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방법 논문

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

8.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54865

⸱

2016년 12월 1일

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

이 논문에서

요약

광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 대안입니다. PDT의 치료 효과를 높이기 위해 화학요법과 결합된 폐암 표적 나노입자를 개발했습니다. 제조된 나노입자를 사용한 PDT의 시험관 내 및 생체 내 항암 효능을 모두 평가했습니다.

초록

광역학 요법(PDT)은 비침습적이고 비수술적인 방법으로 폐암 치료를 위한 매력적인 대안 선택입니다. 광감작제는 종양 조직에 선택적으로 축적되어 산소와 적절한 파장의 빛이 있는 상태에서 종양 세포를 사멸시킵니다.

PDT의 치료 효과를 높이기 위해 광감작제 및 항암제가 탑재된 폐암 표적 나노입자를 모두 개발했습니다. EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과 기반 수동 표적화와 히알루론산-CD44 상호 작용 기반 능동 표적화가 모두 적용되었습니다. CD44는 비소세포폐암의 바이오마커로 자주 소개되는 잘 알려진 히알루론산 수용체입니다.

또한 본 연구에서는 PDT와 화학요법의 병용을 채택했다. 이러한 조합 개념은 항암 치료 효과를 높이고 부작용을 줄일 수 있습니다.

이 연구에서는 새로운 광감작제로 하이포크렐린 B(HB)를 선택했습니다. HB는 헤마토포르피린 유도체에 비해 PDT의 항암 효능이 더 높은 것으로 보고되고 있다1. 파클리탁셀(Paclitaxel)은 폐암 치료제로 입증되어 항암제로 선정되었다2.

PDT 후 광감작제(HB) 용액, 광감작제 캡슐화된 히알루론산-세라미드 나노입자(HB-NP), 광감작제 및 항암제(파클리탁셀)로 캡슐화된 히알루론산-세라미드 나노입자(HB-P-NP)의 항종양 효능을 비교했습니다. A549(인간 폐 선암) 세포의 체외 광독성과 A549 종양 보유 마우스의 생체 내 항종양 효능을 평가했습니다.

HB-P-NP 치료군은 PDT 후 가장 효과적인 항암 효과를 보였다. 결론적으로, 본 연구에서 준비된 HB-P-NP는 PDT로 폐암을 치료하는 데 있어 잠재력있고 새로운 광감작제 전달 시스템을 나타냅니다.

서론

광역학 요법(PDT)은 광감작제, 빛, 산소의 세 가지 주요 요소로 구성됩니다. PDT는 다양한 암에 대한 유망한 치료법으로 보고되고 있다3. 광 감작제가 암 환자에게 투여되면 종양 조직에 선택적으로 축적됩니다. 적절한 파장의 광이 가해지면 반응성이 높은 일중항 산소 및 기타 활성산소로 인해 종양세포가 손상됩니다4.

폐암은 1980년대 초에 PDT의 첫 번째 응용 프로그램 중 하나로 소개되었습니다5. PDT는 폐암 치료에 몇 가지 이점을 제공합니다. PDT는 비침습적이고 비수술적인 치료법이기 때문에 외과적 절제가 부적절한 환자에게 매력적인 대안 선택입니다.

광감작제의 암 표적화 효능을 향상시키기 위해서는 많은 어려움이 있었습니다. 암 부위에서 광감작제 축적을 증가시키고 정상 조직에서의 축적을 줄이는 것은 암 표적 연구의 동일한 목표입니다. 폴리머, 리포솜 및 나노 입자와 같은 다양한 표적 약물 전달 시스템이 광감작 담체로 채택됩니다6-8. 우리의 이전 연구에서, 나노 입자는 효과적으로 광 감작제의 암 표팅 능력을 증가시켰다9,10. 나노 입자는 수동 및 능동 표적 능력을 모두 가지고 있기 때문에 이상적인 암 표적 운반체입니다. 새는 종양 혈관은 나노 크기의 운반체가 종양에 쉽게 축적될 수 있는 기회를 제공하며, 이는 향상된 투과성 및 유지(EPR) 효과로 잘 알려져 있습니다11,12. 나노 입자와 암세포의 특정 수용체 사이의 상호 작용은 활성 암 표적화를 가능하게 합니다. 이 연구에서는 폐암 세포에서 과발현되는 주요 히알루론산 수용체인 CD44와 상호 작용하기 위해 히알루론산 기반 나노입자를 준비했습니다13.

항암 효능을 극대화하기 위해 본 연구에서는 PDT와 화학요법의 병용을 채택하였다. 이 조합 개념은 치료 효과를 증가시킬 수 있습니다. 더욱이, 광감작제와 항암제의 복용량을 줄이면 부작용을 줄일 수 있습니다. 본 연구에서 새로운 광감작제로 하이포크렐린 B(HB)를 선택했다. HB는 중국 약용 곰팡이 Hypocrella bambuase에서 분리됩니다. Shang 등은 HB 기반 PDT가 헤마토포르피린 유도체 기반 PDT와 비교할 때 더 높은 항암 효능을 가지고 있다고 보고했습니다1. 파클리탁셀(Paclitaxel)은 폐암을 비롯한 다양한 암에 대한 잠재적 치료제로 입증되어 항암제로 선정되었다2.

본 본 논문에서는 PDT 후 광감작제(hypocrellin B, HB) 용액, 광감작제 캡슐화 히알루론산-세라미드 나노입자(HB-NP), 광감작제 및 항암제(파클리탁셀)로 캡슐화된 히알루론산-세라미드 나노입자(HB-P-NP)의 항암 효능을 비교하였다. A549(인간 폐 선암) 세포의 체외 광독성과 A549 종양 보유 마우스의 생체 내 항종양 효능을 평가했습니다.

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프로토콜

참고 : 모든 동물 연구 프로토콜 분당 서울 대학교 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (BA1308-134 / 072-01)에 의해 승인되었다.

히알루 론산 - 세라마이드 1. 합성 (HACE)

  1. 이중 증류수 (DDW)를 60 ml의 테트라 n 개의 -butylammonium 수산화물 (TBA)의 12.21 히알루 론산 (HA) 올리고머 밀리몰 및 9.77 밀리몰 가용화. 30 분 동안 교반한다.
  2. 의 DS-Y30 링커를 합성 테트라 히드로 푸란 25 ㎖ (THF)에 트리 에틸 아민 8.59 DS-Y30의 세라마이드 밀리몰 및 9.45 밀리몰 용해합니다. THF에 4 chloromethylbenzoyl 클로라이드 8.59 밀리몰와 함께 섞는다. 60 ° C에서 6 시간 동안 교반한다.
  3. THF의 혼합물 및 아세토 니트릴 DS-Y30 링커의 합성 HA-TBA의 8.10 밀리몰와 0.41 밀리몰 용해 (4 : 1, v / v)로. 40 ° C에서 5 시간 동안 교반한다.
  4. 필터 제로 여과하여 불순물을 제거하고, 진공 증착법에 의해 유기 용매를 제거한다. (투석막을 이용하여 생성물을 정제하여분자량 컷 - 오프 : 3.5 kDa의)과 동결 건조.

나노 입자의 제조 2

  1. HB 1 mg을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 0.5 ml의 파클리탁셀 1 mg을 용해시키고 볼텍스 혼합하여 5 분 동안 DDW 0.5 ㎖의 혼합. 이어서, 추가의 5 분 동안 소용돌이 혼합하여 그 혼합물을 용해 HACE.
  2. 질소의 부드러운 흐름하에 4 시간 동안 70 ° C에서 용매, 열을 제거한다.
  3. DDW 1 mL로 HACE, HB 이루어지는 막 및 파클리탁셀을 재현 탁. 봉입 약물 제거 주사기 필터 (0.45 ㎛의 공극 크기)에 필터.

3. 체외 광독성

  1. 폐암 세포주에서의 나노 입자의 흡수
    1. RPMI-1640 배지를 함유 10 % (v / v)의 소 태아 혈청, 1 % (w / v)를 페니실린 - 스트렙토 마이신을 준비한다.
    2. 각 / 웰의 1 × 105 세포의 밀도로 24- 웰 세포 배양 플레이트에 시드 A549 세포 (삼중그룹). 가습 된 5 % CO 2 및 95 % 공기 분위기하에 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션.
    3. 세포 부착 후, 배지를 제거하고 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다.
    4. 2 μM / ㎖의 HB의 최종 농도로 PBS에 나노 입자를 녹인다. 그리고, 어두운 곳에서 4 시간 동안 각 웰에 PBS 빈 NP에, HB-NP에 또는 HB-P-NP에 1 ml의 세포를 배양한다.
    5. 용액을 모두 제거하고 차가운 PBS 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 신선한 문화 매체를 추가합니다.
  2. 세포 생존 분석
    1. PDT 섬유에서 세포 배양 접시를 놓습니다 (우물에 PDT 섬유에서 거리 1cm 포함). 레이저 안전 안경을 착용 다양한 시간에 대한 암의 PDT 레이저 (630 내지 400 mW의 / cm 2)로 세포를 밝히는 0, 5, 10, 20, 30 및 40 초 (0, 2, 4 8, 12 및 16 J / cm 2). 그리고, 어두운 곳에서 24 시간 동안 세포를 배양한다.
    2. 배지를 흡인하고 차가운 PBS 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 한 번 더 세척 단계를 반복합니다.
    3. 각 웰에 세포 독성 측정 용액 10 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 어두운 데에서 인큐베이션.
    4. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한다.
  3. 현미경 분석
    1. PDT 섬유에서 세포 배양 접시를 놓습니다 (우물에 PDT 섬유에서 거리 1cm 포함). 레이저 안전 안경을 착용하고 0, 20, 또는 40 초 (0, 8, 16 J / cm 2)의 어둠 속에서 PDT 레이저 (630 nm의, 400 mW의 / cm 2)와 세포를 조명. 그리고, 어두운 곳에서 24 시간 동안 세포를 배양한다.
    2. 배지를 흡인하고 차가운 PBS 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 한 번 더 세척 단계를 반복합니다.
    3. 아 넥신 V-FITC의 50 μL, 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI, / ㎖ 1.5 μg의) 50 μl를 추가합니다. 가볍게 흔들어 플레이트 어둠 속에서 실온에서 15 분 정도 배양한다.
      참고 : 넥신 V-FI를 사용하여형광 현미경 키트에서 TC.
    4. 차가운 PBS 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 신선한 PBS에 세포를 보관하십시오. 100X 배율 광학 현미경을 사용하여 세포 사멸 세포를 식별합니다.
  4. 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 분석
    1. PDT 섬유에서 세포 배양 접시를 놓습니다 (우물에 PDT 섬유에서 거리 1cm 포함). 레이저 안전 안경을 착용하고 0, 20, 또는 40 초 (0, 8, 16 J / cm 2)에 대한 PDT 레이저 (630 nm의, 400 mW의 / cm 2)와 세포를 조명. 그리고, 어두운 곳에서 24 시간 동안 세포를 배양한다.
    2. 배지를 흡인하고 차가운 PBS 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 한 번 더 세척 단계를 반복합니다.
    3. 및 전송 100 μL, 1 × 결합 완충액 1 ㎖로 세포를 재현 탁 (0.1 M 헤 페스 / 수산화 나트륨 (PH 7.4), 1.4 M의 NaCl, 25 mM의 CaCl2를 9 중량 부, 증류수 10 배 결합 완충액 1 부 희석) 5 ml의에 검액문화 튜브.
    4. 아 넥신 V-FITC의 5 μL 및 요오드화 프로피 듐 (PI)의 5 μl를 추가합니다. 조심스럽게 튜브를 와동과 어두운 데서 실온 (RT)에서 15 분 동안 배양한다. 1 × 바인딩 버퍼 400 μl를 추가합니다.
      참고 : 형광 현미경 키트에서 넥신 V-FITC와 PI를 사용합니다.
    5. FACS (14)를 사용하여 사멸 세포를 식별합니다. PI 및 아 넥신 V-FITC의 여기 레이저 라인은 각각 488 nm 내지 635 nm 인이다. 각각 610 ± 20 nm의 660 ± 20 nm에서 PI와 아 넥신 V-FITC의 형광 방출을 측정합니다. 10000 이벤트에 따라 유동 세포 계수기에 획득 한 세포를 수집합니다.

종양 함유 마우스 (4)에 생체 내 항암 효과

  1. 폐암 유도 마우스 모델
    1. 0.1 ㎖의 RPMI-1640 배지에 1 × 106 세포 A549를 준비; 얼음에 보관합니다.
    2. 자일 라진의 IP 주입 및 tiletamine 및 zolazepam ((1)의 혼합물로 생쥐를 마취 : 2, 1 ㎖ /킬로그램). 부드럽게 마우스 피부의 작은 배를 곤란하게하여 적절한 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
      주 : 사용 이동이 관찰되지 않은 경우, 동물 실험을 시작하기에 충분히 마취.
    3. (- 7 주, 20~22g 6) 피하 BALB / C 남성 누드 마우스의 왼쪽 측면에 세포를 주입한다.
    4. 그들은 새장 주위를 이동하기 시작 때까지 쥐를 관찰하십시오.
      참고 :이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. 특정 병원균이없는 (SPF) 상태에서 마우스를 유지합니다.
    5. 매일 캘리퍼스와 종양의 크기를 측정한다. 종양의 크기는 부피 약 200 mm 3에 도달 할 때, 실험을 시작 (폭 × 길이 2) / 2로 종양 체적 (mm 3)을 계산한다.
  2. 항암 효능 연구
    1. 무작위로 4 개의 그룹 (각 그룹 N = 10)로 쥐를 나눕니다.
    2. (2, 1 ㎖ / kg 1) 자일 라진의 IP 주입 및 tiletamine zolazepam과의 혼합물로 생쥐를 마취. 부드럽게 마우스 피부의 작은 배를 곤란하게하여 적절한 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
      주 : 사용 이동이 관찰되지 않은 경우, 동물 실험을 시작하기에 충분히 마취.
    3. 2 ㎎ / ㎖의 HB의 최종 농도로 PBS에 나노 입자를 녹인다. 두 번 일 0에서 7에 꼬리 정맥 (2 ㎎ / ㎏ HB)를 통해 PBS, 무료 HB, HB-NP에, 또는 HB-P-NPS를 주입한다.
    4. 그들은 새장 주위를 이동하기 시작 때까지 쥐를 관찰하십시오.
      참고 :이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다회복되었다. 어두운 특정 SPF 조건 하에서 새장을 유지합니다.
    5. (2, 1 ㎖ / kg 1) 24 시간 각각 주입 한 후, 자일 라진의 IP 주입 및 tiletamine zolazepam과의 혼합물로 생쥐를 마취. 부드럽게 마우스 피부의 작은 배를 곤란하게하여 적절한 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
      주 : 사용 이동이 관찰되지 않은 경우, 동물 실험을 시작하기에 충분히 마취.
    6. (종양의 PDT 섬유에서 거리 1cm 포함) PDT 섬유에서 종양 부위를 놓습니다. 레이저 안전 안경을 착용 스위치를 끄고, 두 번 일 1 8 500 초 (200 J / cm 2)에 대한 PDT 레이저 (630 nm의, 400 mW의 / cm 2)으로 종양을 조명.
    7. 그들은 새장 주위를 이동하기 시작 때까지 쥐를 관찰하십시오. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. undergon이있는 동물을 반환하지 않습니다다른 동물의 회사에 전자 수술은 완전히 회복 될 때까지.
    8. SPF 조건에서 케이지를 유지합니다. 레이저 치료 후 24 시간 동안 어둠 속에서 새장을 유지한다.
    9. 시각 종양 부피 및 종양 부위에서 매일의 변화를 감시한다. 캘리퍼스와 종양의 크기를 측정하고 (폭 2 × 길이) / 2 (mm 3)로 볼륨을 계산합니다. PDT 후 종양 표면의 변화를 확인하기 위해 매일 종양 사이트의 사진을 촬영합니다.
    10. 날 16 일, 이소 플루 란을 사용하여 단말기 마취에 의해 그룹에 5 쥐를 희생.
    11. 집게와 가위, 외부 피부를 잘라 종양 (15)를 노출합니다. 조심스럽게 그들을 수확. 10 % 포르말린을 고정 파라핀을 포함하고, 조직 학적 분석을 16 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)로 얼룩.
    12. 모니터링 45 일 후, 이소 플루 란을 사용하여 단말기 마취하여 나머지 쥐를 희생.

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결과

우리는 상기 언급 된 기법 및 NP는 HB-HB-P-NP에 모두를 준비했다. HB-NP에와 HB-P-NP에의 평균 직경은 각각 220.9 ± 3.2 nm의 211.9 ± 1.6 nm이었다.

광 조사에 의해 다음 PBS 빈 NP에, HB-NP에 및 HB-P-NP에 함께 배양 4 시간 (0 J 16 / cm 2) 후의 A549 세포의 세포 생존율은 램프 없음.도 1에 도시되고 상기 HB-NP-P 처리 된 세포는 81.28 ± 0.14 %의 세포 생존율을 보였다 HB-NP 처리구는 전혀 세포 독성을 나타내지 않았다. 이 나노 입자로부터 방출 된 파클리탁셀의 항암 효과에 기인 할 수있다. PDT에서 세포 생존율은 HB-NP- 및 HB-P-NP가 처리 된 세포 모두의 노광 시간에 따라 감소 하였다. HB-NP-P 처리 ...

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토론

이 연구에서 가장 중요한 단계는 적절한 레이저 조건을 선택한다 : 파장, 전력 및 조사 시간. 구체적인 감광제에 적합한 조명의 적절한 파장은 PDT 필요하다. 우리는 출력 전력이 많은 파일럿 연구에 기초하여 400 mW의 / cm 2로 설정 한 다른 중요한 요인이었다 hypocrellin의 B. 적합한 선수 630 nm의 레이저를 사용 하였다. 400 mW의 / cm 2 이하의 출력 파워는 임의의 치료 효과를 표시하기에 너무 약한 동안 의한 조사 자체 (2)는 세포 또는 동물의 피부 표면을 손상 400 mW의 / cm를 초과하는 출력 전력. 생체 외 및 생체 내 연구에 적절한 조사 시간은 각각 40 초 (16 J / cm 2) 및 500 초 (200 J / cm 2)이었다. PDT 섬유로부터 세포 또는 동물 모델의 종양 조직으로의 거리가이 연구에서 중요한 요소이다. 로 전체 세포 또는 종양의 표면을...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 보조금없이 의해 지원되었다. SNUBH 연구 기금 14-2014-017.

저자는이 원고의 자신의 프로 보노 편집 J. 패트릭 배런, 명예 교수, 도쿄 의과 대학 겸임 교수, 분당 서울 대학교 병원 신세를하고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
올리고 히알루론산주식회사 바이오랜드_
DS-Y30 (세라마이드 3B; 주로 N-oleoyl-phytosphingosine)두산바이오텍(_
아디프산 디히드라지드시그마 알드리치A0638
N-(3-디메틸아미노프로필)-N′ -ethylcarbodiimide시그마 Aldrich39391
4-(클로로메틸)벤조일 클로라이드시그마 Aldrich270784
Tween 80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
주사기 필터Sartorius Stedim Biotech GmbH1776215 mm, RC, PP, 0.45 µ m
트리에틸아민시그마 AldrichT0886
Mini-GeBAflex 튜브유전자 바이오 응용 회사D070-12-100
파클리탁셀타이화 기업_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
페니실린– 스트렙토마이신Gibco Life Technologies, Inc.15070
소 태아 혈청Gibco Life Technologies, Inc.
Celite (필터 에이전트)Sigma Aldrich68581.4단계 참조
주)16140071

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