적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Summary

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

전기 영동 이동성 이동 분석 (EMSA)는 단백질과 타겟 DNA 서열 사이의 상호 작용을 특성화하기위한 수단 도구입니다. 방사능은 EMSAs의 DNA 라벨의 주된 방법이었다. 그러나, 형광 염료 및 검사 방법의 최근 발전은, 시간을 절약 비용을 절감하고, 안전성을 향상 취급 용이성의 이점에 대한 방사능의 대안으로 DNA의 형광 태그의 사용을 자극했다. 우리는 최근 성공적으로 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 형광 EMSA (fEMSA)을 사용했다. 우리 fEMSA 분석은 매우 보존 HMG 전사 인자의 SOX-2 후각 신경 세포 유형의 다양 화에에서는, 과오 돌연변이, G73E의 효과에 기계적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 돌연변이 SOX-2 ^{G73E 단백질함으로써} 후각 신경 세포 정체성 변환을 일으키는 특정 DNA 결합 활성을 변경 한 것으로 나타났습니다. 여기서는 현재 최적화 단계별 프로토콜 경제적fEMSA 생물학적 예와 LIM-4 / SOX -2- 인접한 타겟 사이트 정제 SOX-2 단백질 (WT 및 돌연변이 SOX ^{G73E-2 단백질)을} 함유하는 적외 형광 염료 - 표지 된 올리고 뉴클레오티드를 사용.

Introduction

EMSAs은 목적 단백질과 단백질의 ^하나의 잠재적 표적 부위를 함유하는 표지 된 DNA 프로브의 혼합물을 해결하기 위해 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 네이티브 (PAGE)을 이용하여 DNA와 단백질 사이의 상호 작용을 분석하는데 사용된다. 단백질과 결합 된 DNA 프로브는 느린 무료 DNA 프로브와 비교하고, 폴리 아크릴 아미드 매트릭스를 통해 자사의 이동에 따라서 지각 마이그레이션합니다. ⁽³²⁾ P에 의해 DNA의 방사성 표지는 EMSAs의 검출을위한 주된 방법이었다. 생화학 적 연구에서의 방사선의 적용이 유용 하였지만, 유사한 감도 대안 DNA 라벨링 방법 인해 방사선 처리와 연관된 건강 및 안전 위험에 채용되고있다. 이러한 대안적인 방법은 ^{바이오틴이} 나 디그 옥시 제닌 (DIG) ³ (둘 다음 화학 발광 시스템에 의해 검출된다)와 DNA의 결합은 PAGE 겔 ^(4)의 SYBR 그린 염색법 포함또는 겔 ^5,6-를 스캔하여 DNA 형광 염료 접합체 직접 검출.

방사성 표지 된 DNA 프로브를 사용 EMSAs의 해결 겔 postrun자가 방사선 필름을 통해 처리 또는 방사성 ^{1,7- 신호를} 검출하는....

Protocol

주 : 형광 표지 된 DNA 프로브 또는 표지 된 DNA의 다른 형태를 사용 EMSAs 단백질 또는 세포 추출물 제제, 단백질 DNA 결합 반응, 및 PAGE 겔 제제 및 실행 (도 1a)에 대해 동일한 프로토콜을 공유한다. 키 차이는 DNA 라벨 절차 후 실행 겔 처리 단계, 및 검출 방법이다.

1. 젤 준비

1. 미니 단백질 겔 시스템 (8.3 cm 폭 X 7.3 cm 길이 X 0.75 mm 두께)를 사용하여, 0.5 배의 TBE (45 mM 트리스 - 보레이트, 1 mM의 EDTA) 2.5 % 글리세롤을 함유하는 5 %의 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 제조.
   1. 아크릴 아미드 / 비스 4 겔에 대한 겔 용액 30 ㎖를 제조 30 % 5 mL를 혼합하는 (37.5 : 1), 3 배 TBE (0.45 M 트리스 - 보레이트, 10 mM의 EDTA), 50 %, 1.5 mL의 글리세롤 ㎖, 10 % 황산 암모늄 300 μL, TEMED 15 μL, 철저하게 DDH ₂ O의 20.2 mL를.
      참고 : 아크릴 아미드는 유해 및 독성, 적절한 개인 보호 장비를 처리합니다.
2. 즉시 겔 용액 캐스트. 중합 후, 투명한 플라스틱 랩 0.5 배의 TBE에 미리 적셔....

Results

오렌지 G 로딩 염료 (6 배 : 100 mL의 30 % 글리세롤에서 0.12 g 오렌지 G)는 전기의 진행 상황을 시각화로드되기 전에 결합 반응에 추가 할 수 있습니다. 브로 모 페놀 블루 등 기타 적재 염료 스캔 중에 감지하기 때문에 이미지 분석 (그림 1B)에 방해가됩니다.

EMSAs 일부 예들에서, 핵 추출물 제제가 사용되는 경우 특히 폴리 deoxyinosinic-deoxycytidylic (DI-DC)가 DNA ¹¹ 단백질의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 결합 반응에 포함된다. 그러나, 디 - 직류를 50㎍ / ㎖의 정제 6xHis-SOX -2- 5'Dye DNA 프로브 (도 1b)과의 결합을 폐지.

Discussion

fEMSAs 단백질-DNA의 상호 작용을 조사 할 수있는 효율적인 수단이고, DNA의 방사성 표지에 대한 대안이다. 적외선 염료, 형광 염료는 시판되고 있으며, 방사성 표지 DNA와 비교하여 친환경 안전하고 방법을 제공한다. 적외 형광 염료 - 표지 된 올리고 뉴클레오티드를 사용 EMSAs는 postrun 겔 공정 단계를 필요로하므로 다른 DNA 라벨링 기술에 비해 시간과 비용을 저장하지 않는다. 시간은 방사성 EMSAs을 사용 대역 ¹ 테스트 DNA 프로브 방사능 농도에 따라, 30 분 내지 수일의 범위 검출한다. 반대로 fEMSA 겔 스캐닝함으로써 상당히 프로토콜 시간을 단축 평균 25 분에 걸린다. 겔 분석 유리판으로부터 제거 할 필요가 없기 때문에 fEMSAs 또한 방사성 표지 비해 상당한 이점을 제공한다. 초기 실행 시간이 충분하지 않은 경우에 겔이 다시 검사 될 수 있도록단백질-DNA 복합체를 해결합니다. 전기 영동을 연장 할 수있는 옵션은 방사성 동위 원소 또는 바이오틴 / 스트렙 타비 딘을 사.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1	바이오 라드	1610158	아크릴아마이드는 유해하고 독성이 있습니다.
6x-HIS 에피토프 태그 항체(HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 항체	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
소 혈청 알부민(BSA) 분자 생물학 등급	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700 표지 DNA 올리고	통합 DNA 기술	맞춤형 DNA 올리고	원고에서는 이를 "5' 염료 표지 또는 적외선 형광 염료 표지 DNA 올리고"라고 합니다. 이 회사는 5' IRDye 표지 DNA 올리고뉴클레오티드를 맞춤 합성할 것입니다. 최소 100이 필요합니다  &뮤; M 스케일 합성 및 HPLC 정제.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  수직 전기영동 셀	바이오-라드	1658000FC	이를 원고에서는 '미니 단백질 겔 시스템(mini protein gel system)'이라고 부른다. 모든 전기 영동 시스템은 크기가 25cm x 25cm 미만인 투명 유리판인 한 사용할 수 있습니다.
Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템	이것은 원고에서 '고급 적외선 이미징 시스템'이라고 합니다.
오디세이 FC 이미징 시스템	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	원고에서는 '주로 서양 블롯을 위한 근적외선 형광 이미징 시스템'이라고 합니다.
Image Studio 소프트웨어 (버전 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio 소프트웨어	이를 원고에서는 '특정 이미징 소프트웨어'라고 합니다.
오렌지 G	시그마 - 알드리치	O3756-25G
6x 오렌지 로딩 염료			0.25 % 오렌지 G; 30 % 글리세롤
0.5x TBE			45 mM 트리스 - 붕산염; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM 트리스 -HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 m M 트리스 -HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x 바인딩 버퍼			50mM 트리스-HCl, pH 7.5; 50mM 염화나트륨; 200 mM KCl; 5mM MgCl<서브>2; 5mM EDTA, pH 8.0; 5mM DTT; 250 μ g/mL BSA