Method Article

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

DOI:

10.3791/54858

⸱

January 19th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자 발현의 이질성은 림프 인구에서 조사 할 수있는 흥미로운 기능입니다. 이들 세포에서의 유전자 발현은 세포 활성화, 스트레스, 또는 자극하는 동안 변화한다. 단일 셀 다중 유전자 발현 유전자 1, 2, 3, 수십의 동시 평가를 가능하게한다. 단일 세포 수준에서 다중 유전자 발현 인구 얼룩이 -4,5- 판정한다. 그것은 성숙 세포 사이의 다양한 전구체 단계의 가능성 혼합 또한 자극에 대한 세포 반응의 다양성을 모두 결정함으로써 인구의 이질성의 구별이 가능합니다.

선천성 림프 세포 (ILC)는 최근 면역 반응 6,7 내재 이펙터 집단으로 설명되었다. ILC 그는이 프로토콜에서, 세포 이질성상호 작용이있다 함은 항상성 동안 조사 하였다.

현재, 유전자 발현을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 RT-qPCR에있다. 이 방법은 측정의 유전자 발현 한 번에 하나의 유전자. 복수의 셀이 하나의 시험이 필요하기 때문에 또한이 방법은 유전자 발현의 이질성을 예측할 수 없다. 이는 집단의 평균 유전자 발현의 측정을 이끈다. 유전자의 다수의 평가시, RT-qPCR에이 시간이, reagent- 및 샘플이 걸리는 방법이된다. 따라서, 트레이드 오프는 글로벌 화상 누락의 위험을 증가시키는, 평가 될 수있는 유전자 또는 세포 집단의 수를 제한한다.

이 논문은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 이러한 한계를 극복 할 수있는 방법을 설명한다. 이 기술은 최근 미세 유체 기술 진보 1, 2에서 혜택을 받았다. 멀티 플렉스 RT-qPCR에 칩에서 발생하는 반응은 EXC을하지 않습니다나노 리터 수준을 EED. 따라서, 단일 세포 유전자 발현뿐만 아니라, 동시에 복수의 유전자 발현은 메가 샘플하는 reagent- 수행하고 비용 효율적인 방식으로 할 수있다. 이 5 가지 개발 단계 또는 상이한 조건 하에서 4 집단 내 세포의 서브 세트 사이의 클론 세포 수준에서 유전자 서명 이질성을 테스트 할 수있다. 단일 세포 수준에서 조건의 많은 수의 희귀 한 집단에서 작업하는 것은 더 이상 제한되지 않습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지난 몇 년 동안, 선천성 림프 세포 (ILCs)는 점점 더 조사되었다. 항원 특이 적 수용체의 부족에도 불구하고, 그들은 림프 계보에 속하는 조직 항상성 및 염증 중요한 센티넬 나타낸다. ILCs 현재 특정 전사 인자 결합의 발현과 사이토 카인 (6, 7)을 생성하는 능력에 따라 세 개의 그룹으로 분할된다.

ILCs 특정 사이토 카인 생산 8, 9를 통해 다양한 기관에서 다수의 항상성 및 병태 생리 학적 상황에 기여한다. 이러한 세포의 역할을 이해 할 수있게하기 위해, 기관마다 다양한 ILC 개체군을 결정하고, 그 발달 관계를 파악하는 것이 중요하다. 또한, 서로 다른 서브 세트들 사이에서 가소성 현상은 서로 관련되어있다. 이질성을 연구하여한 기관에 존재하는 세포, 그들의 성숙 단계를 구분하고, 특정 기능을 구별 할 수있다.

단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 기술을 설명하기 위해 간 ILCs는 같은 ILC 그룹 (유형 1 ILC) (10) 내 자신의 이질성에 특히 중점을두고 선택되었다. 첫째, 유동 세포 계측법을 사용하여, 세 가지 ILC 인구 간 특징 하였다. 다른 두 집단 간 희귀 ILC 인구 (선천성 이펙터의 5 % 미만) 동안 1 군 ILC는 타고난 이펙터의 약 80 %를 나타낸다. 그 인구는 ILC 인구의 널리 표현 세포 표면 마커를 사용하여 분류 하였다. 그 결과, ILC 집단 간 다른 대체로 유사 하나 볼 정렬.

싱글 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 신속하게 이러한 인구 (11)의 이질성을 조사하기 위해 가장 좋은 방법 중 하나로 떠오르고있다 입니다. 두 가지 특성은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 기술을 활용하여 결정된다. 우선, 클론 레벨보고함으로써, 외관상 유사한 발달 단계를 표시 셀 간의 비교를 위해 셀 고유의 유전자 발현을 복구 할 수있다. 그 후 유전자 발현의 미리 선택된 조합을 보면, 우리는 하나의 시점에서 동시의 유전자 발현 패턴에 기초하여 새로운 유전자의 서명을 결정할 것이다. 기술이 클론 레벨에서 수행되기 때문에, 이러한 측면은도 드문 인구에, 다수의 셀에 대한 발현 다양한 데이터의 수집을 허용한다. 이것에 의해, 간 ILC 이질성 적절히 평가 될 수있다.

다음으로, 글로벌 ILC 표현형의 모든 세포를 분류함으로써, 간이 ILC 인구 다중 유전자 발현의 넓은 개요가 극히 드문 인구를 나타내는 경우에도 얻어진다. 미세 유체 기반 칩도 함께 실험을 할 수 있습니다셀 재가 소량. 결과적으로, 희귀 세포 집단의 유전자 발현 프로파일을 얻을 수있다. 온라인 유전자 서명 분석 소프트웨어 세포군 및 전위 클러스터 셀의 관계를 사용하는 것이 검토된다. 결과적으로, 기능 시험은 생체 레벨에서 클러스터 데이터를 검증하기 위해 수행 될 수있다.

유전자 발현 수십 동일한 칩 (3), 11, 12에서 수백 이상의 단셀에 부수적으로 평가 될 수있다. 분석의 디자인 실험의 가장 길고 가장 중요한 부분입니다. 테스트 할 가설에 관련된 유전자의 판정이 적절한 결과를 얻기 위해 가장 중요하다. 둘째, 특정 컨트롤 (예 : 정렬에 사용 알려진 표면 마커 등) 내부 통제가 필요하다. 이 프라이머 증폭 특이성, 증폭의 효율 및 t을 테스트하기 위해 매우 중요하다프라이머 경쟁 그는 부재. 셀의 다중 유전자 발현을 동시에 평가된다 따라서, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 작업하면, 절약 해주는 기술이다.

모든 셀에 대한 시약의 동일한 칩과 믹스를 사용하여 조작 가능한 오류를 제한하고 샘플 간의 재현성 수 있습니다. 전체적으로 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 다른 측면은 샘플 및 유전자의 다양한 감도의 중대한 레벨, 클론 레벨에서 신뢰성이 높은 결과의 생산을 허용한다. 얻어진 결과는 biostatistical 테스트를위한 강력하고 견고한 데이터를 제공합니다.

이는 물질의 매우 작은 양의 작업을 허용하고 완전한 결과를 유도하는 방법의 미세 형태로 달성 될 수있다. 마지막으로, 온라인 소프트웨어를 사용하면, 목적하는 집단과 비교하는 것이 가능하다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 프랑스 농업 장관과 유럽 연합 (EU)의 지침에 따라 파스퇴르 연구소 안전위원회의 승인되었습니다.

1. 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 준비합니다

  1. 구체적인 역 전사 완충액 5.0 ㎕의 낮은 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) TE 완충액 (10 mM의 TE 용액의 pH 8, 0.1 mM의 EDTA 용액 13 μl를 첨가하여 1.5 ㎖의 튜브에 미리 증폭 믹스 준비 0.2 μM 여과 )과의 Taq DNA 중합 효소 웰 당 (도 1a 0.2 μL).
  2. 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에 미리 증폭 믹스의 6.5 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 판을 96 웰 단일 셀 정렬 판이다.
    참고 : 전자 피펫을 사용하여이 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 정확하고 재현성있는 볼륨 측정을 가능하게하고 시간을 절약 할 수 있습니다.

figure-protocol-1
(a) 판을 정렬 96 웰 단일 셀에서 미리 증폭 믹스는 0.2X 분석 혼합 한 후, 제 분배된다. (b) 각 단일 셀의 위치의 기록은 스프레드 시트에 유지되어야한다. 잘없이 셀은 "아니오 입력"음이라고하는 제어로 사용될 수있다. 두 행은 cDNA를 희석 (하나의 셀에 105 세포의 당량 순차 하나 인 열 희석)와 프라이머 효율을 제어하기 위해 절약 할 수있다. 96- 웰 분석 플레이트에서 (c)는, 상기 분석 로딩 시약은 프라이머를 첨가 한 후, 우선 분배된다. 각각의 프라이머 위치의 레이아웃을 유지하는 것을 잊지 마십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 프라이머 각 1.4 μl를 첨가하여 1.5 ㎖의 튜브에서 0.2X 검정 믹스 준비 (프라이머를 20 배, 최대 48 개의 상이한 프로브를 표 1 참조). 낮은 EDTA TE 버퍼 140 μL에 최종 볼륨을 조정합니다.
  2. 프리 앰프 믹스를 함유하는 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트의 48 웰에 0.2X 검정 믹스 2.5 μl를 배포한다.
    주 : 9 μL되어야 96- 웰 샘플 플레이트의 각 웰의 최종 부피.
  3. 커버 필름과 판을 밀봉합니다. 판 와동 45 초 동안 280 XG에 그것을 스핀 다운. -20 ° C에서 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다.

2. 단일 세포 해리

  1. 공동이 전달 시스템을 사용하여, 저산소증 마우스를 안락사. 해부 접시에 마우스를 수정하고 가위를 사용하여 길이 방향으로 복강을 엽니 다.
  2. 간에서 ILCs을 복구 할 수 있습니다.
    1. 간 분리에 앞서, 플러시 리브세포를 어 순환.
      1. 간문맥을 가지고, 작은 마우스의 왼쪽 대장 이동; 포털 정맥은 복강에서 가장 큰 정맥으로 나타납니다.
      2. 10 mL의 주사기 및 0.45 mm의 바늘로, 문맥을 통해 인산염 완충 식염수 매체 (PBS)로 세척 간. 간 세척을 용이하게하기 위해, 가위로 위 동맥을 잘라.
      3. 담낭을 제거하려면 집게로 담낭의 기본 끼와 가위로 간에서 분리.
      4. 간을 분리하려면 집게로 간의 기반을 꼬집어, 가위를 사용하여 복강의 나머지 간을 구분합니다.
      5. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 배지 5 ㎖ (RPMI) 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 도공 튜브 간을 이동.
  3. 유봉을 사용하여 정비사 해리와 간을 떼어 놓다. 15 ML 튜브에 매체를 전송합니다. 전체 볼륨을 가져와RPMI 2 % FCS 14 ㎖의에. 간세포를 가만히 따르다하는 15 ~ 20 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 둡니다.
  4. 1 ml의 피펫을 사용하여 새로운 15ml의 튜브 (간세포)없이 상등액을 회수 (상등액 12 mL를 기대할 수있다). 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. 원심 분리 후 상층 액을 버린다.
  5. 밀도 구배 배지 14 ㎖에 2.4 단계에서 얻어진 펠렛을 재현 탁 (예 퍼콜 40 %). 20 ° C에서 20 분 동안 600 XG에 스핀 다운. 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
  6. 아세트산 칼륨의 1 ㎖ (ACK)에 펠렛을 재현 탁. 1 분 동안 실온에서 떠난다. 1 분 후, 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 2 % FCS 14 ㎖의에 총 볼륨을 가지고. 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. 상층 액을 버린다.
  7. 세포를 염색.
    1. 비오틴 항체 믹스 (재료 표를 참조하십시오 300 μL에 펠렛을 재현 탁, 모든 비오틴 항체가 언급 추가ED) 및 1.5 ml의 튜브에 세포를 전송합니다. 4 ° C에서 20 분 동안 어둠 속에서 그것을 둡니다.
    2. HBSS 2 % FCS 1 ml의에 총 볼륨을 가져옵니다. 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. (재료 표를 참조; 언급 된 모든 형광 색소 결합 항체를 추가) 형광 색소 결합 항체 믹스와 형광 색소 접합 된 스트렙 타비 딘의 300 μL에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 20 분 동안 어둠 속에서 그것을 둡니다.
  8. HBSS 2 % FCS 1 ml의에 총 볼륨을 가져옵니다. 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. 1 ML의 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 1 ㎖의 HBSS 및 프로피 듐 요오다 이드의 펠릿을 재현 탁 (PI를 1 : 4000 참조).
    참고 : 널리 표현 ILC 세포 표면 마커를 사용하는 경우, 세 인구가 정의됩니다 NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα +, 및 NKp46 - IL-7Rα +를. 모든 인구 계보를 분류되어 있습니다 - CD3 - CD4 - CD45.2 +.

3. 단일 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)

  1. 하나의 셀 (13)을 정렬 FACS를 사용합니다.
    참고 : 다른 세포 유형이 동일한 96 웰 단일 셀 정렬 판에 정렬 할 수 있습니다 (그림 2).
    1. 물론 0.2 배씩 분석 믹스와 96 - 웰 단일 셀 정렬 접시에 사전 증폭 혼합을 포함 당 하나의 셀을 정렬 FACS를 사용합니다. 갓 준비 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 사용하거나 -20 ° C에 저장된 경우를 해동.
      1. FACS 판 홀더에 밀봉 된 96 웰 플레이트를 넣습니다. 테스트로 빈 96 웰 플레이트를 사용합니다. 와 플레이트를 위치 A1-아니라 왼쪽과 실험으로.
      2. 검증 비즈와 A1 웰의 중앙에 방울을 얻기 위해 판 홀더를 조정한다.
      3. 라인 A. 모든 우물과 단계를 반복 3.1.1.2
      4. 상기 96 웰 플레이트에서 실하고 잘 따라 정렬 100 검증 구슬을 제거합니다. D 확인웰의 중심에 형성 ROP.
      5. 제대로 조정하면, 판 홀더에 96 웰 단일 셀 정렬 판을 놓습니다. 플레이트 레이아웃과 잘 당 정렬 한 셀을 그립니다.
        참고 : 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트의 각 셀의 적절한 위치 결정이 필수적이다. 접시 레이아웃은 스프레드 시트 소프트웨어에 보관해야합니다. 플레이트 레이아웃은 다음의 여러 단계 (도 1B) (14)에 사용된다. 세포없이 96 웰 샘플 접시에 하나 잘 포함하여 0.2 배씩 분석 믹스와 프리 앰프 믹스를 남겨주세요. 이 웰 노 입력 제어로서 사용된다. cDNA의 희석 6 우물의 두 행을 둡니다. 이 우물은 프라이머 효율 (그림 1b)에 대한 컨트롤로 사용된다.
      6. -20 ° C에서 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다.

4. 사전 증폭

  1. 신선한 또는 96 웰 해동 단일 셀 정렬 판 OBT를 사용하여단계 3.1.1.6에서 ained. (45 초 280 XG) 판 와동과 스핀 다운.
  2. 열 순환기에 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 놓습니다. 그림 3 및 표 2에 언급 된 프로그램에 따라 역전사 및 사전 증폭을 수행합니다.

figure-protocol-2
그림 3 : 사전 증폭 프로그램입니다. 충분한 재료를 갖기 위해, 정렬 된 단일 세포에 대한 표적 유전자의 프리 앰프가 필요하다. 96- 웰 단일 셀 정렬 판은 사전 증폭 프로그램을 수행하기 위하여 열 순환기에로드된다. 전치 증폭 생성물은 낮은 EDTA TE 완충액으로 희석 한 즉시 사용하거나 -20 ℃에서 냉동 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 프리 앰프 희석각 웰에 둘러 EDTA TE 완충액 36 μl를 첨가하여 샘플을 lified.
  2. 커버 필름과 판을 밀봉합니다. (45 초 280 g)을 판 와동과 스핀 다운. -20 ° C에서 미리 증폭 96- 웰 단일 셀 정렬 판을 보관하거나 즉시 사용한다.

5. 96 웰 샘플 플레이트를 준비

  1. qPCR에 마스터 믹스 175 μL 및 샘플 로딩 시약의 17.5 μl를 추가하여 마스터 믹스 191 μl를 준비합니다.
  2. 새로운 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에서 마스터 믹스의 3.6 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 96- 웰 플레이트의 샘플이다.
  3. 새로운 96 웰 플레이트에 96 웰 샘플 플레이트에서 미리 증폭 된 cDNA의 2.9 μl를 전송합니다. 96 번의 세포 정렬 플레이트와 96- 웰 샘플 플레이트 사이의 각 샘플에 대해 같은 위치를 유지한다.
  4. 커버 필름과 판을 밀봉합니다. (45 초 280 XG) 판 와동과 스핀 다운. 빛으로부터 보호 얼음에 새로운 96 웰 플레이트를 놓습니다. 96 웰의 보관-20 ℃에서 충분한 플레이트 즉시 사용하거나.

6. 96 웰 분석 플레이트를 준비

  1. 새로운 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에서 분석 로딩 시약의 3 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 판은 96- 웰 분석 플레이트라고한다.
  2. 각 웰에 프라이머의 3 μl를 추가합니다. 스프레드 시트 소프트웨어에 레이아웃 유지 (도 1C 및 표 1] 표 1에 열거 된 모든 프라이머를 사용). 96- 웰 분석 플레이트의 각 프라이머의 적절한 위치 설정은 다음과 같이 여러 가지 필수적이다.
    1. 샘플의 수가 48 미만이면, 미 웰 물 대신에 프라이머를 추가한다.
  3. 커버 필름과 판을 밀봉합니다. (45 초 280 XG) 판 와동과 스핀 다운. -20 ° C에서 96 웰 분석 플레이트를 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다.
    주 : 프라이머의 반복 동결 융해를 방지 사전 증폭 믹스의 프라이머를 배포하고 96 아에 대한하려면동시에 L 개의 분석 플레이트.

7. 단일 세포 유전자 발현 칩

  1. 벤치에 통합 된 미세 유체 회로 (IFC)를 놓고 출장 주사기를 사용하여 밸브를 확인하십시오. , 주사기를 열고 밸브에 수직으로 배치, 단단히 누르십시오. O 링이 이동해야합니다. 제어 라인 유체 칩 (투베르쿨린 0.3 ㎖)를 입력합니다.
  2. 제 2 밸브와 단계를 반복 7.1.
    참고 : 액체가 칩을 통해 유출 될 수 없습니다.
  3. 칩의 바닥에서 파란색 필름을 제거합니다. IFC 컨트롤러에 칩을 넣습니다. IFC 컨트롤러 화면에서 "PRIME"을 선택한 다음 "RUN을." 미세 유체 라인의 제어는 10 분간 지속.
  4. 칩을 꺼내고 칩의 하단에있는 파란색 필름을 다시 봉인.

figure-protocol-3
그림 4 : 단일 셀 다중 유전자 발현 칩로드. 이 단계는 g를 필요로특히 단일 셀 다중 유전자 발현 칩으로 96 웰 플레이트의 전송 중에 reat 정밀도. 로드 오류와 오 배치를 방지하려면, 매우 순차적으로 작동하는 것이 좋습니다. 각 전송 걸리는 부피 피펫 팅 과정을 제어한다. 마지막으로, 임의의 기포를 방지하고 형성시에 제거하는 것이 중요하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 8- 채널 피펫, 전사 칩의 A1 측 (좌측)에서 96- 웰 분석 플레이트에서 5 μl를 사용. 도 4에 나타낸 바와 같이, 칩의 왼쪽을 채운다. 항상 조언에 동일한 볼륨을 그릴주의하십시오.
    1. 거품을 만들지 마십시오. 거품이 나타날 경우, 10 μl의 팁을 사용하여 제거합니다. 칩의 각 웰에 대한 변경 팁.
  2. 오른쪽 오 단계를 반복 7.596- 웰 샘플 플레이트 5 μL를 사용하여 F 칩.
  3. 칩의 바닥에서 파란색 필름을 제거합니다. IFC 컨트롤러에 칩을 넣습니다. IFC 컨트롤러 화면에서 "RUN SCRIPT"를 선택한 다음 "RUN을." 미세 유체 라인의 로딩은 45 분 동안 지속됩니다.
  4. 칩을 꺼내고 칩의 하단에있는 파란색 필름을 다시 봉인.

8. 실행하여 칩

  1. 미세 유체 qPCR에 컴퓨터에서 "데이터 수집"소프트웨어를 선택합니다. 그것이 시작되면 "새 실행"을 선택합니다.
  2. 선택 "꺼내기"칩의 바닥에서 파란색 필름을 제거하고 칩을로드합니다. 왼쪽과 실험으로 잘 A1을 얻을 수있는 칩을 놓습니다.
  3. 에서의 "프로젝트 설정", "없음"을 선택한 다음 선택하지 "다음."
  4. "새 칩 실행", "새로운 칩 디렉토리"(실험에 대한 폴더를 생성), "다음을 선택합니다."
  5. "유전자 발현"에서 "선택; 수동 기준 = ROX "(카르복시-X-로다 민) 및"단일 프로브; "프라이머에 따라 올바른 필터를 선택 선택합니다."다음 "을.
  6. 선택 "찾아보기"사용 된 프라이머에 따라 올바른 프로그램을 선택합니다.
    주 : "기본적으로 10 분 - Hotstart.pcl"은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 대한 가장 일반적으로 사용되는 프로그램이다.
  7. "시작 실행"을 선택합니다. 반응은 약 90 분 소요됩니다.
  8. 일단 선택 완료 "꺼내기-완료."

9. 데이터 분석

  1. "열기", "파일"을 선택하고는 "실시간 PCR 분석"소프트웨어를 열고 실험 폴더를 찾아 선택 "ChipRun.bml 파일을."
  2. "분석보기", "결과 표"및 "열지도보기를 클릭;" 에 "X"로 표시된 박스 임계 검출 레벨 아래에있는 및 / 또는 잘못된 증폭 곡선을 가졌다.
  3. 샘플의 이름을 지정합니다. "샘플 설정"및 셀프로 이동요법 "새 SBS 96" "매핑"을 클릭하고 "..."복사 및 스프레드 시트 소프트웨어에서 샘플 레이아웃 설계를 붙여 넣습니다. 로 붙여 넣은 레이아웃 정의 "샘플 이름을."
  4. 분석법의 이름을 지정합니다. 반복 단계에서 프라이머 이름을 가진 9.3 "감지기 설치." 로 붙여 넣은 레이아웃 정의 "감지기 이름을."
  5. "분석보기"를 클릭합니다 "분석;" 샘플 및 프라이머 이름은 샘플과 프라이머 (그림 7)에 자동 귀속됩니다.
  6. CT, 델타 코네티컷을 계산하고, 각 샘플에 대한 변경을 접습니다. 내부 통제 (여기, GAPDH) 등의 하우스 키핑 유전자를 사용하여
    ΔCT = 코네티컷 샘플 - 코네티컷 내부 통제
    (ΔCtsample - ΔCtnegative 제어) - 변경 = 2 배
    1. "감지기 설치"를 클릭없이 입력 컨트롤로 잘 선택 (유전자 발현을 정상화하기 위해 내부 통제로 하우스 키핑 유전자를 사용). 선택 "Editor ","기준을 정의 "와"업데이트. "
    2. 위의 정의 내부 통제가 적용됩니다되는 모든 우물을 선택합니다. "테스트로 정의합니다." "편집기"를 선택하고 적절한 참조 유전자를 선택하고 클릭 "업데이트를."
    3. 또한 음성 대조군을 선택 "샘플 설치"를 선택합니다. "편집기"를 선택하고 정의 "참조." "업데이트"를 클릭하십시오.
    4. "분석;" "분석보기"를 선택하고 델타 코네티컷과 배 변경이 자동으로 계산됩니다.
  7. 데이터를 내 보냅니다. 표 결과 "로 저장, 내보내기" "파일"을 선택하고 "대상 폴더를 선택하고 히트"저장 "과"종료합니다. "
  8. 단계를 반복 9.7, 대신 다른 이름으로 저장 "표 결과"의 "히트 맵 결과."

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

림프 인구는 유전자 발현의 다양성을 표시합니다. 이 프로토콜에서, 간 ILC 실 얼룩이은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 사용하여 조사 하였다. 다른 유전자 발현 기술과는 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 동시에조차 희귀 여러 집단 작업을 허용한다. 클론 수준에서 높은 감도와 결합이 특이도는 인구 내에서 유전자 서명의 차이의 조사 및 희귀 집단 사이에 있습니다. 예를 들어, 4 주령 생쥐의 간에서 3 ILC 인구 유전자 서명을 평가 하였다. 다른 두 간에서 (계통 음성 세포의 1 % 미만) 희귀 한 반면 인구를 쉽게 식별 할 정도로 빈번하다.

96 웰 단일 셀 정렬 플레이트 96 웰 플레이트 분석 간 dissectio 이전에 제조 된n 및 해리 (그림 1). 각각의 혼합 멸균 후드를 준...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 클론 수준에서 완전한 유전자 발현 정보를 획득하는 방법을 설명한다. 여기, 우리가 간 ILC 함 이질성을 조사 하였다. (넓게 표현 ILC 표면 마커에 기초하여) 상이한 ILC 인구 단세포 정렬 후, 샘플을 특정 사전 선택된 유전자 사전 증폭 하였다. 이어서, 수득 된 cDNA와 프라이머를 멀티 플렉스 RT-qPCR의 마이크로 유체 칩 상에 로딩 하였다. 마지막으로, 우리는 48 하나의 세포에서 48 다른 유전자의 발현을 획득했습니다. 유전자 발현 결과 유전자 서명 및 세포 집단의 관계를 조사하는 온라인 소프트웨어를 통해 분석 하였다.

이 기술의 주요 장점은 동시에 다수의 유전자의 발현을 평가하는 기능이다. 또한 클론 수준에서 매우 드문 인구에 대한 작업을 할 수 있습니다. 유전자 발현 클론 수준으로 평가되기 때문에, 종래의 RT-qPCR의 방법과 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에, 아니 평균화 효과가 없다. 그러므로, 집단 내의 얼룩이 검출 및 분석...

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 파스퇴르 연구소, INSERM, 파리 디드로 대학, 그리고 Recherche (S.C.); Association pour la Recherche sur le Cancer (S.C. 및 R.G.); REVIVE Future Investment Program 및 Agence Nationale de Recherche (ANR; A.C.에 "Twothyme" 보조금); ANR 부여 "Myeloten"(R.G.에게); 및 Institut National du Cancer (간 발암 중 면역 미세환경의 역할, R.G.). 파스퇴르연구소(Institut Pasteur)의 인체 면역학 및 세포 분석 센터(Center for Human Immunology and Cytometry) 플랫폼의 지원에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cells Direct One Step qRT-PCR 키트Applied Biosystems 11753100프라이머 프로브 검출 키트. 2x 반응 믹스, SSIII 플라티늄 효소가 함유되어 있습니다.
낮은 TE EDTA 버퍼Affymetrix75793 100ML
96웰 플레이트Thermofisher ScientificAB 1100세포 분류 및 열순환에 적합한 96웰 플레이트
커버 필름Dominique Dutscher106570알루미늄 커버 필름; 오염 및 증발 방지
ActbThermofisher ScientificMm00607939_s120x 프라이머
AesThermofisher ScientificMm01148854_s120x 프라이머
AhrThermofisher ScientificMm00478932_s120x 프라이머
Bcl2Thermofisher ScientificMm00477631_s120x 프라이머
c-mycThermofisher ScientificMm00487804_s120x 프라이머
CbfbThermofisher ScientificMm01251026_s120x 프라이머
Cd27Thermofisher ScientificMm01185212_s120x 프라이머
Cd49aThermofisher ScientificMm01306375_s120x 프라이머
CD49bThermofisher ScientificMm00434371_s120x 프라이머
Cxcr5Thermofisher ScientificMm00432086_s120x 프라이머
Cxcr6Thermofisher ScientificMm02620517_s120x 프라이머
EomesThermofisher ScientificMm01351985_s120x 프라이머
Ets1Thermofisher ScientificMm01175819_s120x 프라이머
Foxo1Thermofisher ScientificMm00490672_s120x 프라이머
Gapdh Thermofisher ScientificMm03302249_s120x 프라이머
Gata3Thermofisher ScientificMm00484683_s120x 프라이머
Gm-csfThermofisher ScientificMm01136644_s120x 프라이머
Hes1Thermofisher ScientificMm01342805_s120x 프라이머
HprtThermofisher ScientificMm00446968_s120x 프라이머
Id2Thermofisher ScientificMm01293217_s120x 프라이머
Il-12rb2Thermofisher ScientificMm00711781_s120x 프라이머
Il-18r1Thermofisher ScientificMm00515178_s120x 프라이머
Il-1rl1Thermofisher ScientificMm00434237_s120x 프라이머
Il-22Thermofisher ScientificMm001226722_s120x 프라이머
Il-23rThermofisher ScientificMm00519943_s120x 프라이머
Il-2raThermofisher ScientificMm01340213_s120x 프라이머
Il-2rbThermofisher ScientificMm01195267_s120x 프라이머
IL-7rThermofisher ScientificMm00434295_s120x 프라이머
Klr5Thermofisher ScientificMm04207528_s120x 프라이머
Lef1Thermofisher ScientificMm00550265_s120x 프라이머
Ncr1Thermofisher ScientificMm01337324_s120x 프라이머
Nfil3Thermofisher ScientificMm01339838_s120x 프라이머
Notch1Thermofisher ScientificMm00435249_s120x 프라이머
Notch2Thermofisher ScientificMm00803069_s120x 프라이머
RoraThermofisher ScientificMm01173766_s120x 프라이머
RorcThermofisher ScientificMm01261022_s120x 프라이머
Runx3Thermofisher ScientificMm00490666_s120x 프라이머
Tbx21Thermofisher ScientificMm01299453_s120x 프라이머
Tcf3Thermofisher ScientificMm01175588_s120x 프라이머
Tcf7Thermofisher ScientificMm00493445_s120x 프라이머
Tle1Thermofisher ScientificMm00495643_s120x 프라이머
Tle3Thermofisher ScientificMm00437097_s120x 프라이머
Tsc22d3Thermofisher ScientificMm01306210_s120x 프라이머
Tnfrsf11aThermofisher ScientificMm00437132_s120x 프라이머
ToxThermofisher ScientificMm00455231_s120x 프라이머
Zbtb16Thermofisher ScientificMm01176868_s120x 프라이머
Zbtb7bThermofisher ScientificMm00784709_s120x 프라이머
qPCR 마스터 믹스 Applied BioSystemsP/N 4304437
2x 분석 로딩 시약플루이다임P/N 85000736특정 밀도 매체로 멀티플렉스 RT-qPCR 미세유체 칩에서 어세이를 로드합니다.
2x 샘플 로딩 시약FluidigmP/N 85000735멀티플렉스 RT-qPCR 미세유체 칩에서 샘플을 로드하기 위한 특정 밀도 매체. 
48.48 mutliplex RT qPCR 미세유체 칩FluidigmBMK-M-48.4848.48 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFC; 단일 세포 다중화 RT-qPCR 반응용 칩
48.48 mutliplex RT qPCR 미세유체 칩 컨트롤러Fluidigm8900002048.48 IFC 컨트롤러; 칩 내부 유체 시스템 제어, 반응 챔버에서 샘플 및 분석 로드
mutliplex RT qPCR 미세유체 열순환기FluidigmGE48.4848.48 동적 어레이 IFC 열순환기
96웰 플레이트Thermofisher ScientificAB 1100세포 분류 및 열 순환에 적합한 96웰 플레이트
C57Bl/6 마우스JanvierC57Bl/6 miceJ@RJ
10ml 주사기BD Biosciences309639
PBSLife Technologies14040174
HBSSLife Technologies24020133
RPMILife Technologies61870044
FCSCVFSVF000UEurobio Abcys표준 태아 송아지 세럼
포터 튜브N/A
15 ml 튜브Corning352097
1.5 ml 튜브Sigma-AldrichT9661-1000EA
FACS 기계N/A
원심분리기 써모피셔 사이언티픽75004538
1,000 &마이크로; l 팁Fisher Scientific10313272
P1000 GilsonF123602
PercollDominique Dutscher17-0891-01
Facs tubeFalcon352235
anti-CD8 Biotin 마우스 항체Sony1103520계통 항체
anti-CD19 Biotin 마우스 항체Sony1177520계통 항체
anti-TCRab Biotin 마우스 항체BioLegend109204계통 항체
항-TCRgd 비오틴 마우스 항체BD Biosciences553176계통 항체
항-Ter119 비오틴 마우스 항체BD Biosciences553672계통 항체
항-Gr1 비오틴 마우스 항체BD Biosciences553125계통 항체
anti-CD45.2 PerCPCy5.5 마우스 항체BioLegend109828
항-IL7ra PeCy7 마우스 항체ebioSciences25-1271-82
항-CD3 BV510 마우스 항체BD Biosciences563024
anti-CD4 BV786 마우스 항체BD Biosciences563727
anti-NKp46 PE 마우스 항체ebioSciences12-3351-82
StreptavidinSony2626025
Propidium IodideSigma-AldrichP4864-10ML
전동 피펫Eppendorf4986000017
Combitips 0.1 mlEppendorf30089405
멀티채널 피펫RaininL8-10XLS+
AccudropBD Biosciences345249FACS용 검증 비드
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References

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