미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Summary

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

Abstract

Optogenetic 시스템은 세포 과정을 변경하는 빛의 특정 파장에 대한 응답으로 형태를 변경 유전자 인코딩 된 단백질을 사용한다. optogenetic 조명 시스템의 프로그래밍 및 자극을 탑재 되 배양 시스템 및 측정이 필요하다. 우리 구축 광의 프로그래밍 용량과 균체를 조명하고, 자동으로 획득하고 유출 셀의 이미지를 분석하는 연속 배양 장치를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. chemostat 등이 장치의 동작은 성장 속도와 셀룰러 환경이 엄격하게 제어 될 수있다. 연속 세포 배양의 유출 물을 주기적으로 샘플링하고, 세포를 다 채널 현미경으로 이미지화된다. 형광 강도 배양 유출 물로부터 샘플링 된 세포의 세포 형태의 동적 응답이 여러 날에 걸쳐 측정되도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전히 자동화사용자 입력없이. 우리가 동적으로 전사를 활성화 optogenetic 시스템 설계 사카 세레 비지에 균주에서 단백질 생산을 유도하여 배양 장치의 유용성을 입증한다.

Introduction

Optogenetic 시스템은 유전자 발현, ^{1, 2, 3, 4, 5} 단백질 지역화 ^육 단백질 활성, ^{6, 7, 8,} 단백질 결합, ^{8, 9, 10,} 단백질 분해 등의 세포 과정의 성장 목록을 제어하는 광을 사용한다. 프로그래밍 광 자극으로 제어 된 환경에서 세포를 배양하고, 생물학적으로 중요한 시간 척도에 걸쳐 반응을 측정하기위한 방법 ^(11)은 세포 생물학 및 생명 공학 연구를 위해 이러한 도구의 전위를 이용하는 것이 필요하다. 우리의 방법은, AE, 잘 혼합에 일정한 세포의 성장 속....

Protocol

그림 1 : 연속 배양 장치. 이 개략도는 상기 장치는 조명, 배양에 사용하는 경우 조립 및 미생물의 광학 특성을 측정되어야하는지 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 프로토콜의 개요. 음영 영역의 단계는 프로토콜을 사용할 때마다 반복되어야한다. 폐쇄 루프 제어가 가능 ^{(34)이지만,이} 프로토콜 구현되어 있지 않습니다.

Results

이 장치는 CRY2 / CIB1 단백질 쌍 ^(30)에 기초하여 유도 optogenetic 전사 시스템을 통해 푸른 빛의 질문에 답변 노란색 형광 단백질 (YFP)를 표현하는 S. cerevisiae의 문화를 자극하기 위해 사용되었다. 세포를 0.2 ± 0.008 평균 희석 속도 포스페이트 한정 배지에서 배양 하였다 chemostatically. 인산 제한은 일반적으로 성장 속도를 제어하는 S. 세레 비지 chemostat 실험에 사용되는 인산 제한의 효과는 잘 특징으로한다. ^{31 (32)는} 연속적으로 희석 된 배양 용기 ^{(33)로부터} 유출 물은 거꾸로 현미경에서 미세 유체 소자로 샘플링 하였다. 도 8에

Discussion

우리는 마음의 유연성이 장치를 설계했습니다. 사용 된 모든 코드는 무료이며 오픈 소스입니다. 세그먼트 셀 기본 이미지 분석 과정은 간단하고 신속하게 실행. 사용자 분석, 피지 그래픽 유저 인터페이스로 대표 화상을 분석하는으로 Beanshell 스크립트 입력을 변환하고 스크립트를 호출하는 플러그인을 설정하는 동안 사용자 입력을 기록함으로써 구현 될 수있다. 이 호출 될 때,이 스크립트는 배경-감산 이미지의 가장 최근의 세트에 파일 경로를 포함하는 "이미지"라는 문자열 배열을 전송됩니다. 이미지 데이터는 실험이 갑자기 끝나는 경우가 손실되지 않도록 수집로 저장됩니다. 블루 LED 어레이 우리 optogenetic 시스템을 유도하는 선택되었다 있지만 다른 색의 LED로 교체 될 수있다. 쉽게 만드는 PCB에 추가적인 MOSFET 스위치 및 릴레이 스위치 용 마이크로 컨트롤러뿐만 아니라 관통 구멍을 사용 가능한 추가 입력 및 출력 핀이있다이 시스템에 대해 좀 더 복잡한 용도에 적합합니다. 예를 들면, LED에 전력을.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
광범위한 랩 매뉴얼	GitHub	NA	정기적으로 업데이트되는 광범위한 랩 매뉴얼은 " 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). 여기에는 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되는 미세유체 주형에 대한 설명도 포함됩니다.
Fritzing Design Viewer	Fritzing	NA	.fzz 유형 회로 기판 설계를 보고 편집할 수 있는 무료 오픈 소스 소프트웨어는 "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - 조립)	Adafruit	50	. 1 필요.
Arduino 적층형 헤더 키트SparkFun	Electronics	10007	PCB를 마이크로컨트롤러에 연결하기 위한 암 핀 헤더입니다.1개 필요.
조정 가능한 30W 110V 납땜 인두 - XY-258 110V	Adafruit	180	PCB에 전기 연결을 위해 사용됩니다. 1 필요.
납땜 인두 스탠드	Adafruit	150	PCB에 전기 연결을 위한 것입니다. 1이 필요합니다.
미니 솔더 스풀 - 60/40 리드 로진 코어 솔더 0.031" 직경 - 100g	Adafruit	145	PCB에 전기 연결을 하기 위해. 1 필요.
0.1 &뮤; F 커패시터	SparkFun Electronics	COM-08375	PCB의 전압을 안정화합니다. 1이 필요합니다.
10 &뮤; F 커패시터	SparkFun Electronics	COM-00523	PCB의 전압을 안정화합니다. 1이 필요합니다.
MAX7219CNG LED 매트릭스/디지트 디스플레이 드라이버 - MAX7219	Maxim	MAX7219CNG	LED 드라이버. 1개 필요.
8핀 IC 소켓	마우저 전자	575-144308	16 필요. 이들은 LED 매트릭스 위의 배양 용기를 지지하기 위해 서로 겹쳐서 쌓일 것입니다.
24핀 IC 소켓	마우저 전자	535-24-3518-10	옵션. 이를 사용하여 MAXIM 7219CNG 드라이버를 PCB에 역방향으로 연결할 수 있습니다.
디지털 멀티미터	Adafruit	2034	전자 제품 문제 해결용. 1 필요.
40핀 수(긴 중심, PTH, 0.1")	SparkFun Electronics	PRT-12693	수 핀 헤더입니다. 끝은 와이어 커터로 트리밍할 수 있습니다. 1 세트가 필요합니다.
플러시 대각선 와이어 커터	Adafruit	152	긴 핀 헤더를 트리밍하고 전원 케이블을 절단합니다. 1 필요.
프리미엄 여성/여성 점퍼 와이어 - 40 x 12" (300mm)	Adafruit	793	와이어 리본. 더 길기 위해 수 핀 헤더와 종단 간 연결할 수 있습니다. 1개가 필요합니다.
절반 크기 브레드보드	Adafruit	64	LED 매트릭스가 여기에 연결되고 배양 용기가 그 위에 놓입니다.
미니어처 8x8 블루 LED 매트릭스	Adafruit	956	광원. 주요 파장은 470nm(파란색)입니다. 1개가 필요합니다. 동일한 공급업체의 대체 미니어처 LED 매트릭스는 624nm(빨간색), 588nm(노란색), 525nm(녹색), 572nm(황록색) 및 흰색의 주요 파장으로 제공됩니다.
적층 가능한 헤더-3핀	SparkFun Electronics	13875	8이 필요합니다.
저항기 키트 - 1/4W (총 500개)	SparkFun Electronics	10969	전자제품용. 1개 필요.
IRL520N MOSFET	International Rectifier	IRL520N	DC 전류 제어를 위한 전압 조절 스위치. 4 필요.
훅업 와이어 - 구색(솔리드 코어, 22 AWG)	SparkFun Electronics	PRT 11367	전자 제품용 와이어. 1개 필요.
5V 2A(2000mA) 스위칭 전원 공급 장치 - UL 인증	Adafruit	276	가열 패드 및 Arduino용 전원 공급 장치. 2개 필요.
12 VDC 1000mA 조절 스위칭 전원 어댑터 - UL 인증	Adafruit	798	연동 펌프용. 2개 필요.
전기 가열 패드 - 10cm x 5cm	Adafruit	1481	생물반응기 가열용. 1개 필요.
저유량 가변 흐름 연동 펌프	Fisher Scientific	13-876-1	펌핑 매체용. 1개 필요
중간 유량 가변 흐름 연동 펌프	Fisher Scientific	13-876-2	펌핑 배양용. 1개 필요.
9 VDC 1000mA 정격 스위칭 전원 어댑터 - UL 인증	Adafruit	63	마이크로컨트롤러 전원 공급 장치용. 주문 1.
고온 방수 DS18B20 디지털 온도 센서 + 생물	엑스트라 Adafruit	642	온도계. 1 필요.
Micromanager	Micromanager	NA	무료 오픈 소스 현미경 제어 소프트웨어는 "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI	ImageJ	NA	무료 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어는 "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment	Arduino	NA	에서 사용할 수 있습니다.무료 오픈 소스 IDE는 "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
사용자 지정 코드	GitHub	NA	지정 마이크로 컨트롤러 코드 및 "Bioreactor Controller" 플러그인은 " 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB 케이블 A to B - 6	SparkFun Electronics	CAB-00512	마이크로컨트롤러에 데이터를 다운로드하는 데 사용됩니다. 1개가 필요합니다.
bioreactorTimecourse_example.csv	GitHub	NA	CSV 파일에서 LED 매트릭스 값을 로드하는 장점은 플러그인에서 프로그램을 호출하여 이미지 분석 결과에 따라 해당 값을 업데이트할 수 있고 해당 값을 마이크로 컨트롤러에 다시 로드하여 피드백 제어를 가능하게 할 수 있다는 것입니다. 에서 사용할 수 있습니다. 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (확산지)	B& H	B& H # LOFSFTL MFR # T1-72	LED 매트릭스용. 1이 필요합니다.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in	Grainger, inc	20JL37	용기 인클로저 배양을 위한 검은색 폼. 4개 필요.
표준 포토다이오드 파워 센서, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW	Thorlabs	S120VC	광도 측정용. 1 필요.
라벨링 테이프	Fisher Scientific	159015N	느슨한 구성 요소에 라벨을 부착하고 고정합니다. 1 필요.
소형 전력 및 에너지 미터 콘솔, 디지털 4인치 LCD	Thorlabs	PM100D	광도 측정용. 1 필요.
100 mL GL45 혼성화 유리 병	벨코 글라스 주식회사	(7910-40150)	생물반응기 용기. 1개 필요.
6포트 어셈블리	Bellco Glass, Inc.	맞춤형	생물 반응기 용기의 경우. 튜빙 사양 : .125 "OD x .055"ID. 포트 A : 캡 슬러그 위와 튜브 바닥까지 1.0 인치. 포트 B,C,E,F: 캡 슬러그 위 길이 1.0인치, 아래 길이 33mm. 포트 D: 캡 슬러그 위 1.0" 길이, 65 mm  한참 아래에. 1개가 필요합니다. 45mm 직경의 폴리프로필렌 오픈 탑 스크류 캡과 흰색 실리콘 가스켓이 포함되어 캡과 용기 사이의 밀착 밀봉을 보장합니다.
스카치 매직 테이프 3105, 3/4 x 300인치,	아마존	B0009F3P3U	클리어 스카치 테이프 3개 팩. 이것은 다른 많은 공급업체에서 사용할 수 있습니다. 배양 용기의 표시를 덮고 PDMS 채널이 있는 커버 유리를 알루미늄 지지 프레임에 고정하는 데 사용됩니다.
1/16 "ID x 3/16"OD x 1/16 "벽 Tygon 위생 실리콘 튜브	미국 플라스틱 주식 회사	57288	튜빙. ~25' 필요.
Cole-Parmer Twistit 흰색 고무 마개, 크기 10	Cole-Parmer	EW-62992-32	미디어 플라스크 마개 및 유출 플라스크 마개. 2 필요.
2L 실험실용 플라스크	Pyrex	4980	미디어 플라스크 및 폐수 플라스크 2개 필요.
데이 핀치콕	Fisher Scientific	5867	핀치 튜브 닫힘용. 3 필요.
교체용 튜빙 어셈블리 1/16" ID	Traceable Products	3372	연동 펌프는 튜브 세트와 함께 제공되지만 몇 주 동안 사용하면 마모됩니다.
교체용 튜빙 어셈블리 1/50" ID	추적 가능 제품	3371	연동 펌프는 튜브 세트와 함께 제공되지만 몇 주 동안 사용하면 마모됩니다.
잠금 링이 있는 수 루어 x 1/16" 호스 미늘, 나일론, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-00	커넥터.~10개의 루어가 필요합니다.
잠금 링이 있는 수 루어 x 1/8" 호스 미늘, 나일론, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-04	커넥터. 5개가 필요하며, 튜브로 채우기 위해 각 고무 마개 구멍에 하나씩 필요합니다.
암 루어 x 1/16" 호스 미늘 어댑터, 나일론, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-00	커넥터.~10개의 루어가 필요합니다.
암 luer x 3/16" 호스 미늘 어댑터	Cole-Parmer	EW-45502-08	커넥터.~10개의 루어가 필요합니다.
Cole-Parmer Luer 액세서리, 여성 Luer Cap, 나일론, 25/Pk	Cole-Parmer	SC-45502-28
Cole-Parmer Luer 액세서리, 남성 Luer Lock Plug, 나일론, 25/Pk	Cole-Parmer	EW-45505-56
마이크로보어 PTFE 튜빙, 0.022"ID x 0.042"OD, 100ft/roll	Cole-Parmer	EW-06417-21	튜빙. 1롤이 필요합니다.
Masterflex 백금 경화 실리콘 튜빙, L/S 13, 25피트	Cole-Parmer	EW-96410-13	튜빙.~25'가 필요합니다.
3/16 "ID x 1/4"OD x 1/32 "벽 Tygon 위생 실리콘 튜브	미국 플라스틱 주식 회사	57293	튜빙. ~1' 필요.
진공 필터	Fisher Scientific		974107 멸균 여과 매체용 Nalgene 진공 필터.
Aquel Oxy-Boost 200	Rena Aquatic Supply	AP200	듀얼 다이어프램 조절 가능한 플로우 에어 펌프는 공기 조절 및 혼합 매체를 위한 것입니다. 1개 필요.
0.2 &무; m 기공 주사기 필터	Corning International	431229	이것은 수족관 펌프의 공기가 장치를 오염시키지 않도록 합니다. 1 필요.
Slygard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Dow Corning	Slygard 184	미세유체 장치용. 1 필요.
American Safety Razor GEM Scientific 단일 가장자리 면도날	Fisher Scientific	17989000	튜브 및 PDMS 절단용. 1개의 블레이드가 필요합니다.
Harris Uni-Core 홀 펀처 1.2mm ID	Sigma-Aldrich	WHAWB100028 ALDRICH	미세유체 장치의 입구/출구 펀칭용. 1개 필요.
현미경 커버 유리 22x60-1.5	Fisher Scientific	12-544-G	미세유체 장치용. 1개 필요.
정사각형 창이 있는 직사각형 알루미늄 프레임,	맞춤형	사용자 정의	, 미세유체 채널을 지원합니다. 외부 치수: 3 인치 x 1.25 인치. 내부 치수(잘라낸 부분): 7/8 인치 x 7/8 인치 두께: ~1/32 인치