Method Article

의 Cefoperazone 처리 된 마우스 모델 임상 관련 클로스 트리 디움 디피 스트레인 R20291

DOI:

10.3791/54850

⸱

December 10th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

In This Article

Summary

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이 프로토콜은 임상 적으로 관련 및 유전자 다루기 쉬운 변형, R20291를 사용 클로스 트리 디움 디피 감염 (CDI)의 cefoperazone 마우스 모델을 설명합니다. 임상 질병 모니터링, C. 디피 세균 열거, 독소의 세포 독성 및 마우스 모델에서 CDI에 걸쳐 조직 병리학 적 변화에 대한 강조는 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

Abstract

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클로스트리듐 디피실은 혐기성, 그람 양성, 포자 형성 장 병원체로 이환율 및 사망률 증가와 관련이 있어 결과적으로 공중 보건에 긴급한 위협이 되고 있습니다. 항생제의 성공적인 치료 후 C. 디피실 감염(CDI)의 재발률이 높으며 환자의 20-30%에서 발생하므로 이 병원체에 대한 새로운 치료법의 발견이 필요합니다. 현재의 CDI 동물 모델은 높은 폐사율을 초래하므로 CDI를 가진 인간에서 볼 수 있는 만성적이고 잠복적인 질병 징후와 유사하지 않습니다. C. difficile에 대한 치료제를 평가하기 위해서는 임상적으로 관련된 균주를 활용하여 인간 질병에 근접한 마우스 모델이 필요합니다. 이 프로토콜은 임상적으로 관련성이 있고 유전적으로 다루기 쉬운 균주 R20291을 사용하여 CDI의 cefoperazone 마우스 모델을 간략하게 설명합니다. 마우스 모델에서 CDI 전반에 걸친 임상 질병 모니터링, C. difficile 박테리아 계수, 독소 세포 독성 및 조직병리학적 변화에 대한 기술이 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. CDI의 다른 마우스 모델과 비교했을 때, 이 모델은 투여된 용량에서 균일하게 치명적이지 않기 때문에 인간 질병에 따른 장기간의 감염 임상 경과를 관찰할 수 있습니다. 따라서 CDI의 이 cefoperazone 마우스 모델은 임상 질병의 개선 및 C. difficile에 대한 집락화 저항성 회복에 대한 새로운 치료법의 효과를 평가하기 위한 귀중한 실험 플랫폼임을 입증합니다.

Introduction

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클로스 트리 디움 디피는 생명을 위협하는 설사 일이 발생 혐기성, 그람 양성, 포자 형성 간균이다. C. 디피 감염 (CDI)는 올해 1 ~ 4 당 의료 비용 이상의 $ 4.8 억 증가 인간의 이환율과 사망률 및 결과와 연결되어 있습니다. 2013 년 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 공중 보건 1 긴급한 위협을 나타내는, 긴급 항생제 내성의 위험으로 C. 디피을 분류. 현재 항생제 반코마이신 치료 및 메트로니다졸은 CDI 5에 대한 치료의 표준으로 간주됩니다. 환자 2,5-7의 30 % - 불행하게도, 항생제 성공적인 치료 후 CDI의 재발은 20에서 발생하는 높은입니다. 따라서,이 장내 병원균에 대한 새로운 치료제의 발견이 필요하다. C. 디피 교류에서 인간의 질병에 근접 동물 모델에 대한 치료제를 평가하려면linically 관련 변형이 필요하다.

처음 코흐의 공리는 클린다마이신 처리 시리아 햄스터 모델 (8)을 사용하여 1977 년 C. 디피 위해 설립되었다. 이 모델은 아직 병인 9, 10에 C. 디피 독소의<....

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Protocol

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윤리 정책 :
동물 용 의약품의 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (NCSU)이 연구를 승인했다. NCSU 동물 관리 및 정책 NCSU에서 1985 년 실험 동물 시설의 동물 복지법 및 건강 연구 연장 법에 명시된 기준과 지침 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 명시된 가이드 라인을 준수를 적용합니다. 동물의 건강 상태를 매일 평가하고, 죽어가는 동물을 인도적으로 차를 측정 한 다음 CO 2 질식에 의해 안락사시켰다. 훈련 된 동물 기술자 또는 수의사는이 연구 중에 AAALAC 인증을받은 시설에서 축산을 수행 하였다.

마시는 물에 항생제 Cefoperazone 1. 관리는 C. 디피 식민과 질병에 감수성을 달성하기 위해

참고 : 5 ~ 8 주령 C57BL / 6 WT 마우스 (여성과 남성)이전에 항생제 물 관리를 시작하기 구입 1 주일 동안 격리되었다. 검역 후, 마우스 오토 클레이브 음식, 침구, 물을 보관 하였다. 케이지의 변화는 층류 후드에 실험실 직원이 매주 실시 하였다.

  1. 칠일 전에 도전의 대상 일 (그림 1)에 멸균 증류수에 cefoperazon....

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Results

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대표 연구 기간 동안, 5 주령 C57BL / 6 WT 마우스는 5 일 자신의 식수 (0.5 ㎎ / ㎖)에 cefoperazone으로 전처리 및 2 박 정기적으로 마시는 물로 씻어시켰다. 마우스는 하루 0 (그림 1A)에 구강 투여를 통해 C. 디피 R20291 10 5 포자에 도전했다. 마우스는 14 일 동안 CDI의 체중 감소와 임상 증상 (혼수, 식욕 부진, 설사, 및 구부리고 자세)에 대해 모니터링 하였다. C. 디피 R20291 포자와 C57BL / 6 WT 마우스의 도전은 24 시간과 48 시간 포스트의 반칙으로 (그림 1B) 내에서 상당한 체중 감소에서 설사 발생했습니다. 이 실험에서 관찰되지 않았지만, C. 디피 R20291의 높은 복용량 도전 마우스는 심각하게 병이 될 수 있습니다 또는 48으로 20 % 이상 체중 감량이 - .......

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Discussion

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이 프로토콜은 C. difficile R20291 포자로 도전된 항생제 치료 마우스의 체중 감소, 박테리아 집락화, 독소 세포 독성 및 위장관의 조직병리학적 변화를 포함한 임상 과정을 특성화합니다. 프로토콜에는 세부 사항에 대한 주의가 필수적인 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. C. difficile 포자 접종물의 정확한 계산이 중요합니다. 이 계산은 원래의 C. difficile 포자 스톡 열거를 기반으로 하며, 이 프로토콜을 시작하기 전에 여러 포자 열거에 걸쳐 일관되어야 합니다. 접종 계산이 잘못되면 마우스의 접종 용량이 부정확해집니다. 같은 맥락에서, 이러한 계산에 기초한 C. difficile 포자의 준비 및 희석은 주의해서 준비해야 합니다. 희석 오류가 있으면 부정확한 시작 포자 접종물이 발생합니다. 마지막으로, 항생제 치료를 받은 대조군 마우스( C. difficile 포자를 접종하지 않음)의 오염을 방지하기 위해 예방 조치를 취해야 합.......

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Disclosures

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저자는 현재 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 C. difficile R20291 포자에 대해 Wellcome Trust Sanger Institute의 Trevor Lawley와 이 원고에 사용된 Vero 세포에 대해 North Carolina State University College of Veterinary Medicine의 James S. Guy에게 감사를 표합니다. 동물 조직병리학은 트레이시 랄리(Traci Raley)와 아만다 브라운(Amanda Brown)의 특별한 도움을 받아 노스캐롤라이나 대학교 채플힐(University of North Carolina at Chapel Hill)의 LCCC 동물 조직병리학 핵심 시설(LCCC Animal Histopathology Core Facility)에서 수행되었습니다. LCCC Animal Histopathology Core는 UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center에 대한 NCI Center Core Support Grant(2P30CA016086-40)의 일부 지원을 받습니다. 또한 Vero 세포 독성 분석 프로토콜에 대한 유용한 토론을 해주신 Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie 및 Cassie Schumacher에게도 감사드립니다. JAW는 NIH가 T32OD011130한 ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#62 Perisept 포자 소독 클리너 SSS Navigator48027이 제품은 제조사가 권장하는 대로 희석이 필요할 것입니다
0.22 μ m 필터Fisherbrand09-720-3Vero Cell Assay에서 테스트한 개별 샘플용 필터 플레이트의 대안
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-05637°C에서 수조에서 가열해야 합니다. C 사용 전
0.4% Trypan BlueGibco15250-061
1% 페니시일린/스트렙토마이신Gibco15070-063
10% 열 비활성화 FBSGibco16140-07137°C에서 수조에서 가열해야 합니다. C 사용 전
1ml 플라스틱 주사기 BD 의료 용품309628
1x PBSGibco10010-023
2 ml 마이크로 원심 분리기 나사 캡Corning430917
96 웰 세포 배양 플랫 바닥 플레이트Costar CorningCL3595
96 웰 필터 플레이트MilliporeMSGVS2210
접착 씰ThermoScientificAB-0558
Bacto AgarBecton Dickinson214010TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
Bacto Proteose PeptoneBecton Dickinson211684TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
CefoperazoneMP Bioworks199695
CefoxitineSigmaC47856TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
Clostridium difficile Antitoxin KitTech LabsT5000Vero 세포 분석
Clostridium difficile Toxin AList Biological Labs152CVero 세포 분석에 대한 양성 대조군
D-cycloserineSigmaC6880TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
증류수Gibco15230
DMEM 1x MediaGibco11965-09237°C의 수조에서 가열해야 합니다. C 사용 전
과당FisherL95500TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
혈구계Bright-Line, SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
MgSO4 (무수)SigmaM2643TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
밀렉스-GS 0.22 & m 필터Millex-GSSLGS033SSTCCFA 플레이트용 필터 
Na2HPO4SigmaS-0876TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
NaClFisherS640-3TCCFA 플레이트의 일부 (아래 참조)
Number 10 일회용 메스 블레이드Miltex, Inc4-410
PCR 플레이트Fisherbrand14230244
플라스틱 페트리 접시Kord-Valmark 브랜드2900
멸균 플라스틱 L자형 세포 살포기Fisherbrand14-665-230
주사기 스테퍼Dymax CorporationT15469
타우로콜레이트시그마T4009TCCFA 플레이트의 일부(아래 참조)
초순수 증류수Invitrogen10977-015
C57BL/6J 마우스The Jackson Laboratory664생쥐는 생후 5-8주령이어야 합니다
올림푸스 BX43F 광학 현미경올림푸스 생명 과학
DP27 카메라올림푸스 생명 과학
cellSens Dimension 소프트웨어 Olympus 생명과학
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F.....

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