높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Lucius Chiaraviglio; Yoon-Suk Kang; James E. Kirby

doi:10.3791/54841

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방법 논문

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

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DOI:

10.3791/54841

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2016년 11월 16일

Lucius Chiaraviglio¹ , Yoon-Suk Kang¹ , James E. Kirby¹

¹Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

이 논문에서

요약

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

초록

세포 내 항균 활성 및 진핵 세포의 세포 독성의 전통적인 조치는 엔드 포인트 분석에 의존하고 있습니다. 이러한 엔드 포인트 분석은 세포 용해, 집락 형성 단위 결정, 또는 시약을 추가로 판독을하기 전에 몇 가지 추가 실험 단계를 필요로한다. 예를 들어, 높은 처리량 스크리닝 분석법 중에 수천을 수행 할 때, 이러한 유형의 분석법에 필요한 하류 노력은 상당하다. 따라서, 높은 처리량 항균 검색을 용이하게하기 위해, 우리는 동시에 세포 내 세균 증식의 억제제를 식별하고, 진핵 세포의 세포 독성을 평가하기위한 실시간 분석을 개발 하였다. 특히, 실시간으로 세포 내 세균의 성장 검출은 세균 룩스 오페론 ^{(1 차} 세대 분석) 또는 형광 단백질 기자 (2 ^{차 생성,} 직교 분석) 중 하나와 세균 검사 균주를 표시하여 사용 하였다. 비 독성, 세포 막 impermeant 핵산 결합 염료또한 대 식세포의 초기 감염시 추가되었습니다. 이 염료는 가능한 세포에서 제외됩니다. 그러나, 비 - 실행 가능한 숙주 세포 엔트리 핵 DNA의 형광 표식 (디옥시리보 핵산)를 허용 막 완전성을 잃는다. 특히, DNA는 숙주 세포 사멸의 용액 기반의 판독을 제공하고, 형광 양자 수율이 크게 증가와 관련된 바인딩. 우리는 마이크로 플레이트 포맷에서 높은 처리량 스크린을 수행하고, 현미경으로 세포의 성장과 세포 독성을 평가하기 위해 결합 분석을 사용 하였다. 특히 항균제 함께 적용 둘 이상의 항균제의 결합 된 효과는 개별적으로 적용될 때보다 큰 시너지 효과를 입증 할 수있다. 다른 농도에서 항생제의 조합 순열을 평가해야하기 때문에 세포 내 병원균에 대한 시험 관내 시너지 효과를 테스트하는 것은 일반적으로 엄청난 작업입니다. 그러나, 우리는 우리의 실시간 분석이 자동화, 디지털 분배 기술 쪽과 함께 발견손쉬운 시너지 테스트 ermitted. 이러한 접근 방식을 사용하여, 우리는 체계적으로 세포 내 병원균, 레지오넬라 뉴모 필라에 혼자 항생제의 많은 수의 행동과 조합을 조사 할 수 있었다.

서론

세포 내 구획에 일시적으로 증가 또는 상주 병원균은 치료 근절하기 어렵다. 의무 또는 상대적으로 이러한 레지오넬라 뉴모 필라, Coxiella burnetii의, 브루셀라 종으로 세포 내 병원균을 의무. , Francisella의 야토 및 진균 종. 종종 달에 몇 년의 범위 일 수있다 치료를위한 항생제 치료의 과정을 연장 필요합니다. 또한, 세포 외 병원균은 일시적으로 세포 내 틈새 시장을 점유하고이 방법으로 항생제 치료의 일반적인 과정에 의해 허가를 탈출하고 나중에 악성 감염의 새로운 라운드를 시작합니다 나타날 수 있습니다. 황색 포도상 구균 ⁽¹⁾ 및 uropathogenic 장내 세균 ^2,3 감염이 점점 인식 예입니다. 따라서, 근본적으로 신약 개발 목표는 세포 내 구획 침투 신규 항생제를 확인하는 것이다. 최적의 치료는 빨리 근절하기세포 생물 및 하위 억제 항균 노출을 통해 저항의 개발을 방지 특히 바람직하다.

이를 위해 모델 병원체, 레지오넬라 뉴모의 세포 성장을 표적 세포 - 침투제 항균제를 식별하기 위해 고 처리량 스크리닝 기술을 개발했다. ⁴