파인 우드 선충의 관측 및 짝짓기 행동의 정량화, 소나무 재선충

Summary

소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동을 조사하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. B. xylophilus의 행동 특징은 짝짓기 과정에 설명되어 있습니다.

Abstract

관찰과 소나무 선충, Bursaphelenchus의 xylophilus의 짝짓기 행동을 정량화하기위한 방법은, 실체 현미경 아래 설립되었다. B. Xylophilus의 결합 효율을 향상시키고 상대 관찰 가능성을 증가시키는, 버진 성인 배양하고, 조사에 사용. 계란은 물에 선충을 유지하고, 여성은 10 분 동안 알을 낳기 수 있도록함으로써 얻을 수 있었다. 2 단째 유생 (J2)는 어둠에서 25 ° C에서 24 시간 동안 난자를 배양하여 동기화하고, 초기 J4 또 다른 52 시간 동안, 잿빛 곰팡이, 보 트리 티스 시네 레아와 J2를 배양함으로써 얻어졌다. 이 시점에서, 가장 J4 선충은 생식기 형태를 사용하여 남성 또는 여성 인 것으로 명확히 구별 될 수있다. 남성과 여성의 J4 수집하고 처녀 성인 선충을받을 24 시간 동안 두 개의 서로 다른 배양 접시에서 분리 배양 하였다. 처녀 남성과 처녀 여성은 와트의 드롭 쌍 하였다오목 슬라이드의 잘 어. 정합 동작은 실체 현미경 비디오 레코더로 촬영했다. 결합 프로세스의 전체 시간은 82.8 ± 3.91 분 (± SE 평균)이고 4 개의 단계로 나눌 수있다 : 검색, 접촉 교미 및 느린. 구간의 평균 분은 각각 21.8 ± 2.0, 28.0 ± 1.9, 25.8 ± 0.7 및 7.2 ± 0.5이었다. 일레븐 서브 행동을 설명했다 :, 순항 접근, 발생, 반원형 누수 방지 공법, 터치, 위치, 부착, 사정을, 정지를 분리하고, 로밍. 한 여성이 3 명의 남성 3 명의 여성과 한 남성과 함께 그룹화 할 때 흥미롭게도, 분명 내 성적 경쟁이 관찰되었다. 이 프로토콜의 B. xylophilus의 결합 거동을 조사에서뿐만 아니라 다른 선충 ethological 연구를위한 기준으로서 작용에서뿐만 아니라, 유용하고 귀중하다.

Introduction

소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle은 가장 파괴적인 침입종 중 하나로, 소나무를 시들게 하고 결국 죽게 만듭니다. 이 병원성 선충은 미국이 원산지인 것으로 여겨지지만 중국, 일본, 한국, 포르투갈 등 여러 국가로 옮겨졌습니다. 최근에는 스페인에서도 보고되어 수백만 그루의 소나무를 죽이고 막대한 경제적 손실을 입었으며 산림 생산과 생태 안정성을 위협하고 있습니다^1-5.

숙주 소나무가 소나무 선충에 감염되면 수억 마리의 자손이 줄기 내에서 빠르게 번식합니다. 이것은 물관부 기능 장애를 일으켜 시들게 하고 결국 숙주 나무⁶의 죽음을 초래한다. 그러나 현재로서는 이 질병을 통제할 수 있는 효율적인 방법이 없습니다. 짝짓기 행동은 이 선충⁷의 높은 번식력에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 따라서 우리는 실험실에서 B. xylophilus의 짝짓기 행동을 조사하여 짝짓기를 방해하고 번식력을 감소시키는 효과적인 방법을 찾기 위해 노력했습니다.

이 프로토콜은 B. xylophilus의 처녀 성체를 얻는 방법과 비디오 레코더와 실체 현미경을 사용하여 짝짓기 행동을 관찰하고 분석하는 방법에 대한 자세한 방법을 소개하기 위한 것입니다. 이 프로토콜은 다른 선충의 행동 연구를 위한 참고 자료로도 사용할 수 있습니다.

Protocol

버진 성인 선충 1. 취득

1. 파인 우드 선충의 분리 및 배양 조건
   B를 xylophilus Nxy61 원래 중국 절강 성 닝보 지역에서 병에 걸린 Pinus의 massoniana에서 추출 분리 : 주.
   1. (PDA 재료의 표 참조) 감자 포도당 한천을 준비 보 트리 티스 시네 레아를 성장 판.
   2. 접종 들어 B. 시네 메트에서 10mm의 직경을 갖는 매트 진균의 조각을 펀칭하고 새로운 PDA 플레이트의 중간에 넣어. 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 5 D에 대한 B. 시네.
   3. 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 B. 시네을 포함하는 준비된 배양 접시에있는 파인 우드 선충.
2. B. xylophilus 계란의 취득
   1. 깔때기 아래에 고정 고무 튜브를 놓고 조립하는 랙에 제조 된 깔때기를 개최Baermann 깔때기 장치. 깔때기의 입에 종이 필터 대신 거즈 두 레이어를 놓습니다.
   2. 유입 경로 설정에 곰팡이 문화를 전송하고 곰팡이 매트가 침지 될 때까지 물을 추가합니다. 2 시간을 기다린 선충은 곰팡이 문화에서 나올 여과지를 통과하고 Baermann 깔때기의 가장 낮은 부분에 정착 것입니다.
   3. 15 ML의 튜브에 튜브의 바닥에서 물 방울의 첫 번째 부부를 수집하고 천천히 튜브 클램프를 풀어 선충를 수집합니다.
   4. 실온에서 2 분 동안 3,000 XG에서 위의 컬렉션을 원심 분리기.
   5. 피펫 물의 상층을 제거하고 멸균 이중 증류 (DD)의 1 mL의 H ₂ O와 함께 재현 탁
   6. 피펫으로, 새로운 유리 페트리 접시 (6cm 직경)에 위의 부유를 전송합니다. 선충 자유롭게 수영을 할 수 있는지 확인하기 위해 페트리 접시에 무균 DD의 H ₂ O 3 ML을 추가합니다.
   7. 한 유리의 선충을 유지어둠 속에서 25 ° C에서 10 분 동안 배양 접시에요. 계란은 임신 한 여성에 의해 배치됩니다. 때문에 당 단백질 표면의, 계란 유리 페트리 접시의 바닥에 충실 할 것이다.
   8. 계란을 방해하지 않고, 조심스럽게 물과 벌레를 제거합니다. 건조에서 계란을 방지하기 위해 즉시 유리 페트리 접시에 무균 DD의 H ₂ O 3 ML을 추가합니다.
   9. 단계를 반복 1.2.8 배는 모든 애벌레와 어른을 제거하고 순수한 계란을 얻었다. 페트리 접시에 무균 DD의 H ₂ O의 추가 2 ㎖ (총 5 ㎖)를 추가합니다.
3. 네 번째 단계 청소년의 취득 (J4 유충)
   1. 해치 25 ℃에서 어둠 속에서 24 시간 동안 수집 된 계란 J2 유충을 얻었다.
   2. 2 분 동안 3,000 XG에 15 ML의 튜브, 원심 분리기에 피펫으로 J2 유충을 전송, 물 상층을 제거합니다.
   3. 멸균 DD의 H ₂ O의 200 μL와 J2 유충을 재현 탁하고로 전송B. 시네을 포함하는 PDA 판.
   4. 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 52 시간의 J2 애벌레. 이 시점에서, 대부분의 유충 J2 J4 유충의 초기에 개발 된 것이다.
4. 처녀 성인 선충의 취득
   1. 알코올 버너 동안 가열 한 후 유리 모세관을 그려 선충을 따기위한 바늘을 준비합니다.
      주 :이 모세관 바늘의 팁은 일반적으로는 단일 선충류를 픽업하기위한 도구로서 이용 될 수 있도록, 직경 50㎛의 성인 선충 대략 차체 폭 할 필요가있다.
   2. Baermann 깔때기를 조립하고 단계 1.2.1에 기술 된 바와 같이, 2 시간 동안 곰팡이 문화 선충을 추출 - 1.2.3.
   3. 깨끗한 페트리 접시에 물을 J4을 전송합니다.
   4. 실체 현미경 하에서 선충을 관찰하고 마미야와 기요하라 ⁽⁸⁾ (그림 1에서 설명 된 바와 같이, 성기 형태로 남성과 여성을 구분 ). 제조 된 모세관 바늘로 원하는 섹스의 선충을 선택하고 남성 또는 여성에 대한 적절한 진균 배양 접시에 전송합니다.
      주 : 남성보다 여성이 60에서 여성의 비율에있다 - 70 %. 여성 외음부는 남성 spicule에서 분명히 다르다. 성인에 비해 초기 단계 J4에서 spicule 또는 외음부는 작지만 여전히 쉽게 볼과 구별 될 수있다. 선충은 항상 때로는 남성과 여성을 구별에 어려움을 증가 물에서 움직이고있다.
   5. 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 또 다른 24 시간의 J4 애벌레.
      참고 : 모든 선충은 성인으로 발전해야하지만, 그들이 결합 해제하기 때문에, 그들은 처녀 성인으로 간주됩니다.
   6. Baermann 유입 경로 둘을 조립하고 단계 1.2.1에 기술 된 바와 같이, 2 시간 동안 곰팡이 문화 처녀 성인을 추출 - 1.2.3, 그리고 두 개의 분리 된 깨끗한 페트리 접시에 처녀 성인 남성과 여성을 전송합니다.

2. 관측 및 짝짓기 행동의 비디오 녹화

1. 여러 오목 슬라이드를 준비하고 자신의 우물 각 멸균 DD의 H ₂ O의 200 μL를 추가합니다.
2. 모세관 바늘로 준비된 처녀 성인 남성 또는과 여성을 선택하고 각 오목 슬라이드의 물에 하나의 선충을 넣어.
3. 그들이 새로운 수성 환경에 적응할 수 있도록 1 시간 동안 잘 내부의 처녀 성인을 유지합니다.
4. 피펫을 사용하여 다른 잘 하나에서 둘 중 하나를 전송하여 처녀 남성과 여성의 쌍.
5. 실체 현미경 아래 오목 슬라이드에 1♀ + 1♂ 조합의 짝짓기 행동을 관찰한다.
6. 버진 성인의 결합 효율을 분석하기 위해, 그 결합 성공률 (R)을 계산하고, 무작위로 선택된 성인 쌍의 것과 비교한다. 교미가 공부 복제의 총 개수에 비해 관찰 된 복제의 백분율 R을 계산한다.
7. 결합 선택과 intrasexual 경쟁, 그룹을 조사하고 두 개의 서로 다른 조합으로 처녀 선충을 준수합니다 : 1♀ + 3♂과 + 1♂ 3♀합니다.
8. 정량적 분석을위한 데이터를 수집하기 위해, 비디오 현미경을 사용하여 결합 동작을 촬영. 일반적으로, 그들이 교미 후 멀리 이동할 때 선충이 모멘트에 오목 슬라이드의 웰에 배치 된 시점으로부터 전체 정합 프로세스는 2 시간 이내에 완료된다. 따라서 하나의 복제에 적어도 2 시간 동안 연속하여 정합 처리를 기록한다. 최소 30 전체는 각 조합의 총에 복제합니다.
   주 : 기록 과정에서 증발을 보상 할뿐만 더 무균 DD의 H마다 0.5 H ₂ O (통상 50 μL)을 추가한다.

3. 데이터 수집

1. 컴퓨터 화면에 신중하게 모든 동영상을보고 성적 하위 행동 특성.
2. 결합하여 일의 기간을 측정비디오 레코더의 전자 프레임 별 기능. 수동 종단점으로부터 시작 시간을 뺀다.
3. 1♀ + 1♂ 조합은 각 녹화를 분석하여 다음과 같은 이벤트의 지속 시간을 측정한다 :
   1. 검색하는 시간을 측정 (즉, 암수가 그들이 발생하는 모멘트에 오목 슬라이드의 웰에 넣고 서로 접촉 할 때까지의 시간).
   2. 접촉의 지속 시간을 측정한다 (즉, 수형 정확하게 제 교미 위해 여성의 외음부에 위치하는 순간에 제 접촉까지의 시간).
   3. 교미의 지속 시간을 측정 (즉, 자신이 사정 한 후 아래로 여성의 몸에서 슬라이드까지 남성이 정확하게 여성의 외음부에 위치 할 때까지의 시간). 참고 : 일부 선충은 2 시간에 여러 번 교접 할 수 있습니다. 이러한 경우, 라스의 끝에서 제 교미 교미 기간을 측정사이의 시간을 포함하여 t 하나.
   4. 여운의 지속 시간을 측정한다 (즉, 교미 후 기간 암수 수영 서로 떨어져 그리고 더 선충의 몸 길이 이하의 간격으로 분리 될 때까지 (통상 1 ㎜)).
4. 교미 주파수와 모든 교미 기간과 다른 조합의 각각에 대해 2 시간에있는 모든 교미의 평균 시간을 계산합니다 (즉, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ 및 1♀ + 3♂).
5. 즉시 끊김없이 수행되는 첫 접촉 후 짝짓기 성공률로 상이한 조합에 대해 먼저 접촉 (P)에 대한 상대 성공율을 계산한다. 접촉 단계에서는 여러 연락처는 실제 교미하기 전에 관찰 될 수 있습니다.
   1. 두 개인 사이의 거리는 상기 본체의 길이 이상이면 이상으로 하나의 접촉을 고려한다. 하나의 복제, 기록 P 100 %의 교미의 난에 대한의는 휴식없이 첫 접촉 후 즉시 관찰, 또는 0.00 % 더 교미가 관찰되지 않은 경우 또는 교미하지만 두 개 이상의 접점 후이 있다면.
      참고 : 여기에 설명 된 각 조합에 대한 30 복제가 있었다.

Results

처녀 성인의 짝짓기 성공률 (R)가 무작위로 선택된 성인에 비해 유의하게 높았다하는 평균 86.67 %이었다 : 13.33 ± 4.65 % (F = 1301.71, DF = 1, P = 0.0001) (그림 2). 이 발견은 B의 xylophilus 무작위로 선택된 성인보다 처녀 성인 짝짓기 행동을 관찰하기 쉽다는 것을 의미한다.

한 남성이 여성 하나와 결합되었을 때 전체 정합 프로세스는 평균 82.8 분 동안 지속되었다. 전체 프로세스는 네 가지 단계로 설명 될 수있다 : 검색 접촉 교미 및 느린. 이 네 단계의 기간은 21.8 ± 2.0 분, 28.0 ± 1.9 분, 25.8 ± 0.7 분, 7.2 ± 0.5 분, 각각 (그림 3)이었다. 최근 게시...

Discussion

행동 테스트는 화학 생태학, 신경 생물학, 분자 생물학, 유전학의 기본적인 부분입니다. 선충, 특히 C. 엘레은 광범위하게이 분야에서 연구에 사용됩니다. 선충의 짝짓기 행동은 이전에 ^10-11을 조사하고있다. 그러나, B.의 xylophilus는 자웅 이체와 자웅 동체 C. elegans의 다른이며, 그 결합 과정은 다른 행동 기능 ^9있다. 최근 Bursaphelenchus의 okinawaensis, B.의 xylophilus의 자웅 동체 자매 종의 짝짓기 행동은 ^{12을보고되었다.} 다른 실험 방법을 사용하고 있지만,이 자웅 동체 종, B.의 xylophilus 유사한 섹스 매력을 보여 주었다 그들 사이의 상호 종 매력이 관찰되었다. 이 자웅 동체 자매 종의 Bursaphelenchus의 생물학에 대한 추가 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus isolate Nxy61			닝보 지역의 Pinus massoniana에서 추출
회색 곰팡이 균주			중국 임업 아카데미에서 획득
Baermann 깔때기	Sengong
원심 분리기	Sengong
피펫	Sengong
멸균 dd 2O			121°°에서 고압의 증기로 멸균; C 30분 동안
페트리 접시	Sengong
PDA 매체	Huankai Bio.	021050
인큐베이터	Sengong
층류	Sengong
유리 모세관	Sengong
입체 경	라이카	LED5000 RL
도립 입체 현미경	Zeiss	A1
오목 슬라이드	Sengong