여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.
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방법 논문
유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포
이 논문에서
요약
초록
펩타이드 - 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I) 테트라는 CD8 + T 세포 반응을 연구하는 귀중한 도구가되고있다. 이러한 시약 직접 CD8 + T 림프구의 표면 상에 T 세포 수용체에 결합하므로, 형광 표지 pMHC-I의 테트라 항원의 정확한 검출은 (Ag) 시험관을 다시 할 필요없이 특이 적 CD8 + T 세포를 활성화 -자극. 유동 세포 계측법 멀티 컬러와 결합 될 때 또한, pMHC-I 테트라 머 염색은 분화 단계, 메모리 표현형 및 활성화 상태를 포함 AG-특정 CD8 + T 세포의 주요 측면을 공개 할 수 있습니다. CD8 + T 세포는 AIDS까지의 진행에 영향을 미칠 수있는 이런 종류의 분석은 HIV 면역학 분야에서 특히 유용왔다. 유인원 면역 결핍 바이러스와 붉은 털의 원숭이 (SIV)의 실험 감염은 에이즈 바이러스에 대한 세포 성 면역을 연구하는 귀중한 도구를 제공합니다. 그 결과, 상당한 PROGRESS는이 동물 모델에서 T 세포 반응을 정의 및 특징을했다. 여기에서 우리는 pMHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 SIV 특정 CD8 + T 세포를 열거하기위한 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 우리의 분석은 예방 접종 또는 SIV 감염에 의해 발생 SIV 특정 CD8 + T 세포 반응을 추적하는 데 유용 할 수 있습니다 테스트 당이 pMHC-I 사량 + CD8 + T 세포 인구의 동시 정량 및 메모리 표현형을 허용합니다. 생물 의학 연구 비인간 영장류의 관련성을 고려하여, 본 방법은 다수의 질병 설정에서 CD8 + T 세포 반응을 연구에 적용 할 수있다.
서론
그들은 종양 면역 감시에 참여하고 세포 내 병원균 1의 퇴치에 기여으로 CD8 + T 세포는 적응 면역 체계의 중요한 구성 요소를 포함한다. 간단히 말해서, CD8 + T 세포는 숙주 세포의 세포막에 존재하는 T 세포의 특이 적 펩티드 - 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I)를 인식 수용체 (TCR도) 분자를 표현한다. 이러한 펩티드는 내생 적으로 합성 된 단백질의 단백질 분해로부터 유도되기 때문에, 세포 표면 pMHC-I 복합체는 세포 내 환경에 창을 제공한다. 바이러스에 감염되면, 예를 들어, 감염된 세포는 CD8 + T 세포를 순찰로 표현 TCR도에 대한 리간드 역할을 할 수 있습니다 바이러스 유래 펩타이드를 포함하는 MHC-I 분자를 표시합니다. 바이러스 특이 적 CD8 + T 세포가 pMHC-I 리간드를 제시 감염된 세포를 발견 한 경우, TCR 결합은 CD8 + T 세포 활성화 및 발생한다 ULTI후면부로 세포 용해를 대상으로지도한다. CD8 + T 세포 응답의 크기, 특이도, 표현형을 결정,이 TCR / pMHC-I 상호 작용의 중요한 특성을 감안할 때 종종 인간의 질병에 대한 중요한 단서를 공개 할 수 있습니다.
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프로토콜
이 논문에 사용되는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플 위스콘신 국립 영장류 연구 센터 수납 인도 붉은 털 원숭이로부터 수득 하였다. 이 동물은 위스콘신 대학원 동물 관리 및 사용위원회 (33)의 대학에 의해 승인 된 프로토콜에서 Weatherall 보고서에 따라 마음에 든다고했다. 모든 동물 절차는 마취하에 수행 된 모든 활동은 전위의 고통을 최소화 하였다.
1. PKI 치료
참고 : 01 사량 :이 선택하지만, Mamu-B의 * 017을 권장합니다. 결과 및 토론 섹션을 참조하십시오.
- 1.6 X 107 세포 / ml의 농도에서 R10 배지에서 재현 탁 PBMC.
- 튜브 세포 계측법에 대응하는 흐름이 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다. 각 튜브에 PKI의 100 nm의 용액 50 μl를 추가합니다.
- 각 튜브를 소용돌이. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 이 말까지단계는, 각각의 튜브는 8.0 × 105 PBMC와 50 nM의 PKI를 함유하는 세포 현탁액 100 μl를가한다.
- pMHC-I 사량 염색 단계로 진행합니다.
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결과
여기에 설명 된 프로토콜은 Mamu-A1 * 001 + 붉은 털 원숭이에서 백신 유도 개그 CM9 특정 CD8 + T 세포 반응의 크기와 메모리 표현형을 결정하는 데 사용되었다. 이 분석 들어, APC 공역 Mamu-A1 * 001 / 개그 CM9 량체는 8 색 유세포 염색 패널에 사용 하였다. 도 1a는 - F는 각 시험에서 본 양 사량 적용되어야하는 데이터를 분석하는 데 사용 게이팅 전략을 보여준다. pMHC-I 테트라 + CD8 + T 세포 인구가 아니라 최소한의 배경 (그림 1 층과 G)로 구분되어 있습니다. (; CD28 + CCR7 + T CM), 전이 메모리 (T EM1; CD28 + CCR7-) 및 효과기 중앙 메모리 : 붉은 털 원숭이 메모.......
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토론
이 절차 매력 토론에서 몇 단계는 최적의 결과를 산출하기위한 중요하다있다. 생물학적 시료의 품질이 어떤 유세포 분석 (38)의 성공 강한 예측이기 때문에 먼저 모든 치료는 세포의 염색 과정 중에 생존 및 정지되도록주의해야한다. 그들은 응집하는 경향이며, 일반적으로 죽은 세포의 높은 숫자를 포함하기 때문에 냉동 보관 샘플로 작업 할 때 특히 관련이있다. 이러한 경우, 이전 pMHC-I 테트라 라벨링 과정에 70 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 통과하여 실질적으로 결과를 개선 할 수있다. 둘째, 상기 분석에 사용되는 형광 색소의 적절한 보상 여러 매개 변수가 동일한 실험으로 평가되고, 특히, 정확한 데이터 분석을 위해 중요하다. 이러한 점에서, 새로운 단일 색 보정 제어마다 pMHC-I의 테트라 머 (S)를 준비 할 것을 권장분석을 이닝. 우리는 그들의 광범위한 항 IG 반응성들은 양 및 음의 인구 분명 쌍봉 분포를 얻을 수 있다는 사실을 보상 비드의 사용을 선호. 이들 비즈는 MHC-I 분자에 결합.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 본 방법의 최적화를 활성화 실험을 지원하기 위해 데이비드 왓킨스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 P30AI073961에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 AIDS 연구를위한 마이애미 센터에서 제공하는 파일럿 부여에 의해 부분적으로 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 다사티닙 | 축삭돌기 메드켐 | 축삭돌기 1392 | DMSO에 재현탁하고 즉시 -20°C에 보관해야 합니다. C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | 반드시 4 ° 씨 |
| 열 비활성화 FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | 4°C에서 보관해야 합니다. 씨 |
| 페니실린-스트렙토마이신프-암포테리신 B | 론자 | 17-745E | 반드시 4°C에서 보관해야 합니다. 씨 |
| DMSO, 무수 | 생명 기술 | D12345 | 실온에서 보관하십시오. |
| 5ml 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브 | VWR | 60819-728 | |
| 형광 색소 공액 pMHC-I 사량체 | NIH 사합체 코어 또는 MBL, Inc. | 사용하기 전에 4 °C. 원심분리기에서 20,000 x g에서 15분 동안 보관 및 유지 관리해야 합니다. 얼리지 마십시오. | |
| 형광색소 접합 mAbs | 다양한 회사는 | 4°C에서 보관 및 유지 관리되어야 합니다. 얼리지 마십시오. | |
| 라이브/데드 고정식 아쿠아 죽은 Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | -20 °C에서 보관해야 합니다. 각 부분 표본을 50 μ l 사용하기 전에 DMSO의. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | 반드시 보관해야 합니다 4도; 씨 |
| 인산염 완충 식염수 | VWR | 97064-158 | 실온에서 보관 |
| 알부민 소 | VWR | 700011-230 | 반드시 보관 위치: 4 ° 씨 |
| 아지드화나트륨 | VWR | 97064-646 | 실온에서 보관하십시오. 독성 물질. 표백제와 혼합하지 마십시오. |
| 표백제 | VWR | 89501-620 | 부식성 화학 물질은 아지드 화나트륨과 혼합 할 수 없습니다. |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15714-S | 가연성, 부식성 및 독성 시약을 주의해서 다루십시오. 주의해서 다루세요 |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | 실온에서 보관 |
| 투과화 용액 2 | BD Biosciences | 340973 | 독성 및 부식성 시약. 조심히 다루세요 |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml 나사형 상단 | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | Sterile microtubes의 사용이 선호됩니다 |
| Vortex 믹서 | 과학자 | ||
| Biosafety Cabinet | 의 재량에 따라 | ||
| Milli Q Intergral 정수 시스템 | EMD Millipore | ZRXQ010WW | 모든 공급자의 분자 생물학 등급 물을 사용할 수 있습니다 |
| 마이크로 원심분리기 | 과학자 | ||
| 따라 원심분리기 | 과학자 | ||
| ° 씨 냉장고 | 과학자 | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | 유세포 분석기에는 사용된 염색 패널과 호환되는 레이저와 필터가 포함되어야 합니다. | |
| 탈 이온수 | |||
| 알루미늄 호일 | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| 인큐베이터 | 37 °를 유지할 수 있어야 합니다. 씨 내부 온도 | ||
| FACS Diva 소프트웨어 | BD Biosciences | ||
| Flowjo 소프트웨어 버전 9.6 | Flowjo | FACS Diva 소프트웨어에서 생성된 FCS 파일을 분석하는 데 사용 | |
| Micropippette 팁 |
참고문헌
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R.
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