이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 발현의 이질성은 림프 인구에서 조사 할 수있는 흥미로운 기능입니다. 이들 세포에서의 유전자 발현은 세포 활성화, 스트레스, 또는 자극하는 동안 변화한다. 단일 셀 다중 유전자 발현 유전자 1, 2, 3, 수십의 동시 평가를 가능하게한다. 단일 세포 수준에서 다중 유전자 발현 인구 얼룩이 -4,5- 판정한다. 그것은 성숙 세포 사이의 다양한 전구체 단계의 가능성 혼합 또한 자극에 대한 세포 반응의 다양성을 모두 결정함으로써 인구의 이질성의 구별이 가능합니다.
선천성 림프 세포 (ILC)는 최근 면역 반응 6,7 내재 이펙터 집단으로 설명되었다. ILC 그는이 프로토콜에서, 세포 이질성상호 작용이있다 함은 항상성 동안 조사 하였다.
현재, 유전자 발현을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 RT-qPCR에있다. 이 방법은 측정의 유전자 발현 한 번에 하나의 유전자. 복수의 셀이 하나의 시험이 필요하기 때문에 또한이 방법은 유전자 발현의 이질성을 예측할 수 없다. 이는 집단의 평균 유전자 발현의 측정을 이끈다. 유전자의 다수의 평가시, RT-qPCR에이 시간이, reagent- 및 샘플이 걸리는 방법이된다. 따라서, 트레이드 오프는 글로벌 화상 누락의 위험을 증가시키는, 평가 될 수있는 유전자 또는 세포 집단의 수를 제한한다.
이 논문은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 이러한 한계를 극복 할 수있는 방법을 설명한다. 이 기술은 최근 미세 유체 기술 진보 1, 2에서 혜택을 받았다. 멀티 플렉스 RT-qPCR에 칩에서 발생하는 반응은 EXC을하지 않습니다나노 리터 수준을 EED. 따라서, 단일 세포 유전자 발현뿐만 아니라, 동시에 복수의 유전자 발현은 메가 샘플하는 reagent- 수행하고 비용 효율적인 방식으로 할 수있다. 이 5 가지 개발 단계 또는 상이한 조건 하에서 4 집단 내 세포의 서브 세트 사이의 클론 세포 수준에서 유전자 서명 이질성을 테스트 할 수있다. 단일 세포 수준에서 조건의 많은 수의 희귀 한 집단에서 작업하는 것은 더 이상 제한되지 않습니다.
서론
지난 몇 년 동안, 선천성 림프 세포 (ILCs)는 점점 더 조사되었다. 항원 특이 적 수용체의 부족에도 불구하고, 그들은 림프 계보에 속하는 조직 항상성 및 염증 중요한 센티넬 나타낸다. ILCs 현재 특정 전사 인자 결합의 발현과 사이토 카인 (6, 7)을 생성하는 능력에 따라 세 개의 그룹으로 분할된다.
ILCs 특정 사이토 카인 생산 8, 9를 통해 다양한 기관에서 다수의 항상성 및 병태 생리 학적 상황에 기여한다. 이러한 세포의 역할을 이해 할 수있게하기 위해, 기관마다 다양한 ILC 개체군을 결정하고, 그 발달 관계를 파악하는 것이 중요하다. 또한, 서로 다른 서브 세트들 사이에서 가소성 현상은 서로 관련되어있다. 이질성을 연구하여한 기관에 존재하는 세포, 그들의 성숙 단계를 구분하고, 특정 기능을 구별 할 수있다.
단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 기술을 설명하기 위해 간 ILCs는 같은 ILC 그룹 (유형 1 ILC) (10)
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프로토콜
모든 동물 실험은 프랑스 농업 장관과 유럽 연합 (EU)의 지침에 따라 파스퇴르 연구소 안전위원회의 승인되었습니다.
1. 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 준비합니다
- 구체적인 역 전사 완충액 5.0 ㎕의 낮은 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) TE 완충액 (10 mM의 TE 용액의 pH 8, 0.1 mM의 EDTA 용액 13 μl를 첨가하여 1.5 ㎖의 튜브에 미리 증폭 믹스 준비 0.2 μM 여과 )과의 Taq DNA 중합 효소 웰 당 (도 1a 0.2 μL).
- 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에 미리 증폭 믹스의 6.5 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 판을 96 웰 단일 셀 정렬 판이다.
참고 : 전자 피펫을 사용하여이 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 정확하고 재현성있는 볼륨 측정을 가능하게하고 시간을 절약 할 수 있습니다.
(a) 판을 정렬 96 웰 단일 셀에서 미리 증폭 믹스는 0.2X....
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결과
림프 인구는 유전자 발현의 다양성을 표시합니다. 이 프로토콜에서, 간 ILC 실 얼룩이은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 사용하여 조사 하였다. 다른 유전자 발현 기술과는 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 동시에조차 희귀 여러 집단 작업을 허용한다. 클론 수준에서 높은 감도와 결합이 특이도는 인구 내에서 유전자 서명의 차이의 조사 및 희귀 집단 사이에 있습니다. 예를 들어, 4 주령 생쥐의 간에서 3 ILC 인구 유전자 서명을 평가 하였다. 다른 두 간에서 (계통 음성 세포의 1 % 미만) 희귀 한 반면 인구를 쉽게 식별 할 정도로 빈번하다.
96 웰 단일 셀 정렬 플레이트 96 웰 플레이트 분석 간 dissectio 이전에 제조 된n 및 해리 (그림 1). 각각의 혼합 멸균 후드를 준.......
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토론
이 프로토콜은 클론 수준에서 완전한 유전자 발현 정보를 획득하는 방법을 설명한다. 여기, 우리가 간 ILC 함 이질성을 조사 하였다. (넓게 표현 ILC 표면 마커에 기초하여) 상이한 ILC 인구 단세포 정렬 후, 샘플을 특정 사전 선택된 유전자 사전 증폭 하였다. 이어서, 수득 된 cDNA와 프라이머를 멀티 플렉스 RT-qPCR의 마이크로 유체 칩 상에 로딩 하였다. 마지막으로, 우리는 48 하나의 세포에서 48 다른 유전자의 발현을 획득했습니다. 유전자 발현 결과 유전자 서명 및 세포 집단의 관계를 조사하는 온라인 소프트웨어를 통해 분석 하였다.
이 기술의 주요 장점은 동시에 다수의 유전자의 발현을 평가하는 기능이다. 또한 클론 수준에서 매우 드문 인구에 대한 작업을 할 수 있습니다. 유전자 발현 클론 수준으로 평가되기 때문에, 종래의 RT-qPCR의 방법과 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에, 아니 평균화 효과가 없다. 그러므로, 집단 내의 얼룩이 검출 및 분석.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 파스퇴르 연구소, INSERM, 파리 디드로 대학, 그리고 Recherche (S.C.); Association pour la Recherche sur le Cancer (S.C. 및 R.G.); REVIVE Future Investment Program 및 Agence Nationale de Recherche (ANR; A.C.에 "Twothyme" 보조금); ANR 부여 "Myeloten"(R.G.에게); 및 Institut National du Cancer (간 발암 중 면역 미세환경의 역할, R.G.). 파스퇴르연구소(Institut Pasteur)의 인체 면역학 및 세포 분석 센터(Center for Human Immunology and Cytometry) 플랫폼의 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cells Direct One Step qRT-PCR 키트 | Applied Biosystems | 11753100 | 프라이머 프로브 검출 키트. 2x 반응 믹스, SSIII 플라티늄 효소가 함유되어 있습니다. |
| 낮은 TE EDTA 버퍼 | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96웰 플레이트 | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 세포 분류 및 열순환에 적합한 96웰 플레이트 |
| 커버 필름 | Dominique Dutscher | 106570 | 알루미늄 커버 필름; 오염 및 증발 방지 |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x 프라이머 |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x 프라이머 |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x 프라이머 |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x 프라이머 |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x 프라이머 |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x 프라이머 |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x 프라이머 |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x 프라이머 |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x 프라이머 |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x 프라이머 |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x 프라이머 |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x 프라이머 |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x 프라이머 |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x 프라이머 |
| Gapdh Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x 프라이머 | |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x 프라이머 |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x 프라이머 |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x 프라이머 |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x 프라이머 |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x 프라이머 |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x 프라이머 |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x 프라이머 |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x 프라이머 |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x 프라이머 |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x 프라이머 |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x 프라이머 |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x 프라이머 |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x 프라이머 |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x 프라이머 |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x 프라이머 |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x 프라이머 |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x 프라이머 |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x 프라이머 |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x 프라이머 |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x 프라이머 |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x 프라이머 |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x 프라이머 |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x 프라이머 |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x 프라이머 |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x 프라이머 |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x 프라이머 |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x 프라이머 |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x 프라이머 |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x 프라이머 |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x 프라이머 |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x 프라이머 |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x 프라이머 |
| qPCR 마스터 믹스 | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x 분석 로딩 시약 | 플루이다임 | P/N 85000736 | 특정 밀도 매체로 멀티플렉스 RT-qPCR 미세유체 칩에서 어세이를 로드합니다. |
| 2x 샘플 로딩 시약 | Fluidigm | P/N 85000735 | 멀티플렉스 RT-qPCR 미세유체 칩에서 샘플을 로드하기 위한 특정 밀도 매체. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR 미세유체 칩 | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFC; 단일 세포 다중화 RT-qPCR 반응용 칩 |
| 48.48 mutliplex RT qPCR 미세유체 칩 컨트롤러 | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC 컨트롤러; 칩 내부 유체 시스템 제어, 반응 챔버에서 샘플 및 분석 로드 |
| mutliplex RT qPCR 미세유체 열순환기 | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 동적 어레이 IFC 열순환기 |
| 96웰 플레이트 | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 세포 분류 및 열 순환에 적합한 96웰 플레이트 |
| C57Bl/6 마우스 | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10ml 주사기 | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | 표준 태아 송아지 세럼 |
| 포터 튜브 | N/A | ||
| 15 ml 튜브 | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml 튜브 | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS 기계 | N/A | ||
| 원심분리기 | 써모피셔 사이언티픽 | 75004538 | |
| 1,000 &마이크로; l 팁 | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin 마우스 항체 | Sony | 1103520 | 계통 항체 |
| anti-CD19 Biotin 마우스 항체 | Sony | 1177520 | 계통 항체 |
| anti-TCRab Biotin 마우스 항체 | BioLegend | 109204 | 계통 항체 |
| 항-TCRgd 비오틴 마우스 항체 | BD Biosciences | 553176 | 계통 항체 |
| 항-Ter119 비오틴 마우스 항체 | BD Biosciences | 553672 | 계통 항체 |
| 항-Gr1 비오틴 마우스 항체 | BD Biosciences | 553125 | 계통 항체 |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 마우스 항체 | BioLegend | 109828 | |
| 항-IL7ra PeCy7 마우스 항체 | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| 항-CD3 BV510 마우스 항체 | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 마우스 항체 | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE 마우스 항체 | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| 전동 피펫 | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| 멀티채널 피펫 | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | FACS용 검증 비드 |
참고문헌
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-t....
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