우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.
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방법 논문
미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현
이 논문에서
요약
초록
Optogenetic 시스템은 세포 과정을 변경하는 빛의 특정 파장에 대한 응답으로 형태를 변경 유전자 인코딩 된 단백질을 사용한다. optogenetic 조명 시스템의 프로그래밍 및 자극을 탑재 되 배양 시스템 및 측정이 필요하다. 우리 구축 광의 프로그래밍 용량과 균체를 조명하고, 자동으로 획득하고 유출 셀의 이미지를 분석하는 연속 배양 장치를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. chemostat 등이 장치의 동작은 성장 속도와 셀룰러 환경이 엄격하게 제어 될 수있다. 연속 세포 배양의 유출 물을 주기적으로 샘플링하고, 세포를 다 채널 현미경으로 이미지화된다. 형광 강도 배양 유출 물로부터 샘플링 된 세포의 세포 형태의 동적 응답이 여러 날에 걸쳐 측정되도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전히 자동화사용자 입력없이. 우리가 동적으로 전사를 활성화 optogenetic 시스템 설계 사카 세레 비지에 균주에서 단백질 생산을 유도하여 배양 장치의 유용성을 입증한다.
서론
Optogenetic 시스템은 유전자 발현, 1, 2, 3, 4, 5 단백질 지역화 육 단백질 활성, 6, 7, 8, 단백질 결합, 8, 9, 10, 단백질 분해 등의 세포 과정의 성장 목록을 제어하는 광을 사용한다. 프로그래밍 광 자극으로 제어 된 환경에서 세포를 배양하고, 생물학적으로 중요한 시간 척도에 걸쳐 반응을 측정하기위한 방법 (11)은 세포 생물학 및 생명 공학 연구를 위해 이러한 도구의 전위를 이용하는 것이 필요하다. 우리의 방법은, AE, 잘 혼합에 일정한 세포의 성장 속도를 유지하기 chemostasis 활용평가 및 프로그램 조명에 노출되는 온도 조절 유리 배양 용기 (12, 13). 역 현미경 배양 유출 화상에서는 개별 셀이 프로그래밍 된 조명에 문화의 반응을 측정한다. 형광 강도 및 유출 세포 배양의 세포 형태는 사용자의 입력없이 여러 날에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 이미지, 이미지 분석은 완전 자동화된다.
이 프로토콜은 성장하는 세포 배양과 현미경 익숙한 대부분 실험실에서 구현 될 수 있으며, 사용되는 장치는, 저렴하고 용이하게 가능한 구성 요소했다. 투명 배양 용기 광의 1 μW / cm 2 mW의 -10 / cm이 발광 가능한 발광 다이오드 (LED)의 행렬 위에 배치된다. 미생물 연속 배양 용기에서 성장된다; 하나의 연동 펌프는에 미디어를 추가하는 데 사용됩니다희석 비율은 다른들은 현미경 낮은 속도로 배양을 인출하는 데 사용되며, 그 차이는 오버 플로우 출구를 통해 빠져. 가열 패드 온도를 유지합니다. 공기는 연속적으로 양압을 유지할뿐만 아니라, 혼합 배양을 통기 배양 용기에 펌핑된다. 공기 펌프를 제외하고,이 장치의 전원은 온도계와 연결된 데스크탑 컴퓨터로부터 입력을 수신하는 마이크로 컴퓨터에 의해 조절된다. 유출 세포 배양은 거꾸로 현미경의 무대에서 미세 유체 장치로 펌핑된다. 비 형광 및 형광 이미지가 자동으로됩니다. 이미지 내의 셀은 ROI (region of interest)를 각 셀의 위치를 각 ROI의 특성을 측정하는 알고리즘을 특징으로한다.
이 프로토콜의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 푸른 빛 responsi으로 설계 사카로 마이 세스 세레 비지 세포의 변화하는 빛의 강도에 대한 응답을 측정형광 단백질의 전사를 제어하는 시스템 optogenetic했습니다. 이 시스템에서 유전자 발현을 제어하기위한 여러 optogenetic 시스템이 이미 14, 15, 16가 존재하기 때문에 통상적으로 빵 효모 S. cerevisiae의 알려진이 선택되었다. 또한,이 모델 생물은 일반적으로 시스템 생물학 (17)과 생명 공학 응용 프로그램을 18, 19, 20 섀시로 연구에 사용됩니다. 우리의 대표적인 결과가이 프로토콜은 입력 광 강도를 변화 형광 리포터의 생산을 측정함으로써 복수 일 배양의 전사를 조절하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
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프로토콜
그림 1 : 연속 배양 장치. 이 개략도는 상기 장치는 조명, 배양에 사용하는 경우 조립 및 미생물의 광학 특성을 측정되어야하는지 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 프로토콜의 개요. 음영 영역의 단계는 프로토콜을 사용할 때마다 반복되어야한다. 폐쇄 루프 제어가 가능 (34)이지만,이 프로토콜 구현되어 있지 않습니다.
1. 회로 기판에 온도계를 조립
그림 3 : 연결 온도계 값을 읽을 수 있습니다. 이 그림은 마이크로 컨트롤러가 문화의 온도를 제어하는 피드백을 얻을 수 있도록 디지털 온도계가 PCB에 연결해야하는 방법을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 구멍이 관통 표시 각각에 디지털 온도계의 접지, 데이터 및 긍정적 인 전압 라인을 납땜 "GD + V를."
- 여성 3 핀 헤더에서 하나의 핀을 클립하고 "R2"로 표시된 두 개의 관통 구멍에 맞게 및 마이크로 컨트롤러를 막지 수 있도록, 와이어 가위로 나머지 2 핀을 트림. 장소에 납땜. 핀 헤더에 4.7 kΩ 저항을 삽입하여 두 개의 납땜 핀을 연결합니다.
2. 전원 콘 연결서킷 보드에 트롤 구성 요소
그림 4 : 연결이 가열 패드의 전원을 제어 할 수 있습니다. 이 다이어그램은 PCB 및 부속 부품이 가열 패드로 전력을 제어하기 위해 조합되는 방식을 도시한다. 이러한 부품은 연동 펌프는 유사한 방식으로 접속되어 제어한다. 온도계의 구성 요소가 명확성을 위해 제거 된합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 다섯 여성 3 핀 커넥터의 핀에서 1cm를 낸다. (PCB)는 "# 1", "2", "3", "# 4로 표시된 인쇄 회로 기판상의 위치에이 납땜"및 "CB E."
- 여성 6 핀과 8 핀 헤더의 핀에서 1cm를 낸다. 에면하여 이러한 측면을 납땜관통 구멍의 열은 K14 통해 K1 표지.
- 회로 기판에 가열 패드를 연결한다.
- 인쇄 회로 기판의 관통 구멍 레이블 K1과 K2에 100 kΩ 저항의 끝을 삽입합니다. 위치에 금속 - 산화물 - 반도체 전계 효과 트랜지스터 (MOSFET)에 삽입되도록, 소스 단자가 "# 가장 가까운 관통 구멍 K14 통해 K1 향하도록 MOSFET의 라벨이 상기 PCB에 1로 표시된 # "레이블"레이블 및 드레인 핀으로부터 먼 ".
- 5 V의 직류 (DC) 전원 공급 케이블의 접지선을 잘라 J2에 연결. J1에 가열 패드의 접지선을 연결합니다. 1 kΩ 저항과 3 핀 K3를 연결합니다. 핀 3 + 5V.z로 설정하면 현재는 이제 J2에 J1에서 흘러한다
주 : 마이크로 컨트롤러의 핀 (3)은 5 V로 설정 될 때까지 핀 J2 J1의 전류가 흐른다 스위치로서 저항 / 세트 MOSFET 함수
- 잇다느린 연동 펌프.
- 인쇄 회로 기판의 관통 구멍 표지 K4 및 K5에 100 kΩ 저항의 단부를 삽입한다. 위치에 MOSFET를 삽입하도록 소스 핀이 "#"레이블에 가장 가까운, 상기 드레인 단자가에서 먼 관통 구멍 K14 통해 K1 향하도록 MOSFET의 라벨은 PCB 상에 2로 표시된 "#"레이블입니다.
- 느린 연동 펌프는 12 V DC 전원 공급 케이블의 접지선을 잘라. J3에 끝 J4에 끝을 직면 벽 사마귀에 직면 연동 펌프를 연결합니다. 1 kΩ 저항과 4 핀 K6를 연결합니다. 핀 4 +5 V로 설정되어있는 경우 현재는 이제 J4에 J3에서 흘러한다
- 빠른 연동 펌프를 연결
- 인쇄 회로 기판의 관통 구멍 표시 K7과 K9에 100 kΩ 저항의 끝을 삽입합니다. 위치에 MOSFET를 삽입은 K14 관통 구멍의를 통해 K1 향 MOSFET의 라벨, PCB에 # 3를 표시 그 O를 소스 단자는 "#"레이블에 가장 가까운, 드레인 단자는 "#"라벨에서 먼.
- 고속 연동 펌프는 12 V DC 전원 공급 케이블의 접지선을 잘라. J5에 끝 J6에 끝을 직면 벽 사마귀에 직면 연동 펌프를 연결합니다. 1 kΩ 저항과 5 핀 K9를 연결합니다. 핀 5 +5 V로 설정되어있는 경우 현재는 이제 J6에 J5에서 흘러한다
3. 회로 기판에 LED 매트릭스를 연결
그림 5 : 연결이 LED 매트릭스를 제어 할 수 있습니다. 이 그림은 LED 매트릭스가 PCB에 연결해야하는 방법을 보여줍니다. 또한 PCB 마이크로 컨트롤러에 적층 될 수 있다는 것을 보여준다. 온도계 및 다른 장치에 DC 전력을 제어하기위한 구성 요소가 명료성을 위해 제거 된 참고.에스 / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이 마이크로 컨트롤러의 상부에 적층 될 수 있도록 PCB의 측면에 관통 구멍 6 핀, 10 핀, 및 2 개의 8 핀 암 핀 헤더 납땜.
- 10 μF 커패시터 (짧은 리드)의 음 단자는 음의 부호로 표시 관통 구멍에 접속되어야 함을 감안한 PCB 그들의 표시된 위치로 100 nF를 및 10 μF 커패시터 납땜.
- 멀리에서 드라이버의 들여 쓰기와, 관통 구멍의 2 (12)에 의해 세트 LED 드라이버를 납땜 관통 구멍 LED 매트릭스 예약.
- LED가 매트릭스 표시된 관통 구멍에 핀 헤더 2 열을 납땜, 그들은 마이크로 컨트롤러를 방해하지 않도록 브레드 보드 아래에 이들의 끝을 잘라. 여성 / 여성 점퍼 와이어의 2 개의 8 와이어 스트립 이러한 연결합니다. 남성의 두 번째 세트를 연결합니다점퍼 전선의 타단에 핀 헤더.
- 브레드 보드의 중간을 통해 LED 매트릭스를 넣은 다음 행렬의 양쪽에있는 컬럼에 핀 헤더의 두 번째 세트를 삽입합니다. 발광 다이오드 매트릭스 직접 관통 구멍의 표시된 항목에 대응하는 행렬의 라벨면이 PCB에 접속 된 것처럼 전기적 연결이 동일하도록.
- 여성 3 핀 헤더에서 하나의 핀을 클립하고 "R1"로 표시된 두 개의 관통 구멍에 맞게 및 마이크로 컨트롤러를 막지 수 있도록, 와이어 가위로 나머지 2 핀을 트림. 이 납땜. 핀 헤더에 1 kΩ 저항을 삽입하여 두 개의 납땜 핀을 연결합니다.
참고 : 배양 용기는 LED 매트릭스 위에 쌓아됩니다. 와이어 리본 용기를 방해하는 경우, 매트릭스에서 그 오프셋. 그 다음, 전기 연결는 CH하지 않도록 매트릭스 핀 와이어 리본 핀 사이의 격차를 고체 심선을 사용플랜지.
4. 소프트웨어 설치 및 하드웨어에 연결
- 마이크로 컨트롤러의 PCB 스택.
- 마이크로 컨트롤러를위한 통합 개발 환경 (IDE) 및 사용자 지정 코드를 다운로드 할 재료 목록에서 링크를 따라.
- AB 범용 직렬 버스 (USB) 케이블을 통해 현미경 시스템 마이크로 컨트롤러를 연결한다. 컴파일 및 마이크로 컨트롤러에 사용자 지정 코드를 업로드 할 수 있습니다.
- 마이크로 매니저 (21), (22)와 피지 (23)를 다운로드 할 수 있습니다. 모든 ".DLL"파일은 "mmplugins"디렉토리를 복사하여 피지 플러그인 및 마이크로 매니저는 "Fiji.app"디렉토리에 다운로드 된 디렉토리에서 "mmautofocus"디렉토리로 마이크로 Manager를 구성합니다. 또한, "Fiji.app/plugins"디렉토리에 "플러그인 / 마이크로 관리자"디렉토리를 복사합니다.
- 은 "BioreactorController.jar"파일 INT 다운로드은 "Fiji.app/mmplugins"디렉토리 오.
- 피지> 플러그인> 마이크로 관리자> 마이크로 관리자 스튜디오에서 열기 마이크로 - 관리자. 현미경을 제어 할 수있는 소프트웨어를 구성하는 하드웨어 구성 마법사를 사용합니다. 구간 USB 케이블이 연결되는 포트의 레이블 마법사의 "FreeSerialPort"장치를 포함합니다.
5. 확인하고 배양 용기의 빛 - 증거 인클로저 특성화
- 배양 용기는 매트릭스 위에 그들에 쉴 수 있도록 LED 매트릭스의 각 모서리에있는 브레드 보드에 빌딩 블록으로 세 8 핀 IC 소켓을 스택.
- 소켓의 상부층 아래 확산 용지의 부분을 고정 상기 LED 매트릭스에서 배양 용기 타격 광 확산 등된다.
- 검은 거품의 일부 "6"세 8 잘라. 제 TW의 내부에서 상기 전자 브레드 같은 크기의 부분 (2.3 "X 3.5")를 잘라O 상기 제 내부에서 IC 소켓에 의해 사각형 (0.9 "X 1.8") 크기의 부분. 0.9 "X 1.8"조리개를 포함하는 최종 층에도 IC 소켓의 상단에 거짓말을하고, LED 매트릭스를 둘러싸 등 LED 매트릭스를 통해 이러한 레이어 스택.
- 6 "24"사각형을 반으로 검은 색 거품의 추가 시트를 잘라. 배양 용기가 열적 및 광학적으로 배양 용기를 절연 할 있도록 튜브와 전선을위한 공간과에 들어갈 수있는 검은 색 거품의 중공 컬럼에이 롤.
- LED가 매트릭스 위에 검은 거품의 중공 열을 중앙에, 그리고 그 아래 검은 거품의 층에 열 경계를 표시합니다. 그것은 미래에 중심을해야하는 곳 경계 표시합니다.
- 검은 거품의 3 "× 3"부분을 잘라. 외부 광을 차단하는 칼럼 상부에 녹화 할 수있는 덮개 등이 나중에 사용.
- 1~ 다이오드의 파워 센서를 장착 전자 테이프와 용기의 뚜껑을 배양, 캡을 부착하고, 인클로저의 배양 용기를 삽입합니다.
- 마이크로 관리자에서 플러그인> 생물 반응기 컨트롤러로 이동합니다. 30 초 간격으로 가능한 농도 범위의 하위 집합에서 조명하는 행렬을 설정합니다.
- 힘 센서에 접속되는 전력 미터 콘솔에 표시되는 광의 강도를 기록한다. 이러한 측정은 이들의 LED로 조명하는 LED의 수 및 펄스 폭 변조 (PWM) 전류가 설정 될 때 광의 강도가 실제 알려질 수있게된다.
6. 배양 용기를 준비합니다
그림 6 : 선박의 연결. 이 도면에있어서의 용기와 배관 전에, 멸균에 접속되어야 하는지를 나타낸다."빈>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 마크 배양 용기에 30 ㎖에 10 ㎖의 범위의 액체의 매 2 mL의 증가에 대응하는 높이. 멸균 증류수 10 ㎖를 넣고 수위 표시, 2 mL를 넣고, 물 레벨을 표시하고, 30 mL의 레벨이 표시 될 때까지 반복한다. 그들은 쉽게 제거되지 않도록 명확한 테이프로 표시 커버, 액체 폐기하십시오.
- 배양 용기에, 실리콘 가스켓을 통해 알루미늄 포트의 긴 끝을 놓습니다. 뚜껑에 나사.
- . 1/16 "ID 실리콘 튜브 한 짧은 알루미늄 구 출구 커버 A 암형 루어 로크를 삽입하고 수형 루어 잠금 플러그를 연결하여 선단을 연결.이 출구 부가하고,도 6 (튜브 (6)를 사용하지 않을 ).
- . 남성과 여성의 루어 잠금 장치와 1/16 "ID 실리콘 튜브의 두 짧은 세그먼트를 연결 짧은 알루미늄 포트 콘센트에 한쪽 끝을 연결하고 dista 연결남성 루어과 여성의 루어 잠금 플러그 리터 끝. 선박이 튜브 (튜브 그림 6에 7 / 7.1)를 통해 접종됩니다.
- ID 연동 튜브 및 커넥터의 "1/16의 끝 부분에 ID 관"이 1/16을 연결합니다. 짧은 알루미늄 포트에 한쪽 끝을 연결하고 (그림 6 관 4) 기타를 연결합니다. 나중에이는 미디어 플라스크에 연결됩니다.
7. 미디어 플라스크를 준비
- 1/16 "가장 긴 알루미늄 포트 내경 (ID) 실리콘 튜브를. 튜브 미디어 플라스크에 도달하기에 충분히 길어야한다. 1/8 연결"연결 1/16의 짧은 세그먼트에 ID 남성 루어 잠금 장치를 " ID 튜브는, 위의 튜브에 연결합니다 ,, 다음 미디어 플라스크 (그림 6 관 (3))의 고무 마개에이 짧은 세그먼트를 삽입합니다.
- 튜브 클램프. 이 연결은 공기가 배양 용기에 미디어 플라스크에서 흘러 할 수 있습니다. 미디어 플라스크 후에 공기 펌핑되면이 튜브는 언 클램프 인 D, 문화는 통기, 혼합하고, 들어오는 거품에 의한 양압으로 유지됩니다.
- 3/16 "ID 튜브에 다음". 미디어 전송됩니다되는 스토퍼,로 플라스크의 바닥에 도달하기에 충분히 긴 ID 튜브 또 다른 1/16 연결 "1/16를 삽입이 하나에 ID 튜브를하고, 그. 3/16 "ID 여성 루어 잠금 및 남성 루어 잠금 플러그 (튜브 그림 6의 1 / 1.1)로이 연결합니다.
- 상기 스토퍼의 세 번째 구멍 말단에 중간 직경의 튜브의 두 세그먼트를 연결 및 연결, 1/16 "ID 튜브의 짧은 부분으로 채워 져야 (관 (2)은도 6 / 2.1). 이것은 연결된다 진공 펌프에 이상 수족관 펌프.
주 : 튜브 용이 고무 마개에 관통 구멍 맞지 않으면 틸팅 튜브의 단부를 잘라. 그 다음, 구멍을 통해 가압되는 경사 단부를 통해 나머지를 당길 수있다.
- 1/16의 세그먼트로 남성 루어 잠금 장치를 삽입 "ID 실리콘 튜브, 다음 단단히 0.022 삽입"ID의 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 튜브를. 별도로, 잠금 장치 (그림 6 관 5) 짧은 알루미늄 포트에 다른 연결 PTFE 관을 따라 1/16 "ID 관. 그런 다음, 스레드 일단 여성 루어 잠금 장치를 연결합니다.
- ID 연동 튜브 및 커넥터 "를 1/50로 ID 실리콘 튜브"노출 1/50를 연결합니다. 여기에, 그들을 교대, 1/50의 3 개의 세그먼트 "ID 튜브와 0.022의 두 세그먼트"ID의 PTFE 튜브를 연결합니다. 1/16 "ID 튜브 (그림 6 튜브 5)를 통해 유출 플라스크에 연결합니다.
- 알루미늄 포트의 두 번째로 긴 관 및 유출 플라스크 타단에 1/16 "ID 실리콘 관의 한쪽 끝을 연결한다.이 알루미늄 튜브는 배양 부피를 설정하고, 초과 배양 배출 용기 (튜브 (8)로 넘쳐
- 30 분 동안 121 ° C, 15 PSI (일반 살균)에서 배양 어셈블리 압력솥.
미디어 플라스크를 진공으로하는 통해 미디어 플라스크에 충전되는 튜브를, 그리고이를 통해 배양 용기에 접종 선단 부분이 오염 된 경우, 그 살균을 나타 내기 위해 제거 될 수 있도록 튜브의 다수의 부분이되는 참고 분절.
9. 미세 유체 채널을 준비
- : 1 비율 9 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)와 경화제를 혼합한다. 드가와 실리콘 마스터 몰드에 붓는다.
- 65 ° C에서 2 시간에 대한 PDMS 경화 후 면도날 마스크로부터 잘라. 이 금형에서 분리 될 때까지 PDMS 주위를 잘라. 아래로 누른 다음 깨지기 쉬운 웨이퍼를 파괴하지 마십시오.
- 채널의 양단에 구멍을 펀치 1.2 mm ID 생검 홀 펀칭기를 사용합니다.
- 플라즈마 본드 커버 유리 (24)에 PDMS.
- 긴 테이프 PDMS의 채널이 알루미늄 프레임에 집중되도록지지 알루미늄 프레임 커버 유리의 종료 후, 65 ° C에서 2 시간 동안 다시 PDMS 굽는다.
10 채우기 미디어 플라스크
그림 7 : 미디어를 추가. 이 그림은 미디어가 미디어 플라스크에 여과 진공해야하는 방법을 보여줍니다. 그것은 미디어가 멸균 유지되도록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 적절한 미디어를 확인합니다. 연속 배양 시스템이 chemostat로서 작동 될 경우, 특정한 제한 영양소 매체를 사용한다.
S. cerevisiae의와 연구를위한 표준 용지 조성의 예는 이전에 25 게시되었습니다 : 주= "외부 참조"> 26, 27, 28, 29. - 다음 멸균 핀셋 진공 필터의 젖꼭지에서 흰색 플러그를 제거, 100 ml의 병에 진공 필터를 부착 젖꼭지 덮개를 제거합니다.
- 꼭지에 3/16 "ID 실리콘 튜브를 연결하고, 진공 펌프로 상기 미디어 플라스크의 다른 자유 관 (튜브 (1)와, 각각도 7의 (2))와, 배양 용기에 미디어 플라스크를 연결하는 튜브 클램프되도록 (그림 7 관 (3))를 종료합니다.
- 미디어와 필터를 작성 진공 펌프를 켠 다음 미디어의 나머지를 필터링 할 수 있습니다. 진공 (그림 7 관 2)에 연결된 1/16 "ID 실리콘 튜브 클램프 및 진공 펌프의 전원을 끄십시오.
- 튜브의 오염되지 않은 끝이 액세스 할 수 있도록 진공 펌프에 연결 1/16 "ID 튜브의 중간 세그먼트에서 leurs를 제거합니다. 일을 삽입이 튜브에 멸균 주사기 에어 필터의 전자 블루 끝.
- 3/16 "ID 실리콘 튜브 (그림 7 관 (1))을 고정하고 여기에서 남성 루어를 분리. 배양 용기의 미디어 입구 관의 여성 루어에서 플러그를 분리합니다. 할 미디어를 사용하려면이 남성과 여성의 luers 연결 배양 용기에 펌핑.
- 진공 필터를 제거하고 진공 필터에 부착 된 매체의 100 ㎖ 병 모자.
- 배양 용기에 접종한다 전날은 이전 단계에서 수집 된 미디어 4 mL를 시험관에 optogenetic 미생물의 단일 콜로니를 접종하고, 30 ° C 또는 배양의 최적 온도의 성장 온도에서 밤새 성장하도록 교반.
11. 현미경 주변 장치를 조립
- 매체가 배양 용기와 efflu보다 플라스크 현미경 근처 연속 배양 조립체 설정0.022 "ID의 PTFE 튜브 (그림 6 튜브 5)의 세그먼트로 구성 튜브 현미경 단계에 도달 할 수 있도록 배양 용기보다 낮은 천만 플라스크. 안전하게 미디어 플라스크 유출 용기의 고무 마개를 테이프.
- (그림 6 관 5)를 연결 ID 실리콘 튜브 0.022의 "1/50에서 ID의 PTFE 튜브 '의 끝을 분리하고, 미세 유체 장치의 입구와 출구에이 끝을 연결합니다.
- 수족관 펌프에 주사기 에어 필터의 흰색 끝을 연결합니다. 공기압 배양 용기에 미디어를 푸시한다.
- 용지 배출 포트의 레벨에 도달 할 때, 상기 고속 주변 1/16 "ID 매체 입구 튜브 및 커넥터 (도 6의 튜브 4) 느린 연동 펌프 주위와 1/50"ID 샘플 출구 튜브 및 커넥터를 래핑 연동 펌프 (그림 6 튜브 5).
- 공기 TU을 언 클램프를 이용해 용지를 공기에 쐬다미디어 플라스크 배양 용기 사이.
- 온도가 제어 될 수 있도록 배양 용기 난로 및 온도계를 테이프입니다. 유입 매체 용기와 동일한 온도에서 수 있도록 배양 용기 주위의 미디어 튜브 코일.
주 : 상기 가열 패드에 PWM 전류 설정치 온도에서 배양 용기 유지 온도계로부터의 입력을 사용하는 마이크로 컨트롤러에 의해 조절된다. - LED가 매트릭스 위에 검은 거품 인클로저로 배양 용기를 삽입 한 튜브가 눌리지 않았는지 확인합니다.
- 마이크로 관리자에서 플러그인> 생물 반응기 컨트롤러로 이동합니다. 증발 속도보다 0.1 필드 "에 미디어 펌프 비율"과 유량이 매우 낮을 것이다 0으로 필드 "에 샘플 펌프 비율",하지만 더 큰를 설정합니다.
- 미디어 플라스크 배양 용기 사이의 유입 공기 튜브를 클램프. 그림에서 접종 튜브 (튜브 7에서 플러그를 제거
- 빛이 입사하지 않도록 인클로저를 커버하고, 문화 하룻밤 성장 할 수 있습니다.
(12) 교정 펌핑 요금
- 마이크로 관리자에서 플러그인> 생물 반응기 컨트롤러로 이동합니다. 0.5 필드 "에 미디어 펌프 비율"과 0 필드 "에 샘플 펌프 비율"을 설정합니다.
- 유출 플라스크 (그림 6 튜브 8) 및 유출 물 플라스크 (그림 6 튜브 8)에서 샘플링 튜브에서 오버플로 튜브를 분리하고 별도의 용기에 유출 물을 수집합니다. 펌프가 15 분 동안 한 후부터 1 시간 동안 폐수를 수집합니다.
- 상기 용기로 수집 된 양의 배양 용기에 미디어의 유량을 계산한다 :
- 이 선형 추정에 의해 필드 "에 미디어 펌프 비율"의 값을 조정합니다 :
어디에
- 원하는 유량과 측정 된 유속의 차이는 유량이 1 시간에 걸쳐 평균화 <0.2 ㎖ / h를 때까지이 교정 과정을 반복.
- 필드 "또는 샘플 율"의 값을 증가시키고, 배양 용기를 떠나는 부피의 약 4/5 번째는 샘플링 펌프에 의해 펌핑 될 때까지 유사한 방식으로 조정하고 부피의 대략 1/5 일 통해 떠나 오버 플로우 포트.
- 연속 배양에있어서, 배양 밀도 밤새 이러한 조건에서 평형을 보자.
주 : 목표 유량에 도달 할 수없는 경우, 변경연동 펌프 튜브. 큰 직경의 튜브가 사용될 때, 액체는 높은 속도로 펌핑된다. 14 단계를 수행 한 후 8.4 단계로 돌아갑니다.
배양 된 미생물의 13 수집 현미경 이미지
- 미세 유체 채널로 펌핑 세포의 이미지가 초점면에있을 것입니다되는 겹치지 않는 위치의 세트와 마이크로 관리자의 스테이지 위치 목록을 입력합니다.
- 은 "생물 반응기 컨트롤러"플러그인을 엽니 다. 프롬프트에서 원하는 LED 매트릭스 시간 코스, 영상 채널 및 기타 실험 설정을 선택합니다. 수집 및 이미지를 분석 할 수 있습니다.
- 실험이 실행되는 동안, 미디어 플라스크에 미디어가 분명히 남아 있는지 확인합니다. 이 흐린 경우, 그 오염되었다.
(14) 후 실험
- 미디어, 여분의 세포 배양 및 폐수 처리하십시오.
- 탈 물과 혼합 20 %의 EtOH 200 mL를 미디어 플라스크 리필. 이전에 한 바와 같이 chemostat을 실행세포 파편 및 미디어를 씻어 실험 기간 동안 실행되었습니다.
- 알코올 용액 미디어 플라스크에서 배출되면 완전히 chemostat를 분해.
- 따뜻한 물과 중성 세제를 유리 튜브를 세척하고, 탈 이온수로 철저히 씻어. 건조 둡니다.
- 실험의 과정을 통해 온도 및 LED 매트릭스 상태를 검토 할 수있는 "microcontrollerRecords.csv"파일을 열고 "Summary.csv"파일은 이미지의 각 세트의 요약 데이터와 검토하는 "결과를 를 .csv" 파일 n은 데이터 세트 n 번째의 각 기간, 각 투자 수익 (ROI)을 요약 데이터를 검토합니다.
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결과
이 장치는 CRY2 / CIB1 단백질 쌍 (30)에 기초하여 유도 optogenetic 전사 시스템을 통해 푸른 빛의 질문에 답변 노란색 형광 단백질 (YFP)를 표현하는 S. cerevisiae의 문화를 자극하기 위해 사용되었다. 세포를 0.2 ± 0.008 평균 희석 속도 포스페이트 한정 배지에서 배양 하였다 chemostatically. 인산 제한은 일반적으로 성장 속도를 제어하는 S. 세레 비지 chemostat 실험에 사용되는 인산 제한의 효과는 잘 특징으로한다. 31 (32)는 연속적으로 희석 된 배양 용기 (33)로부터 유출 물은 거꾸로 현미경에서 미세 유체 소자로 샘플링 하였다. 도 8에
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토론
우리는 마음의 유연성이 장치를 설계했습니다. 사용 된 모든 코드는 무료이며 오픈 소스입니다. 세그먼트 셀 기본 이미지 분석 과정은 간단하고 신속하게 실행. 사용자 분석, 피지 그래픽 유저 인터페이스로 대표 화상을 분석하는으로 Beanshell 스크립트 입력을 변환하고 스크립트를 호출하는 플러그인을 설정하는 동안 사용자 입력을 기록함으로써 구현 될 수있다. 이 호출 될 때,이 스크립트는 배경-감산 이미지의 가장 최근의 세트에 파일 경로를 포함하는 "이미지"라는 문자열 배열을 전송됩니다. 이미지 데이터는 실험이 갑자기 끝나는 경우가 손실되지 않도록 수집로 저장됩니다. 블루 LED 어레이 우리 optogenetic 시스템을 유도하는 선택되었다 있지만 다른 색의 LED로 교체 될 수있다. 쉽게 만드는 PCB에 추가적인 MOSFET 스위치 및 릴레이 스위치 용 마이크로 컨트롤러뿐만 아니라 관통 구멍을 사용 가능한 추가 입력 및 출력 핀이있다이 시스템에 대해 좀 더 복잡한 용도에 적합합니다. 예를 들면, LED에 전력을...
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는 도움이 토론과 편집을위한 프로토콜, 키 에런 스위니 테스트에 도움이 몰리 라자 베로니카 델가도를 인정, 그리고 원고의 중요한 읽기 테일러 스콧, 내 한 - adirekkun, 그리고 스테파니 겔러 것이다. 메건 니콜 소매점을, 박사 버로우즈 웰컴 기금에서 과학 인터페이스에서 경력 상을 보유하고있다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 광범위한 랩 매뉴얼 | GitHub | NA | 정기적으로 업데이트되는 광범위한 랩 매뉴얼은 " 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). 여기에는 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되는 미세유체 주형에 대한 설명도 포함됩니다. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | .fzz 유형 회로 기판 설계를 보고 편집할 수 있는 무료 오픈 소스 소프트웨어는 "http://fritzing.org/download/" |
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| 중간 유량 가변 흐름 연동 펌프 | Fisher Scientific | 13-876-2 | 펌핑 배양용. 1개 필요. |
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| Micromanager | Micromanager | NA | 무료 오픈 소스 현미경 제어 소프트웨어는 "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | 무료 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어는 "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | 에서 사용할 수 있습니다.무료 오픈 소스 IDE는 "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| 사용자 지정 코드 | GitHub | NA | 지정 마이크로 컨트롤러 코드 및 "Bioreactor Controller" 플러그인은 " 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB 케이블 A to B - 6 | SparkFun Electronics | CAB-00512 | 마이크로컨트롤러에 데이터를 다운로드하는 데 사용됩니다. 1개가 필요합니다. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | CSV 파일에서 LED 매트릭스 값을 로드하는 장점은 플러그인에서 프로그램을 호출하여 이미지 분석 결과에 따라 해당 값을 업데이트할 수 있고 해당 값을 마이크로 컨트롤러에 다시 로드하여 피드백 제어를 가능하게 할 수 있다는 것입니다. 에서 사용할 수 있습니다. 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (확산지) | B& H | B& H # LOFSFTL MFR # T1-72 | LED 매트릭스용. 1이 필요합니다. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | 용기 인클로저 배양을 위한 검은색 폼. 4개 필요. |
| 표준 포토다이오드 파워 센서, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | 광도 측정용. 1 필요. |
| 라벨링 테이프 | Fisher Scientific | 159015N | 느슨한 구성 요소에 라벨을 부착하고 고정합니다. 1 필요. |
| 소형 전력 및 에너지 미터 콘솔, 디지털 4인치 LCD | Thorlabs | PM100D | 광도 측정용. 1 필요. |
| 100 mL GL45 혼성화 유리 병 | 벨코 글라스 주식회사 | (7910-40150) | 생물반응기 용기. 1개 필요. |
| 6포트 어셈블리 | Bellco Glass, Inc. | 맞춤형 | 생물 반응기 용기의 경우. 튜빙 사양 : .125 "OD x .055"ID. 포트 A : 캡 슬러그 위와 튜브 바닥까지 1.0 인치. 포트 B,C,E,F: 캡 슬러그 위 길이 1.0인치, 아래 길이 33mm. 포트 D: 캡 슬러그 위 1.0" 길이, 65 mm 한참 아래에. 1개가 필요합니다. 45mm 직경의 폴리프로필렌 오픈 탑 스크류 캡과 흰색 실리콘 가스켓이 포함되어 캡과 용기 사이의 밀착 밀봉을 보장합니다. |
| 스카치 매직 테이프 3105, 3/4 x 300인치, | 아마존 | B0009F3P3U | 클리어 스카치 테이프 3개 팩. 이것은 다른 많은 공급업체에서 사용할 수 있습니다. 배양 용기의 표시를 덮고 PDMS 채널이 있는 커버 유리를 알루미늄 지지 프레임에 고정하는 데 사용됩니다. |
| 1/16 "ID x 3/16"OD x 1/16 "벽 Tygon 위생 실리콘 튜브 | 미국 플라스틱 주식 회사 | 57288 | 튜빙. ~25' 필요. |
| Cole-Parmer Twistit 흰색 고무 마개, 크기 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | 미디어 플라스크 마개 및 유출 플라스크 마개. 2 필요. |
| 2L 실험실용 플라스크 | Pyrex | 4980 | 미디어 플라스크 및 폐수 플라스크 2개 필요. |
| 데이 핀치콕 | Fisher Scientific | 5867 | 핀치 튜브 닫힘용. 3 필요. |
| 교체용 튜빙 어셈블리 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | 연동 펌프는 튜브 세트와 함께 제공되지만 몇 주 동안 사용하면 마모됩니다. |
| 교체용 튜빙 어셈블리 1/50" ID | 추적 가능 제품 | 3371 | 연동 펌프는 튜브 세트와 함께 제공되지만 몇 주 동안 사용하면 마모됩니다. |
| 잠금 링이 있는 수 루어 x 1/16" 호스 미늘, 나일론, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | 커넥터.~10개의 루어가 필요합니다. |
| 잠금 링이 있는 수 루어 x 1/8" 호스 미늘, 나일론, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | 커넥터. 5개가 필요하며, 튜브로 채우기 위해 각 고무 마개 구멍에 하나씩 필요합니다. |
| 암 루어 x 1/16" 호스 미늘 어댑터, 나일론, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | 커넥터.~10개의 루어가 필요합니다. |
| 암 luer x 3/16" 호스 미늘 어댑터 | Cole-Parmer | EW-45502-08 | 커넥터.~10개의 루어가 필요합니다. |
| Cole-Parmer Luer 액세서리, 여성 Luer Cap, 나일론, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer 액세서리, 남성 Luer Lock Plug, 나일론, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| 마이크로보어 PTFE 튜빙, 0.022"ID x 0.042"OD, 100ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | 튜빙. 1롤이 필요합니다. |
| Masterflex 백금 경화 실리콘 튜빙, L/S 13, 25피트 | Cole-Parmer | EW-96410-13 | 튜빙.~25'가 필요합니다. |
| 3/16 "ID x 1/4"OD x 1/32 "벽 Tygon 위생 실리콘 튜브 | 미국 플라스틱 주식 회사 | 57293 | 튜빙. ~1' 필요. |
| 진공 필터 | Fisher Scientific | 974107 멸균 여과 매체용 Nalgene 진공 필터. | |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | 듀얼 다이어프램 조절 가능한 플로우 에어 펌프는 공기 조절 및 혼합 매체를 위한 것입니다. 1개 필요. |
| 0.2 &무; m 기공 주사기 필터 | Corning International | 431229 | 이것은 수족관 펌프의 공기가 장치를 오염시키지 않도록 합니다. 1 필요. |
| Slygard 184 실리콘 엘라스토머 키트 | Dow Corning | Slygard 184 | 미세유체 장치용. 1 필요. |
| American Safety Razor GEM Scientific 단일 가장자리 면도날 | Fisher Scientific | 17989000 | 튜브 및 PDMS 절단용. 1개의 블레이드가 필요합니다. |
| Harris Uni-Core 홀 펀처 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | 미세유체 장치의 입구/출구 펀칭용. 1개 필요. |
| 현미경 커버 유리 22x60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | 미세유체 장치용. 1개 필요. |
| 정사각형 창이 있는 직사각형 알루미늄 프레임, | 맞춤형 | 사용자 정의 | , 미세유체 채널을 지원합니다. 외부 치수: 3 인치 x 1.25 인치. 내부 치수(잘라낸 부분): 7/8 인치 x 7/8 인치 두께: ~1/32 인치 |
참고문헌
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