고문헌
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., E....
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