높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

세포 내 구획에 일시적으로 증가 또는 상주 병원균은 치료 근절하기 어렵다. 의무 또는 상대적으로 이러한 레지오넬라 뉴모 필라, Coxiella burnetii의, 브루셀라 종으로 세포 내 병원균을 의무. , Francisella의 야토 및 진균 종. 종종 달에 몇 년의 범위 일 수있다 치료를위한 항생제 치료의 과정을 연장 필요합니다. 또한, 세포 외 병원균은 일시적으로 세포 내 틈새 시장을 점유하고이 방법으로 항생제 치료의 일반적인 과정에 의해 허가를 탈출하고 나중에 악성 감염의 새로운 라운드를 시작합니다 나타날 수 있습니다. 황색 포도상 구균 ⁽¹⁾ 및 uropathogenic 장내 세균 ^2,3 감염이 점점 인식 예입니다. 따라서, 근본적으로 신약 개발 목표는 세포 내 구획 침투 신규 항생제를 확인하는 것이다. 최적의 치료는 빨리 근절하기세포 생물 및 하위 억제 항균 노출을 통해 저항의 개발을 방지 특히 바람직하다.

이를 위해 모델 병원체, 레지오넬라 뉴모의 세포 성장을 표적 세포 - 침투제 항균제를 식별하기 위해 고 처리량 스크리닝 기술을 개발했다. ⁴ 이전 임상 관찰은 표준 항생제 감수성 검사가 정확하게이 생물에 대한 생체 내 치료 효과에 예측하지 않았 음을 나타냅니다. 이러한 β - 락탐 및 아미노 글리코 사이드와 같은 항균제의 주요 클래스, axenically 성장 레지오넬라 균에 대해 매우 효과적이지만, 충분히 레지오넬라 균이있는 세포 내 구획에 침투하지 않기 때문에 ^5는 특히이이었다. ^5,6 나중에 증거가 기술적으로 더 복잡한 세포 성장 분석을 효과적으로 임상 적 효능을 예측하는 것이 좋습니다. ⁽⁷⁾

따라서, 우리는 세포 내 세균 성장의 실시간 측정을위한 기술을 개발했다. ^6이 박테리아 염색체에 ⁴ 형광 단백질을 (이전에 기술, 1 세대 분석) 중 세균 루시퍼 라제 오페론 ^(8)의 통합을 통해 변형 된 박테리아 균주의 사용을 통해 ^구 기자 (여기 한 제 2 세대, 직교 분석 등)를 달성했다. 이러한 방식으로, 발광 또는 형광 신호 세균 수의 대용 실시간 판독을 제공한다.

그러나, 이러한 특성은 세포 내 infectio의 주요 교란 요인을 해결하지n 개의 분석, 숙주 세포에 오프 대상 효과. 구체적으로, 숙주 세포의 죽음은 본질적으로 세포의 성장을 제한하고, 항균 효과의 위양성 식별 리드. 심사 라이브러리의 많은 화합물은 진핵 세포 독성, 이러한 오탐 (false positive)이 후속, 해결을위한 엔드 포인트 세포 독성 분석의 큰 숫자를 필요로 사실 항균제를 압도 할 것입니다.

따라서, 동시에 진핵 세포 생존율 및 세포 성장을 평가 할 수 있도록 큰 관심이었다. 특히, 비 생존 진핵 세포의 특성은 세포막 무결성의 손실이다. 세포막의 투과성을 테스트 프로브 따라서 세포 생존 능력을 평가하기 위해 사용될 수있다. 우리는 이전에 액세스 사균의 핵 DNA를 염색하기 위해 추정되는 세포막 - impermeant, 형광 DNA 결합 염료의 일련의 기능을 특징으로한다. ⁴ 핵 DNA 결합에,이 염료는 quantu에서 큰 증가를 표시배경 솔루션 형광 이상 증가 신호의 결과로 m 형광 수율. 따라서, 이러한 염료는 진핵 세포 사멸의 정량적 판독을 제공 하였다. ⁽⁴⁾ 특히, 우리는 여러 가지가 J774의 대 식세포와 연장 공동 배양하는 동안 자신 무독성 것으로 나타났다. 초기 감염 기간 동안 첨가하면, 그것들은 실시간 현미경 마이크로 플레이트 형광 계에 의해 측정 또는 관찰 할 수있는 진핵 세포 사멸의 형광 판독 값을 제공 하였다.

따라서, 세균 리포터 무독성, 막 impermeant 사용을 결합하여, DNA 결합 염료, 우리는 세균 부하 동시에 진핵 세포의 세포 독성을 동시에 측정 할 수있는 단순하고 비파괴 실시간 분석을 개발할 수 있었다. 이 분석은 우리의 세포 성장을 억제 할 수있는 능력을 위해 ~을 포함하여 기능적지지 않은 활동 (250) 항균제 및> 240,000 작은 분자를 384 웰 플레이트 형식으로 화면 ~ 10,000 알려진 생체 활성제 할 수있다레지오넬라 뉴모 동시에 각 화합물 진핵 세포 독성 데이터를 생성하는 동안. 레지오넬라 균의 세포 성장에 대한 알려진 항생제 ⁽⁶⁾ 우리의 분석은 지금까지이 유형의 가장 포괄적 인 탐사했다. ⁶

병용 할 때 우리의 분석 포맷의 효율에 기초하여, 우리는 다음에 공지 된 항균제의 잠재적 상승 효과를 탐구. 가장 일반적인 시너지 테스트 중 하나, 소위 바둑판 분석은 표준 적 둘 이상의 항균제의 2 배 희석액의 조합 효과를 평가함으로써 수행된다. 두개 이상의 항 미생물제를 별도로 적용 각각의 효과의 합보다 함께 적용될 때 이러한 분석에서 ¹⁰ 시너지는 큰 효과의 관찰에 의해 정의된다. 참고로, 지금까지 만 집중과 선택적 시너지 시험은 세포 내 레지오넬라 뉴모 필라에 대해 수행되었다

시너지 테스트를 용이하게하기 위해 디지털 자동 분배 기술 ^(6)과 조합하여 실시간 세포 성장 / 진핵 세포 독성 분석에 사용했다. 이 자동화는 DMSO 또는 수용액 단독 또는 384 웰 형식의 조합에 용해 화합물의 연속 희석을 분배하는 우리를 허용. ⁽¹¹⁾ 또한, 이러한 강력한 액체 핸들링 기술은 용이하게 더 높은 해상도를 수행하라고 허가 제곱근 -의 두 (대신 표준보다 낮은 해상도, 두배) 우리 이차원 특이성 높은 수준을 달성하기 위해 희석 조합을 바둑판 시너지 분석. 이 배 희석 시리즈 ^{12을 사용하는} 경우이 해결 재현성에 대한 시너지 분야에서 문제를 해결에 특히 유용했다. 마지막으로, 우리의 분석은 정량적도 THER했다는 efore 억제의 그라데이션을 측정 하였다. 결과적으로, 분석은 성장 억제 비슷한 수준으로 조합 농도 isocontours 연결되는 isocontour isobolograms의 발현 억제 내용 전체를 캡처. ^6이 묘화 전략은 조합 적 투여 량 - 반응 곡선을 가시화시켰다. 우리의 방법론을 설명하기 위해, 우리는 이러한 분석을 수행하기위한 우리의 프로토콜을 설명하고 대표적인 결과를 보여줍니다.

1. 실시간 세포 내 성장과 진핵 세포 세포 독성 분석

1. 제조 된 숙주 세포 (J774A.1 세포)
   1. 9 %의 철 보충 혈청과 RPMI 1640에서 서스펜션 문화 J774A.1 뮤스의 musculus 대 식세포 유사 세포. 조직 배양 플라스크에 처음 통로. 세포 배지 15 ㎖에 75 ^㎠로 조직 배양 플라스크에서 컨 플루 언트하게 한 후 15 ㎖의 조직 배양 플라스크로 복귀 50 ml를 전달하는 매체의 동일한 유형, 65 ml의 긁어 희석하여 분할 250 ml의 세균 진탕 플라스크에.
   2. 250 mL 및 / 또는 조직 배양 배지와 오분의 볼륨에 가득 1,000 ml의 세균 플라스크에 현탁액 스케일 업, 문화. 분당 약 120 회전 수로 회전 수를 설정하여 통기. 일관성있는 성장을 위해, 정확히 5 % CO _2, 37 ℃에서 배양한다.
   3. 그들은 범위 농도 도달 수확 세포 2.5 × ¹⁰⁶ 세포/ 5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의. 죽은 세포 독성 분석에서 배경 노이즈가 증가하는 바와 같이, 25 %를 초과하지 않는 (쉽게 트리 판 블루 염색에 의해 분석) 죽은 세포의 비율을 확인.
   4. 흰색 접시, 조직 384 웰 마이크로 플레이트 30 μl를 조직 배양 배지에서 5 × 10 ⁴ J774A.1 세포에서 당은 물론, 문화 처리. 실험의 날에 90 %의 합류를 달성하기 위해 마이크로 밤새 품어.
2. 준비 발광 또는 형광 레지오넬라 뉴모 필라
   1. 통로 L.의 뉴모 필라 (Lp02 :: flaA :: 럭스 ⁸⁾ 해당 매체에 박테리아, 즉, 버퍼 숯불 효모 추출물 (BCYE) 매체. 티미 딘 영양 요 구성 균주를 사용하는 경우, 100 μg의 / ㎖ 티미 딘와 매체를 보완. 합류를 얻기 위해 새로운 BCYE 판에 두껍게 생물을 확산하고 (냉동 재고에서 경우) (이전 판 통로에서 경우) 하루 배양 또는 2 ~ 3 일에 의해 실험 세균의 패치를 준비성장.
      1. 10g 효모 추출물 10 g의 N 용해 BCYE 플레이트를 준비 - HPO ₄ (2- 아세트 아미도) -2- 아미노 에탄 술폰산 0.35 g의 K ₍₂₎ 및 탈 이온수 950 ml를 1 g 일 염기성 칼륨 α - 케 토글 루타 레이트. 수산화 칼륨 (11.9 몰 용액 ≥2.5 ㎖)으로 pH 6.9로 조정한다.
      2. 15g의 한천 2g 활성탄을 추가; 1 L 최종 부피에 가져다. 자기 교반 막대 및 오토 클레이브를 추가합니다. 55 ° C로 냉각 매체 및 탈 이온수에 용해 된 0.4 g의 L 시스테인 및 0.42 g의 암모늄 철 (III) 시트 레이트를 포함하는 추가 필터 살균 솔루션을 제공합니다. 페트리 접시를 주입하기 전에 혼합 자석 교반 판을 사용합니다.
      3. 무균 성장 매체에 L.의 뉴모 필라 성장의 테스트를 위해 숯을 제외하고 BCYE에 사용되는 모든 화학 시약을 결합하여 ACES-효모 추출물 국물 (AYE)를 준비하고 한천. 필터 소독 즉시 사용하거나 나중에 실험 동결.
   2. 는 sa에 재현 탁 생물적절 100 μg의 / ㎖ 티미 딘 보충되어 J774A.1 세포에 사용 나 조직 배양 배지.
3. 대 식세포 감염
   1. (박테리아 성장 억제 및 진핵 세포 용해 스크리닝 화합물 및 양성 및 음성 대조군) 관심 시험 화합물을 추가한다. 바람직하게는, 차량의 충분한 희석 있도록 DMSO (디메틸 설폭 사이드) 또는 수용액 ≥500x에 원액을 녹인다.
      1. 스톡 용액은 냉동 저장 될 수 있지만, 불안정한 화합물 항균제 동결 - 해동 사이클을 피한다.
   2. 조직 배양 배지에서 2.5 × ¹⁰⁶ CFU (집락 형성 단위) / m 및 형광 기자 표지 세균 1.0 × 10 ⁷ CFU / ㎖의 대상으로 적절한 비 독성, 막 impermeant, 핵산 산성을 추가하는 발광 박테리아를 희석 2.5 최종 분석 농도에서 염료 바인딩.
   3. 물론 각 J774A.1 문화에 혼합물의 20 μl를 추가, 최종 분석 볼륨50 μl의 최종 세균 농도 1 × ¹⁰⁶ CFU / ㎖ (럭스 오페론 기자) 4 × 10 10 ⁶ CFU / ㎖ (형광 단백질 기자).
   4. 100 % CO _2, 5 _%를 1-3 일 동안 37 ° C에서 증발 가장자리 효과를 방지하기 위해 상대 습도 부화.
4. 분석 판독
   1. 기자에 맞게 마이크로 플레이트 루미 및 형광 계에 세균의 성장 및 진핵 세포 독성을 읽어 것이 사용된다.
      1. 열 (약 10 분 또는 뚜껑 생물 안전 캐비닛 오프에서) 약 20 분 동안 열려 뚜껑 실험실 벤치에 단일 층에 배치하여 사전 발광 독서에 마이크로 평형, 온도 관련 가장자리 효과를 방지 할 수 있습니다.
   2. 나중 시점에서 실시간 판독이 필요한 경우 인큐베이터 마이크로 플레이트 반환한다.

2. 데이터 분석

1. 긍정과 부정 사기꾼에 데이터를 정규화trols는 진핵 세포에 대한 세포 내 세균의 성장과 %의 세포 독성에 대한 퍼센트 접이식 억제를 계산합니다.
2. _{P는 +를 n을} μ μ | 3 (σ _p를 + σ _n)이 / - 분석 견고성을 평가하기 = 1 'Z 분석 Z-계수 (Z)를'사용하여 박테리아 성장 억제 및 세포 독성 모두 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이의 통계적 거리를 계산 |. 이 식에서, _P는 σ 및 σ _n은 각각 양성 및 음성 대조군 웰에 대한 표준 편차이다; μ _p와 μ _N은 각각 양성 및 음성 대조군 웰에 대한 평균 값이다.
   1. 높은 처리량 스크리닝 분석법을 위해, 관심있는 시험 화합물의 효과를 평가하기 위해, Z 표준 점수 (또는 다른 대안으로서, 정량적 통계 방법)을 계산한다. 또한, 간단한 배 감소를 계산하거나 관련성이 잠재적으로 생리 학적으로 감소 배를 기록 기하학적으로 복제 세균에 대한 효과 크기의 측정.

3. 단일 및 다중 차원 (즉, 시너지) 용량 - 반응 시험 및 자료 해석

1. 프로토콜 섹션 1에 설명 된 대 식세포와 박테리아를 준비합니다.
2. 직전 감염이나 무균 배양에 (즉, 최소 억제 농도 또는 MIC) 및 낮은에 하이 엔드에 스패닝의 목표로 희석 시리즈를 두 배로, 직렬 완전히 성장을 제거하는 농도를 실험적인 관심의 항균제를 추가 명백한 활동을 보여줍니다 농도를 종료합니다.
3. 제조사의 프로토콜에 따라 항균 희석 직접 자동 추가를 통해 단일 용량 - 반응 및 조합 시너지 테스트 셋업을 용이하게하기 위해 자동화 된 액체 핸들링 시스템을 사용한다.
4. 예를 들어, 서브 배로 희석하여 사용을 고려841 / 54841eq1.jpg "/> - 희석 시리즈를 접은 분석은 데이터의 정확성과 재현성을 높이기 위해 복제합니다.
5. 대식 세포를 감염, 발광 박테리아를 조직 배양 배지에서 2.5 × ¹⁰⁶ CFU (콜로니 형성 단위) / ml로 희석 타겟팅. 물론 각 J774A.1 문화, 최종 분석 볼륨 50 μL, 최종 세균 농도 1 × ¹⁰⁶ CFU / ㎖로 혼합물의 20 μl를 추가; 100 % 상대 습도 5 %에서 37 ° C에서 CO _2를 배양한다.
   1. 무균 성장 시험을 위해, AYE 배지에서 1 × ¹⁰⁶ CFU / ㎖의 최종 농도 발광 박테리아 희석 384- 웰 플레이트의 각 웰에 50 μl를 추가 5 % CO _2에서 37 ° C에서 부화 100 % 상대 습도.
6. 박테리아의 성장을 억제하는 항균 조합 분수 억제제 농도를 지수를 계산한다. 세균 g을 완전히 또는> 99 % 억제를 초래 조합의 각 약물 (A, B,.. N) 미국rowth (FIC _{A, B를, N...)} 각 부분 억제 농도 계산을 다음과 같이 FIC _A = 화합물의 농도는 "A"의 최소 억제 농도로 나눈 값을 "A"자체. _. 그러면 FIC 조합 인덱스를 계산하거나 등 FIC _{B를 계산} 같은 수식을 사용하여 FIC는 FIC의 _A + FIC _{B 형} +를 =. . 각 저해 조합에 대한 .FIC _없음.
   1. 시너지 효과를 평가하기 위해 1.0에서 가장 멀리 벗어난 조합 인덱스를 사용합니다. 보수적 인 상승 효과의 표시 및 ≥4, 길항제의 효과로 ≤0.5의 차단을 고려하십시오. ⁽¹²⁾
   2. 플롯은 isobolograms isocontour isobolograms 및 / 또는있는 isosurface는 조합의 효과 ⁽⁶⁾ 같은 대체 그래픽 표현을 isobolograms.

마이크로 세포 성장 분석

도 1은 분석 단계도이다. 도시 자동화 단계가 수동으로 수행 될 수있다. 그러나, 처리량이 큰 액체 핸들링 시스템을 이용하여 용이하게된다.

도 2는 384- 웰 마이크로 플레이트, 듀얼 판독 실시간 세포 성장 및 (Lp02)은 중 어느 하나에 lux 오페론 (도 2A, 2B) 또는 mNeptune2 형광 단백질로 표시된 레지오넬라 균주 (하여 진핵 세포 독성 분석에서 대표적인 결과를 나타낸다 그림 2C, 2D) 기자. 양성 및 음성 대조군 화합물 (DMSO는 항생제, 사포닌)는 높은 처리량 스크리닝 환경에서 성능을 시뮬레이션하기 위해 핀 이송 로봇을 이용하여 플레이트에 첨가 하였다. 중요한 레지오넬라 (도 2A, 2C)은 각각, mNeptune2 표지 박테리아 발광 박테리아 (24) 72 시간 48 ~ 72 시간에서 사포닌 분해 및 항생제 치료 컨트롤에 비해 쉽게 구별 할 수 있습니다. 레지오넬라는 일반적으로 48 내지 72 시간 동안 복제 후, 숙주 세포를 lyses. 이것은 시간이 지남 SYTOX 그린 (a 대표 impermeant 핵산 결합 성 염료 및 숙주 세포 사멸 마커)의 형광 증가를 보여준다 1b 및도 1d에서 알 수있다. 독성 결국 세제 (사포닌)에서 관찰되는 최대 양은 숙주 세포 용해, 양성 대조군에 도달한다. mNeptune2 표지 생물 가능성이 더 빠른 숙주 세포 살해를 차지 럭스 오페론 표지 박테리아보다 4 배 더 높은 접종에 추가 및 이전 mNeptune2 실험에서 형광 신호의 증가 관련이 있었다. 효과적인 항균 처리 (레보플록사신 또는 아지 스로 마이신) 이전을 예상대로모두 세균의 성장 및 호스트 세포 용해를 ented. 역으로, 숙주 세포의 파괴를 통해 세포의 성장을 제한 세포 독성 화합물 (예를 들면, 사포닌)가 쉽게 낮은 발광 또는 형광 mNeptune2, 높은 독성과 연관된 신호의 조합에 의해 식별 될 수있다. 또한, 결합 발광 및 mNeptune2 형광 (세균의 성장) 모두에서 감소 및 세포 독성의 관찰이 화합물은 진정한 세포 성장 억제제는 것을 합리적 확신을 제공 (예를 들어, 아지 스로 마이신과 레보플록사신 긍정적 인 컨트롤) 대신에 가짜 간섭으로 인한 가양보다 세균 기자 신호.

표 1-3은 대표적인 세 가지 다른 박테리아 기자 Z '(럭셔리 오페론, mNeptune2, tdTomato)와 컨트롤에 해당하는 형광 측정 값의 상대를 보여줍니다. A ~ Z '> 0.5는 STATISTICA을 나타냅니다높은 처리량 설정에 대한 에서야 강력한 분석 적절한; 그러나, 낮은 Z '는 실험적인 목표, 즉, 신뢰성 시험 화합물 또는 교란의 다소 미묘한 효과를 구별 할 수있는 능력에 따라 적합 할 수있다. 도 2의 결과에 기초하여, mNeptune2은 박테리아 루시퍼 라제 오페론만큼 민감한 리포터 아니었다. 따라서, 예상대로 강력한 음에 mNeptune2 신호의 차이 (DMSO)과 양극 (레보플록사신, 아지 스로 마이신, 사포닌) 성장 억제제 컨트롤 대조적으로, 배양 2 일 또는 3 일까지 관찰되지 않았다 조기, 럭스의 합리적 강력한 신호 감염 후 1 일에 오페론 기자 박테리아. 반대로 tdTomato 대안 세균 형광 리포터는 감염성 과정을 통해 최적 Z '를 보였다. 차선의 형광 특성 tdTomato의 최적의 판독에 사용되는 범위에 형광 여기 및 방출 꼬리의 잠식에서 일부 결과ignal. 이 잠식은 레보플록사신 비교 대 tdTomato 사포닌에있는 긍정적 인 Z '에서 알 수있다 (박테리아 복제해서는 안 어디에 두 조건에서 세균 수에 큰 차이를 의미). 이 결과는 꼬리 tdTomato 방사로 감지하고, 따라서 사포닌 항생제 컨트롤 간의 차이 스퓨리어스 이어지는 강한 형광 신호를 일으키는 사포닌 분해에 의해 설명 될 수있다. 형광과 함께 박테리아 룩스 mNeptune2 기자 적어도 상기 수학 신호 컨벌루션없이, 듀얼 판독 용액 기반의 실시간 분석은 tdTomato 형광 조합 가능한 표시하면서 따라서하지 않는다.

도 3은 이전에 lux 오페론 리포터 표지 된 유기체를 이용하여 공지 된 항생제의 투여 량 - 반응 곡선의 예를 게시 나타낸다. (6) 특히, 레지오넬라는 않습니다조직 배양 배지에서 성장하지. 따라서, 대식 세포 감염 분석에서 박테리아의 복제는 전적으로 세포 성장을 나타냅니다. (- (2- 아세트 아미도) -2- 아미노 에탄 산 N) 효모 추출물 매체 그러나, 레지오넬라는 액체 ACES는, 전문, 저 나트륨에 axenically 성장할 것입니다. 세포 내 및 무균 성장에 여기에 (20) 효과를 비교 하였다. 두 성장 시스템을 사용하여, 우리는 β-락탐 (메로페, 세프 트리 악손) 및 아미노 글리코 사이드 (미도 데이터) 등의 극성 항생제는 세포 성장 불량한 억제제 무균 성장에 미치는 잠재적 효과에 대조적으로되어 있음을 관찰 할 수 있었다. 아마도 대식 세포 감염 분석에서 가난한 효능은 세포 내 레지오넬라 복제 성 틈새에 액세스 할 수 없음을 기반으로합니다. 반면, 같은 퀴놀론 (레보플록사신)과 아지 스로 마이신과 같은 진핵 세포 침투 항생제는 모두 세포 내 및 무균 세균에 강력한 효과를 보여 주었다.

(50) 및 측정 할 수 CC (50) (50 % 진핵 세포 사멸을 유도하는 농도) 및 선택성 CC 50 / IC (50), 계산 (농도 50 %의 세균의 성장 억제 용). 세 가지 조치 신약 개발 노력에 화합물의 진행에 중요한 기준이다. 도 4는 항생제 독시사이클린에 응답 이러한 이중 용량 - 반응 곡선의 예를 나타내고, 시간의 경과와 동일한 스크리닝 웰에서 얻은 정보. 도 4a에서, 감염 1 일째에 약 수백 배의 박테리아 복제 항생제 관찰 억제 최고 수준에 비해 제로 항균 시험 웰에 분명하다. 매우 높은 doxycy 제외하고 최소한의 관련 진핵 세포 독성이 있었다클라인 농도 (≥10 μg의 / ㎖). 2 일 (그림 4B)에서 세균 럭셔리 신호가 약 낮은 항생제 농도에서 관찰 중요한 박테리아 복제 관련 세포 독성에 하루 1보다 10 배이었다. 예상 한 바와 같이, 박테리아 복제 유발 숙주 세포 사멸 항균 용량 - 반응 곡선에 걸쳐 세균 번호 (LUX 신호)와 긴밀하게 추적한다. 높은 항균제 농도에서 세포 독성이 형광 기반 세포 독성 측정에 비하여 약간 높은 항생제 농도를 향해 발광 용량 - 반응의 겉보기 시프트가 다소 과장 1 일째에 관찰 독시사이클린 다시 독성이 나타나는 매우 높은 농도까지 기준선으로 감소 로그 및 리니어 스케일에 발광 및 세포 독성을 플롯 할 때 각각 그림과 같이. CC (50)는 약 10 μg의 / ㎖ 동안 박테리아 성장을위한 IC (50)는 약 100 ng를 / ㎖이었다 (50)과 일치는 백혈구 혈통의 독시 싸이클린 처리, HL-60 세포주에 대해 이전에 설명했다. (21) 따라서,이 듀얼 판독 실험 결정 전체 선택성은 약 100이었다.

그림 5는 이전에 항생제의 페어 조합이 세포 내 L.의 뉴모 필라에 대한 강화 효과에 대해 시험 된 두 차원의 시너지 시험과 관련된 isocontour isobolograms을 발표 보여줍니다. 도 6은 비록 표준 isobolograms 완전히 isocontours를 이용하여 억제의 유사한 수준의 점을 연결 가능한 정량 억제 데이터에 기초하여, 우리는 선택한 성장을 억제하는 항생 물질의 농도는 낮은 조합을 연결한다. 이 다이어그램의 오른쪽 가장 isocontour는 표준 isobologram 라인에 해당한다. 오목 isobolograms는 일반적으로 시너지 효과를 나타냅니다 볼록 isobolograms generall 동안Y는 무관심하거나 적대감을 나타냅니다. 시너지 (패널 AC) 무관심의 예는 각각 <0.5 ≥1의 FIC 인덱스 값에 대응하는,이 경우 (DF) 나타낸다. 6

참고로, 아지 스로 마이신, 미노사이클린 및 리팜피신의 페어의 조합은 시너지 효과를 보여 주었다. 도 6에 도시 된 바와 같이 6 따라서, 이들 제제는 삼방 조합 함께 시험 하였다. 여기서, 표면은 세균 세포 성장을> 99 % 억제되었다 세 미생물제의 최저 농도를 조합 연결 그려졌다. 관찰 된 오목한 모양의 표면은, 그 자체로 입체 시너지 효과의 암시, 상당한 시너지 효과를 나타내는 낮은 FIC 지수 (0.325)에 맞습니다.

표 1 : Z '럭셔리 오페론-보고서어, 양성 및 음성 대조군의 레지오넬라 infection- 비교. Z '는도 2a, 2b에 도시 된 데이터 요소에 대응한다. 이 표는 치아라 비글 리오와 커비 2014 년 4 긍정적 인 발광 Z '> 0.25에서 수정 된 검정색 배경에 노란색 문자로 강조 표시됩니다.

표 2 : mNeptune2 - 기자, 레지오넬라 감염 Z '- 양성 및 음성 대조군의 비교. Z '는도 2c, 2d에 도시 된 데이터 요소에 대응한다. 긍정적 인 mNeptune2 형광 Z '> 0.25 빨간색 문자로 강조 표시됩니다.

표 3 : Z 'tdTomat에 대한오 - 기자, 레지오넬라 감염 - 양성 및 음성 대조군의 비교. 긍정적 인 tdTomato 형광 Z '> 0.25 빨간색 문자로 강조 표시됩니다. SYTOX 녹색과 tdTomato 방출의 중복과 관련된 거짓 긍정적 인 Z '> 0.25는 녹색 문자로 강조 표시됩니다.

그림 1 : 듀얼 기자 분석 설정의 화보 표현입니다. 384 잘 접시에 정지 성장 J774A.1 세포의 (A) Replating. 마이크로 관심 화합물 (B) 추가. (C)의 동시 감염 핵산 결합 성 염료의 첨가; 잠복; 및 판독. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 URE.

도 2 : 듀얼 고 스루풋 포맷의 세포 내 박테리아의 성장 및 진핵 세포 독성 실시간 판독. LUX 오페론 발현 레지오넬라 뉴모와 J774A.1 세포의 세포 내 감염 동안에 발광 (A) 및 형광 (B)의 신호에 대응. 레지오넬라 뉴모을 mNeptune2가 발현와 J774A.1 세포의 세포 감염시 형광 단백질 (C) 및 형광 (D) 신호에 대응. 네 치료가 표시됩니다 부정적인 DMSO 제어 ( ); 양성 세포 독성 제어, 사포닌 ( ); 양성 박테리아 성장 억제 제어, 아지트로 마이신 (기 4 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) 및 레보플록사신 ( ). 데이터 포인트 중복, 384 웰 플레이트에서 수행 96 회 반복의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 참고 일부 데이터 포인트의 표준 편차 오차 막대는 최소한 따라서 데이터 포인트 기호 숨겨져 있었다. 패널 A와 B는 치아라 비글 리오와 커비 2014 년 4에서 수정 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3 일차원, 용량 - 반응 분석의 대표적인 예. J774A.1 세포는 표시된 항균제의 2 배 희석액 시리즈 LUX 오페론 발현, L. 뉴모 감염시켜 처리 (라'세포')로이라고 표기. 병행 럭스 오페론 발현은 레지오넬라 에이스 효모 추출물 배지 (AYE)에서 동일한 최종 농도로 희석시키고 ( '무균'로 표시) 동일한 두 배 희석 계열로 처리 하였다. 발광 이틀 후 세균 접종을 읽고 항균 농도에 대해 그려졌다. 패널 A는 항 미생물제는 일반적으로 레지오넬라 감염을 치료하는 데 포함한다. 패널 B는 서로 다른 마크로 라이드 항생제의 활동을 비교합니다. 패널 C는 다양한 때로는 세포 내 및 무균 힘을 대조와 항생제의 여러 클래스가 포함되어 있습니다. 데이터 포인트는 평균과 상태에 따라 세 가지 별도의 테스트 우물의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 치아라 비글 리오와 커비 2015 년 6에서 수정 된 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.

도 4 : IC 50, CC (50) 및 선택성을 결정하기위한 듀얼 판독, 용량 - 반응 실험 예. 세포의 성장과 J774A.1 세포 독성에 독시 싸이클린의 효과는 일 1, 2 포스트 감염에 측정 하였다. 데이터 포인트는 평균과 상태에 따라 세 가지 별도의 테스트 우물의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 :이 차원의 시너지 효과 분석의 예. 조합 직렬 DIL항생제의 쌍 용액 사용은 J774A.1의 대 식세포에서 레지오넬라 균의 세포 성장에 대한 시너지 효과에 대해 시험 하였다. Isocontours 라인은 비슷 %의 억제의 점을 연결합니다. 가장 오른쪽 isobologram 완전한 세포 성장 억제 (> 비 처리 대조군에 비해 99 %의 발광 감소)과의 조합을 연결하여 표준 isobologram 플롯에 대응한다. 각 그래프의 색상 코딩 키에 의해 묘사로 음영 %의 억제를 나타냅니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 Isocontours는 해당 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 미처리 컨트롤 20, 10, 5, 1 % 성장 상대. 이 그림은 치아라 비글 리오와 커비 2015 년 6에서 수정 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

입체 시너지 분석의 예. > 99 %의 성장 억제의 결과로 마이신, 리팜피신 및 미노사이클린의 최저 농도는 조합 isobologram 표면 플롯을 형성 할 하였다. 이 그림은 치아라 비글 리오와 커비 2015 년 6에서 수정 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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