Method Article

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

DOI:

10.3791/54854

⸱

January 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 플라스미드 접합에 관여하는 관심 유전자를 knockout하고 나중에 짝짓기 분석을 사용하여 그 부재의 영향을 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자의 기능은 결실 또는 점 돌연변이를 사용하여 염기서열의 특정 영역까지 더 탐구됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

박테리아 접합에 의한 유전 물질의 전달은 특정 전달 단백질에 의해 형성된 복합체를 통해 발생하는 과정입니다. 대장균(Escherichia coli)에서 이러한 전달 단백질은 짝짓기 쌍 형성(mating pair formation) 또는 DNA 전달 복합체(DNA transfer complex)로 알려진 DNA 전달 메커니즘을 구성하며, 이는 접합 플라스미드 전달을 촉진합니다. 이 논문의 목적은 짝짓기 분석법과 함께 일련의 결실 및/또는 점 돌연변이를 사용하여 접합에 관여하는 특정 전달 단백질의 역할을 결정하는 데 사용할 수 있는 방법을 제공하는 것입니다. 타겟 유전자는 conjugative plasmid에서 knock out된 다음 타겟 유전자를 보유하고 있는 작은 회수 플라스미드를 사용하여 trans로 제공됩니다. 회수 플라스미드의 표적 유전자에 영향을 미치는 돌연변이는 돌연변이 유전자를 품고 있는 공여자 세포의 짝짓기 효율의 변화를 초래하는 표적 단백질의 기능적 측면에 대한 정보를 드러낼 수 있습니다. 짝짓기 효율의 변화는 접합 DNA 전달을 촉진하는 데 있어 특정 전달 단백질 또는 그 안의 영역의 역할과 중요성에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 짝짓기 분석을 상세한 3차원 구조 연구와 결합하면 접합 전달 단백질의 기능에 대한 포괄적인 이해를 제공할 뿐만 아니라 단백질-단백질 상호 작용 영역을 식별하고 특성화하는 수단을 제공할 수 있습니다.

Introduction

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미세 유기체의 수준에서의 유전자 및 단백질의 전사는 박테리아의 생존과 발전뿐만 아니라 감염 과정에서 중요한 역할을한다. 박테리아 사이 또는 박테리아 및 세포 간 DNA의 교환은 변형, 결합, 벡터 전달을 통해 달성 될 수있다. 1,2- 활용은 대장균 등의 그람 음성균 간의 접합시 점에서 변환 및 전달에 비해 독특 DNA의 전사는 복합 고분자 시스템 공여자와 전지를 연결함으로써 도너 - 제어 방식으로 발생한다. 활용은 박테리아 세포는 호스트 시스템에서 유전자, 단백질 또는 화학 물질을 주입하는 숙주 세포와 상호 작용하는 가장 직접적인 방법입니다. 3 종종, 이러한 에이전트의 전송은 진화와 적응을 호스팅하는 기전과 발암에 이르기까지 호스트에 놀라운 효과를 가지고있다. 그것은 그 공역 recombinatio을 보였다n은 환경 스트레스 조건에서 높은 돌연변이 속도와 박테리아에 적응 3 배의 속도를 증가시킨다. (4) 또한, 접합은 균주의 항생제 내성 유전자가 확산되는을 통해 지금까지 가장 일반적인 경로입니다. 5,6

미생물 세포막 전체 거대 분자의 전달을 지원하기 위해 특수 분비 시스템 진화; 설명 된 그람 음성 세균에서 분비 시스템 (TSSs)의 9 ....

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Protocol

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DNA를 구축 1. 생성

  1. 대상 유전자의 상동 재조합을위한 올리고머 설계
    1. 다음 단일 55-72 bp의 순방향 올리고머 디자인 : (a) 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제 유전자의 5 '시작 위치의 상류 영역 10-100 염기쌍의 DNA 서열과 상동 인 19-32 bp의 긴 뉴클레오티드 서열을 선택할 상업적 pBAD33 플라스미드에서 32 (b)는 영역에 표적 유전자의 5 '시작 위치의 하류 10-150 혈압 36-54 bp의 길이 염기 서열의 상 동성을 선택 관심.
      1. 순서는 (a)에 따라서 하나의 55-72 긴 앞으로 올리고머을주는 고른 염기의 끝 3 '(b)는 5 고른 염기 서열의 끝'에 가입하세요.
    2. 다음 단일 55-72 bp의 역방향 올리고머 디자인 : (a) 영역에서 10 내지 100 bp의 DNA 서열과 상동 인 19-32 bp의 긴 뉴클레오티드 서열을 선택 하류3의 관심 대상 유전자의 단부 사이트의 상업적 pBAD33 플라스미드의 클로람페니콜 유전자의 단부, 및 (b) 상기 (3)의 상류에 10-150 BP 내의 영역에 36-54 bp의 길이 염기 서열의 상 동성을 선택 ' . ....

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Results

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F 플라스미드 구동 접합 과정은 pilus 합성과 공역 DNA 전달을 용이하게하기 T4SS을 어셈블 F-플라스미드 TRA 영역 내에 전달 단백질을 포함하는 조정 방법이다. 단백질 트래픽 (GenBank 액 # BAA97961, UniProt ID P14497)을 공역 F-pilus 형성을 위해 필요합니다. 10,14,35 -이 촉매 CXXC 모티브가 없습니다 불구하고 37 단백질은 C 말단 티 오레 독신과 같은 도메인이 포함되어 있습니다. 그것은 그것의 N 말단 영역을 통해 TraH 단백질과 상호 작용하는 것으로 예상되었지만, 35,38, 39의 영역 밖의 많지 않음 37 단백질의 구조적 특징에 대해 알려져 있으며, 그 C 말단 도메인보다 동적 인 것으로 나타났다. 구조적인 연구와 관련하여 TRAF 단백질의 기능적 양상을 평가하기 위해,.......

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Discussion

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접합 공정은 박테리아와 같은 항생제 내성 마커의 확산 등의 어려운 환경에서 성장을 위해 진화하는 장점을 제공하는 유전자를 확산 할 수있는 수단을 제공한다. 공역 플라스미드 많은 너무 크기 때문에, 공역 플라스미드 자체의 표적 유전자의 돌연변이를 통해 전송 장치의 조립에 관여하는 단백질의 기능 연구 12 다루기이다. 본원에 설명 된 프로토콜을 하나 더 쉽게 더 작고 관리 발현 플라스미드 (도 1)를 사용하여 관심 대상 유전자를 평가할 수있는 수단을 제공한다. 우리는 F 플라스미드 매개 활용을 연구하는 F 플라스미드 유도체 pOX38-TC (표 1) 사용; 다른 공역 플라스미드는 여기에 설명 된 프로토콜과 해당 파생 플라스미드를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 설명 된 상대 분석은 일부 modificati와 프로스트와 동료, (42)에서 채택 된기능. 이전 연구에서, pOX38-TC Δgene :: 형상 구조체의 8,33,.......

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Disclosures

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학위원회에서 발견 그랜트 (NSERC)에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GeneJet 플라스미드 미니 준비 키트Fisher ScientificK0503
GeneJet 젤 추출 키트Fisher ScientificK0692
GeneJet PCR 정제 키트Fisher ScientificK0702
Q5 부위 지정 돌연변이 유발 키트New England BiolabsE0554S
광범위한 DNA 사다리New England BiolabsN0303A
페트리 접시Fisher ScientificFB0875713
ElectroporatorEppendorf4309000027
Electroporation 큐벳Fisher ScientificFB101큐벳은 1mm의 간격이 있습니다.
Enzymes
AvaINew England BiolabsR0152S
EcoRINew England BiolabsR0101S
HindIIINew England BiolabsR0104L
NdeINew England BiolabsR0111S
Phusion DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530L
T4 DNA 리가아제New England BiolabsM0202S
DpnINew England BiolabsR0176S
Antibiotics Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm)Fisher ScientificBP904-10020 µ g/mL
카나마이신 (Km)BioBasic Inc.DB028650 &마이크로; g/mL
Nalidixic 산 (Nal)Sigma-AldrichN8878-25G10 &마이크로; g/mL
리팜피신(Rif)Calbiochem55730320 &마이크로; g/mL
테트라사이클린(Tc)피셔 사이언티픽BP912-10010 &마이크로; g/mL
스트렙토마이신(Sm)피셔 사이언티픽BP910-5050 &마이크로; g/mL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
  2. Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4

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Bacterial ConjugationConjugative Mating AssaysTransfer Protein AnalysisType Four Secretion SystemPlasmid Transfer EfficiencyGene Knockout MethodHomologous RecombinationMating Efficiency CalculationDonor Recipient CellsProtein protein Interactions

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