Introduction
الصرع هو اضطراب عصبي المشترك الذي تحدث النوبات المتكررة طوال عمر المريض. معظم تكرار الصرع يمكن السيطرة عليها تماما من قبل العقاقير المضادة للصرع (صرع). ومع ذلك، حوالي 30٪ من مرضى الصرع تطوير صهر الصرع 1. أسباب الصرع اضطرابات النوم، والتي يمكن أن تزيد من تفاقم تكرار. يوضح دليل على أن الصرع قد إما تعطيل النوم في الليل أو قد يسبب الإفراط 2،3 النعاس خلال النهار. تشير دراساتنا السابقة أيضا أن الصرع التي تحدث في وقت zeitgeber (ZT) 0، أي بداية الفترة الخفيفة في ضوء: دورة الظلام، ويقلل من النوم، هذا هو بوساطة بين الافراج عن القشرية هرمون (CRH)، وهو عامل التماثل الساكن. الصرع في ZT13 (بداية الفترة المظلمة) يعزز التعبير عن عامل التماثل الساكن آخر، انترلوكين 1 (IL-1)، مما يزيد من النوم. يتم تغيير النوم ايقاعات كل يوم عندما يحدث الصرع في ZT6، وسطفترة الخفيفة 4،5. من ناحية أخرى، مشاكل في النوم يزيد من تفاقم تطور وتكرار الصرع 6. استنادا إلى الأدلة المذكورة أعلاه، ونحن نحاول تكشف عن الطريقة العلاجية الأمثل للسيطرة على الصرع في وقت واحد ومنع اضطرابات النوم لدى مرضى الصرع. لقد وجدنا سابقا أن الكهربائي (EA) مع تردد التحفيز 10 هرتز، حيث يتم تسليم كمية معينة من التيار في نقاط الوخز من خلال إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ، بنجاح يقمع مخطط كهربية قشر الدماغ (ECoG) الأنشطة الصرع واضطرابات النوم التي يسببها مرض الصرع 7 . EA مع تردد التحفيز 100 هرتز يزيد من تدهور الأنشطة الصرع واضطرابات النوم في الفئران 8،9. هذه التجربة الناجحة تعتمد على ثلاثة عوامل: أولا، نموذج حيواني الصرع ممكنا. ثانيا، طريقة لتسجيل النوم والتحليل في القوارض. وثالثا، ودقة الأداء من الوخز بالإبر ودقة locati نقاط الوخزالإضافات.
وقد تم تصنيف الصرع إلى نوعين رئيسيين: الصرع البؤري والصرع المعمم. ونحن مهتمون في التنسيق الصرع الفص الصدغي (TLE)، الصرع المعمم، حالة صرعية (جنوب شرق)، وتكرار الصرع المعمم من تلقاء أنفسهم. لذلك، يتم تطبيق التلاعب مختلفة لخلق نماذج الصرع مناسبة لتجاربنا. لإنشاء TLE البؤري، وتدار على جرعة منخفضة من بيلوكاربين في النواة المركزية تبقى من اللوزة (CEA). للتحقق من هذا النموذج، يتم زرع ستة أقطاب ECoG على أمامي (F1 و F2)، الجدارية (P1 و P2)، والقذالي (O1 و O2) شحمات في كل من اليسار ونصفي الكرة الأرضية المناسبة، واثنين من أقطاب المرجعية آخر (R1 & R2) وتوضع فوق المخيخ في كل من نصفي الكرة الأرضية. يتم زرع قنية إضافية دليل حقن مكروي جراحيا إلى اليسار CEA (ا ف ب، 2.8 ملم من bregma، ML، 4.2 مم؛ DV، 7.8 مم مقارنة bregma). يتم تكييفها الإحداثيات من باكينوس وWatson الفئران أطلس 10. إذا هو فعل وTLE البؤري بنجاح، إلا أن تسجيل من القطب على اليسار القشرة الجدارية (P1)، التي تقع بالقرب من CEA الأيسر، يجب الحصول على ECoGs صرعي المهيمنة، مع عدم وجود ECoGs صرعي أهمية المسجلة من أقطاب ECoG أخرى. داخل الصفاق (IP) حقن بيلوكاربين في الفئران لحث على تعميم الصرع وSE، ولكن هذا يمكن أن تكون قاتلة. خمس حقن الملكية الفكرية من بنتيلين تترازول (PTZ) مع فاصل زمني ليوم واحد بين كل حقنة لحث بنجاح الصرع المعمم عفوية في الفئران، وكذلك ضمان بقاء الفئران. وزرع قطبين سلك ECoG في الجبهي والجداري القشور في الفئران لاستقبال اشارات ECoG والتحقق من الصرع المتكررة من تلقاء أنفسهم.
دراسة النوم (باريس سان جيرمان) هو أسلوب شامل لتسجيل التغيرات الفسيولوجية التي تحدث أثناء النوم، وأنه يمكن تصنيف موضوعي النوم إلى مراحل مختلفة من الحركة غير العين السريعة (NREM) و rحركة العين APID (REM) النوم. باريس سان جيرمان يسجل المعلمات من وظائف الجسم، بما في ذلك موجات الدماغ (الكهربائي، EEG)، حركات العين (electrooculogram، EOG)، نغمات العضلات والهيكل العظمي (كهربية، EMG)، ضربات القلب (تخطيط القلب، تخطيط القلب)، ومستويات الأكسجين في الدم والمعلمات في الجهاز التنفسي. في الفئران، نسجل ECoGs، EMGS، ودرجة الحرارة القشرية، والنشاط الحركي لتصنيف الدول اليقظة في اليقظة والنوم NREM، والنوم REM. يتم إجراء تحليل النوم في الفئران باستخدام ECoGs، EMGS، والنتائج النشاط الحركي. يتم زرع جراحيا الفئران مع ثلاثة ECoG المسمار الأقطاب في الجبهي، الجداري، والقشور المخيخ المقابل عن طريق الجراحة التجسيمي. وأجرى تقرير ما بعد الاستحواذ على الدول اليقظة (اليقظة والنوم NREM، والنوم REM) وفقا لمعايير تم الحصول عليها من ECoGs، EMG، درجة حرارة الدماغ، والنشاط الحركي. ووصف معايير مفصلة لتصنيف سلوك الحيوان في كل من الجرذان والفئران في تيكان البروتوكول.
تحتاج إلى تخدير مع جرعة منخفضة من zoletil (25 ملغ / كلغ)، وهو نصف جرعة التخدير تدار عادة أثناء الجراحة التجسيمي، قبل تنفيذ الوخز بالإبر اليدوي أو EA كل من الجرذان والفئران. هذه الجرعة تسمح الحيوانات ليستيقظ 30-35 دقيقة بعد الحقن. يتم تنفيذ أي من الوخز بالإبر اليدوي أو EA في بداية الفترة المظلمة، مع فترة زمنية ثابتة لمدة 30 دقيقة، ويتم التعامل كل حيوان على التوالي لمدة يومين أو ثلاثة أيام. يتم تسليم تحفيز التيارات EA في نقاط الوخز خاص من خلال إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ التي يتم إدراجها في نقاط الوخز. التيار التحفيز هو قطار من النبضات مربع ثنائي الطور، التي مدة النبضة 150 م وكثافة التحفيز هو 1 مللي أمبير. إذا تم استخدام إبرة الوخز بالإبر الجافة لاليدوي، وإبرة في نقاط الوخز ورفت 10 مرات كل 5 دقائق. الجزء الصعب من الوخز بالإبر اليدوي أو EA هو إضفاء الطابع المحلي على نقاط الوخز في القوارض. في الموضعأوجه من نقاط الوخز في الجرذان أو الفئران مشابه لموقع تشريحي في البشر. على سبيل المثال، توجد نقاط الوخز Fengchi الثنائية 3 ملم بعيدا عن الخلفية خط الوسط على الرقبة، وبين آذان اثنين، والذي يشبه إلى موقع تشريحي في البشر 11. وعلاوة على ذلك، فإن نقاط الوخز مع مقاومة منخفضة على الجلد ويمكن زيادة مؤكدة. الشام الوخز بالإبر أو EA صورية التلاعب ضروري لالوخز بالإبر أو التجارب EA. يجب أن يتم تنفيذ الوخز بالإبر الشام أو EA صورية في غير نقاط الوخز، وتقع على مقربة من نقاط الوخز، مثل بالقرب من الإبط 12.
للتحقيق بنجاح آثار الوخز بالإبر أو EA على الصرع واضطرابات النوم التي يسببها مرض الصرع، ويجب أن تكون العوامل التالية في مكان: نموذج ممكنا الصرع الحيوان، وتحليل دقيق للECoGs صرعي وتكرار الصرع، وهي طريقة لتصنيف الدول اليقظة ، ودقة الأداء الوخز بالإبر أو EA في القوارض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة تايوان الوطنية.
1. التجسيمي جراحة لزرع ECoG أقطاب، EMG الأقطاب الكهربائية، والدماغ الحرارية المقاوم، وحقن دليل قنية
- بالنسبة للفئران (250-350 غرام، البالغ من العمر 8 أسابيع 6- للفئران سبراغ داولي)
- تخدير الفئران عن طريق الحقن IP مع 50 ملغ / كغ zoletil. تأكيد عمق مناسب من التخدير خلال مراقبة عدم استجابة بعد معسر مخلب هند. تطبيق مرهم العين، حلق الفراء، وتعقيم الجلد مع محلول البوفيدون اليود و 75٪ من الإيثانول. حقن مضاد حيوي (البنسلين G) للوقاية من العدوى.
- إعداد المشارط، مقص، المرقأة، الشاش، وآلة الكي لعملية جراحية. تعقيم العتاد الجراحية والشاش بواسطة الأوتوكلاف والكي بنسبة 75٪ من الإيثانول.
- وضع شريط الأذن في قناة الأذن وجبل الفئران إلى stereotaxis.
- عن طريقمشرط، وجعل تقريبي 2 سم شق خط الوسط على الجمجمة على طول الخط الفاصل بين اثنين من آذان، والانتقال caudally. مقطع اللوحات الجلد مع المرقأة لفضح الجمجمة وإزالة الأنسجة على الجمجمة باستخدام مشرط.
- حفر ثمانية ثقوب (F1، F2، P1، P2، O1، O2، R1، و R2)، كل ما يقرب من 0.7 مم في القطر، وعلى الجمجمة مع أداة دوارة. المسمار ثمانية أقطاب ECoG على الجبهي، الجداري، والفص القذالي والمخيخ في كل من اليسار واليمين نصفي الكرة الأرضية. وتستخدم هذه الأقطاب الكهربائية للكشف عن الصرع البؤري.
- استخدام الإحداثيات التالية للتسجيل أقطاب: أمامي (F1 و F2): +2.0 ملم الأمامي إلى bregma و+2.5 مم من خط الوسط، الجدارية (P1 و P2): -2.0 ملم الأمامي إلى bregma و+3.0 مم من خط الوسط والقذالي (O1 و O2): -5.5 ملم الأمامي إلى bregma و+3.0 مم من خط الوسط.
- وضع اثنين من أقطاب المرجعية (R1 و R2) على المخيخ (-11.0 ملم الأمامي إلى bregma و+4.0 ملم من midliشمال شرق).
- في مجموعات منفصلة من الفئران، وحفر ثلاثة ثقوب ووضع قطبين EEG المسمار على الجبهي الأيمن (F2) والفص الجداري (P2) من القشور مع الإحداثيات نفسها كما هو موضح في الخطوة 1.1.5.1. وضع القطب الكهربائي EEG الثالث على المخيخ الأيسر (R1)، والذي يعمل على الأرض والحيوان والحد من التحف إشارة. وتستخدم هذه الأقطاب الكهربائية لتأكيد الصرع المعمم وتحليل مراحل اليقظة.
- فصل جلد الرقبة والعضلات وادخال اثنين من الأقطاب الكهربائية EMG في عضلة الرقبة.
- حفر ثقب آخر في الجمجمة ووضع قنية دليل microinjection في الأيسر CEA (ا ف ب، 2.8 ملم من bregma، ML، 4.2 مم؛ DV، 7.8 مم مقارنة bregma) في الفئران. يتم تكييفها الإحداثيات من باكينوس واتسون الفئران أطلس 10.
- حفر حفرة أكبر (التي يبلغ قطرها 1.6 ملم) على الجمجمة وإدراج معايرة الثرمستور 30 كيلو فولت على سطح القشرة الجدارية، والتي سيتم رسخ في وقت لاحق، إلى مونيتور درجة الحرارة القشرية في الفئران.
- استخدام الشاش والكي لوقف النزيف عند حدوثه.
- مسار يؤدي معزولة من الأقطاب ECoG وأقطاب EMG على قاعدة التمثال وربط الثرمستور إلى حبل. تعزيز قاعدة التمثال وتوجيه قنية في الجمجمة مع الاكريليك الأسنان.
- علاج شق موضعيا مع polysporin (باسيتراسين الزنك / بوليميكسين ب سلفات) للوقاية من العدوى. إعطاء الحيوانات على حد سواء ايبوبروفين والبنسلين G في الماء لمدة أسبوع واحد بعد الجراحة.
- بالنسبة للفئران (20 - البالغ من العمر 8 أسابيع 30 غرام، 6- لC57BL / C الفئران)
- تخدير الفئران عن طريق الحقن IP مع 50 ملغ / كغ zoletil وتأكيد عمق مناسب من التخدير خلال مراقبة عدم استجابة بعد معسر مخلب هند. تطبيق مرهم العين. بعد الحلاقة الفراء، وتعقيم الجلد مع محلول البوفيدون اليود و 75٪ من الإيثانول. حقن مضاد حيوي (البنسلين G) للوقاية من العدوى.
- وضع شريط الأذن في قناة الأذن وجبل الماوس إلى stereotaxis.
- باستخدام مشرط، وجعل تقريبي 1.5 سم شق خط الوسط على الجمجمة على طول الخط الفاصل بين آذان اثنين، والانتقال caudally. مقطع اللوحات الجلد مع المرقأة لفضح الجمجمة وإزالة الأنسجة على الجمجمة مع مشرط.
- كزة اثنين من الثقوب في الجمجمة مع مقص جراحي ووضع قطبين سلك ECoG في الفص الجبهي الأيمن (F2: +2.0 ملم إلى bregma و+1.5 إلى خط الوسط) والأيسر الفص الجداري (P1: -3.0 ملم إلى bregma و-2.5 ملم الى خط الوسط).
- فصل جلد الرقبة والعضلات وادخال اثنين من الأقطاب الكهربائية EMG في عضلة الرقبة.
- ربط الخيوط معزول من الأقطاب ECoG الأسلاك والأقطاب الكهربائية EMG إلى محطات الإناث وموصل 2.54 ملم، ثم الأسمنت في الجمجمة مع الاكريليك الأسنان.
- علاج شق موضعيا مع polysporin (باسيتراسين الزنك / بوليميكسين ب سلفات) للوقاية من العدوى. إعطاء الحيوانات على حد سواء ايبوبروفين والبنسلين G في الماء لمدة وي واحدةك بعد الجراحة.
- السماح لجميع الحيوانات لاستعادة لسبعة أيام قبل بدء التجارب.
- بيت الفئران أو الفئران بشكل منفصل، في أقفاص تسجيل الفردية، في غرفة معزولة حيث يتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 23 ± 1 درجة مئوية، وضوء: الظلام (L: D) يتم التحكم الإيقاع في 12: دورة 12 ساعة (40 W × 4 أنابيب الإضاءة). توفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
- ربط ECoG، EMG، والثرمستور من خلال حبل لمكبرات الصوت أسبوع واحد بعد الجراحة لبدء التسجيلات.
2. إنشاء الاتصال TLE الصرع، SE، وبشكل عفوي المتكررة الصرع
- بالنسبة للفئران
- إدارة 0.5 ميكرولتر من بيلوكاربين (2.4 ملغ / ميكرولتر) في CEA الأيسر من خلال قنية دليل الحقن باستخدام مضخة حقن مكروي. يجب تعيين معدل الحقن في 0.2 ميكرولتر / دقيقة للحث على TLE البؤري.
- الملكية الفكرية حقن 300 ملغم / كغم من بيلوكاربين للحث برنامج التحصين الموسع المعممlepsy مع المتكررة SE.
- بالنسبة للفئران
- IP إدارة PTZ (0.035 ملغ / غ الماوس وزن الجسم) عند نقطة ZT معينة كل يوم. سوف خمس حقن متتالية يؤدي إلى تطوير الصرع المعمم بشكل عفوي ومتكرر.
- لكل من الجرذان والفئران
- تضخيم الإشارات ECoG من 5000 وتصفية ممر الموجة التناظرية بين 0.1 و 40 هرتز.
- استخدام لوحة / D تحويل لتحويل الإشارات التناظرية ECoGs إلى إشارات رقمية مع معدل أخذ العينات 128 هرتز.
- استخدام برنامج لتسجيل المرئي وتحليل بداية ومدة الصرع. قياس الفترة الزمنية من أجل تمثيل المدة.
- تحديد ECoG الصرع قبل ظهور طفرات الصرع مع سعة أكبر من 2 بالسيارات ومع فترات من أكثر من 30 ثانية 13.
3. تصنيف الولايات اليقظة
- بالنسبة للفئران
- تحديد الدول اليقظة باستخدام المعلمات تم الحصول عليها من ECoGs، EMG، ودرجات حرارة الدماغ، وتنقل على بعد ق 12 حلقة من التسجيل. ربط ECoG، EMG، والثرمستور من خلال حبل لمكبرات الصوت أسبوع واحد بعد عملية جراحية لبدء عملية التسجيل. يسجل الدول مع البرمجيات حسب الطلب وفقا لخطوات 3.1.5 - 3.1.7.
- قياس الأنشطة الحركي باستخدام كاشف الحركة بالأشعة تحت الحمراء، ودمج الإشارات كل 1 ثانية، وتخزين الإشارات.
- قياس درجة حرارة القشرية وتخزين الإشارات.
- تصنيف الدول اليقظة وفقا لدينا معايير محددة سابقا 14.
- يسجل اليقظة باستخدام الخصائص التالية: ECoGs-السعة الصغيرة مع الأطياف عالية التردد، وارتفاع قوة دلتا (0،5-4،0 هرتز)، وطاقة أقل ثيتا (6،0-9،0 هرتز)؛ النشاط الحركي السائد. النشاط EMG عالية. وزيادة تدريجيا درجة حرارة القشرية.
- يسجل النوم NREM باستخدام الى ما يلي:ز الخصائص: دلتا موجة ECoGs المهيمنة مع سعة كبيرة، انخفضت النشاط EMG، مخفضا لدرجة الحرارة القشرية، وعدم النشاط الحركي.
- يسجل النوم REM باستخدام الخصائص التالية: انخفاض السعة من ECoGs مع التردد السائد ثيتا، وزيادة فجأة درجة الحرارة القشرية، والنشاط EMG الحد الأدنى، وانخفاض النشاط الحركي مع تشنجات الجسم.
- بالنسبة للفئران
- كرر تصنيف الدول يقظة في الفئران كما أجريت في الفئران، باستثناء وجود درجة حرارة القشرية المسجلة من الثرمستور.
4. أداء الوخز بالإبر اليدوي وEA في الجرذان
- هو تخدير الفئران لبروتوكول EA.
- تحديد نقاط الوخز بواسطة التشريح وتأكيد مقاومة منخفضة الجلد في نقاط الوخز. ضوء يومض عندما كشف عن انخفاض مقاومة الجلد. ملاحظة: توجد نقاط الوخز Fengchi 3 ملم بعيدا عن الخلفية خط الوسط يكونتوين آذان اثنين، على الرقبة.
- إدراج الإبر الفولاذ المقاوم للصدأ في نقاط الوخز على عمق 2 مم.
- نشل الإبر إدراج 10 مرات كل 5 دقائق.
- باستخدام التحفيز والتشجيع والكهربائية وظيفي، وتقديم قطار من النبضات ثنائية الطور (150 ميكرو ثانية مدة كل منهما) مع كثافة من 1 مللي أمبير لنقاط الوخز من خلال إبرة.
- إجراء الوخز بالإبر صورية أو صورية EA كمجموعة تحكم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هناك مختلفة الجرذان والفئران نماذج لتلبية احتياجات أنواع الصرع المختلفة. للحث على TLE البؤري، 0.5 ميكرولتر من بيلوكاربين يدار (2.4 ملغ / ميكرولتر) في CEA الأيسر. يتم الحصول على ECoGs صرعي السائد من القطب ECoG على الفص الجداري من نصف الكرة المخية الأيسر (الشكل 1A: ب)، والأنشطة الصرع نادرة يتم انتقاؤها من بقية الأقطاب ECoG (الشكل 1A: أ، ج، د، ه ، و) عندما تدار بيلوكاربين. تسجل ECoGs صرعي في المقام الأول على الفور بعد تناوله بيلوكاربين. واعتمدت هذه النتائج من 8. وتشير هذه النتائج تحريض الناجح لTLE التنسيق في الفئران بعد الحقن المباشر للبيلوكاربين جرعة منخفضة في CEA.
في غضون 5 دقائق، والملكية الفكرية فيjection من 300 ملغ / كغ بيلوكاربين يدفع آثار كوليني صارمة على السلوك، مثل انتصاب الشعر، اللعاب، احمرار العينين، والارتعاش، والأتوماتيكية الوجه. شدة هذه الأعراض السلوكية يزيد تدريجيا حتى يحدث نوبة ECoG المعمم (الشكل 1B، المربع الأزرق). يحدث SE أيضا بعد الصرع المعمم (1B الشكل، مربع أحمر). واعتمدت هذه النتائج من 13. نتائجنا تشير إلى أن حقنة IP من 300 ملغ / كغ بيلوكاربين هو طريقة يمكن الاعتماد عليها للحث على توثيق ECoG الصرع المعمم وSE. ومع ذلك، فإن معدل البقاء على قيد الحياة بعد تطوير SE ما بين 15٪ و 20٪. يتم استخدام نموذج تسعير PTZ من الصرع لدى الفئران لتطوير الصرع المعمم بشكل عفوي ومتكرر. PTZ بجرعة 0.035 ملغم / غم وزن الجسم الماوس حقن IP عند نقطة ZT معينة (على سبيل المثال، بداية من الفترة المظلمة، ZT13) يتم فصل كل يوم، وكل حقنة قبل فترة ليوم واحد. لا توجد صرعيECoGs وجدت خلال الفترة المظلمة بعد الحقن الحادي 1 من PTZ (الشكل 1C: أ) أو خلال الفترة المظلمة التالية، عندما هو يوم عطلة للحقن (الشكل 1C: ب). لم يتم العثور على النشاط صرع كبير بعد الثانية 2، 3 الثالثة، و 4 حقن ال (لا تظهر البيانات هنا). ومع ذلك، وبفعل ECoGs صرعي بعد ال 5 حقن PTZ (الشكل 1C: ج، د)، جنبا إلى جنب مع الصرع المعمم بشكل عفوي ومتكرر (الشكل 1C: البريد و').
نحن تصنف الدول اليقظة في اليقظة والنوم NREM، والنوم REM وفقا للمعايير ذكرنا في البروتوكول. اليقظة وسجل بصريا ECoGs غير متزامن مع انخفاض السعة والتردد العالي. قيم كثافة الطاقة في نطاق التردد دلتا (0،5-4 هرتز) هي أكبر عموما من تلك الموجودة فيتم العثور على - (9 هرتز 6) أثناء اليقظة، وأكثر من ذلك ارتفاع وتيرة الأطياف (> 10 هرتز) نطاق التردد ثيتا. اليقظة يسلك السعة العالية فريق الإدارة البيئية والكثير من النشاط الحركي. وعلاوة على ذلك، ودرجة الحرارة القشرية يزيد تدريجيا عندما تعبر الدولة اليقظة من النوم إما NREM أو النوم REM إلى اليقظة (الشكل 2). يتميز NREM النوم التي كتبها ECoGs متزامنة مع السعة العالية والتردد المنخفض. قيم كثافة الطاقة هي المهيمنة في نطاق التردد الدلتا. السعة EMG ينخفض تدريجيا، وعرضت أي نشاط الحركي أثناء النوم NREM. تنخفض درجة الحرارة القشرية عندما تعبر الدولة اليقظة من اليقظة إلى النوم NREM (الشكل 2). أثناء النوم REM، وغير متزامن موجة ECoG، يتم تقليل السعة، تحدث السائدة كثافة الطاقة EEG داخل تردد ثيتا (6،0-9،0 هرتز)، ويلاحظ النشاط EMG أدنى، طورية نشل الجسم، ودرجة الحرارة القشرية يزيد بسرعة(الشكل 2).
أثبتنا الآثار متميزة من EA على النشاط الصرع عندما يحفز EA نقاط الوخز Fengchi إما مع التحفيز عالية التردد (100 هرتز) أو التحفيز التردد المنخفض (10 هرتز). في الشكل 3A، وهو Microinjection من 0.5 ميكرولتر من بيلوكاربين (2.4 ملغ / ميكرولتر) في CEA الأيسر يدفع TLE البؤري، كما ذكر سابقا (B). ومع ذلك، 100 هرتز EA من نقاط الوخز Fengchi الثنائية تفاقم ECoGs صرعي الناجم عن بيلوكاربين (C). تتكيف هذه النتائج من 8. في المقابل، 10 هرتز EA من Fengchi الثنائي يقمع ECoGs صرعي الناجم عن بيلوكاربين (الشكل 3B: C). تتكيف هذه النتائج من 7. إدارة بيلوكاربين في CEA الأيسر أيضا يقمع NREM النوم خلال فترة خفيفة من الضوء 12 ساعة: دورة الظلام (الشكل 4A & 4B). الحد من النوم NREM خلال بالعربيةساعات مصريات من الفترة المظلمة هي في المقام الأول بسبب تأثير التخدير، وليس لها تأثير مباشر من EA 15. تطبيق 100 هرتز EA تدهورا قمع الناجم عن بيلوكاربين من النوم NREM الشكل (4A). في المقابل، 10 هرتز EA من نقاط الوخز Fengchi الثنائية يزيد النوم NREM في حد ذاته خلال الفترة المظلمة وكتل الحد الناجمة عن بيلوكاربين من النوم NREM خلال الفترة الخفيفة (الشكل 4B). واعتمدت هذه النتائج من 9.
الشكل 1: نماذج الصرع المختلفة في الجرذان والفئران. ويدل على TLE التنسيق في الفئران. ب بالتعريف الصرع المعمم مع SE في الفئران. C يدل على ECoGs صرعي عفوية والمتكررة. (أ) (أ) و (ب) و (ج) و (د) و (ه) و (و) تمثيل Eإشارات الترس المسجلة من أقطاب توضع على الجبهي الأيسر، الجداري الأيسر، القذالي اليسرى الأمامية اليمنى، الجداري الأيمن، والقشور القذالي الحق، على التوالي. (ب) يشير السهم الحقن IP من بيلوكاربين. المربع الرمادي (أ) يدل على ECoGs خط الأساس التي تم الحصول عليها قبل الحقن بيلوكاربين. يظهر مربع أزرق ECoGs صرعي من الصرع المعمم. المربع الأحمر (ب) يمثل SE. إشارات ECoG المستخرجة من (أ) وعرض (ب) في الفقرة (أ ') و (ب). (ج) (أ) يمثل ECoGs المكتسبة بعد حقن الحادي PTZ 1 و (ب) يمثل سجلت ECoGs في اليوم التالي لحقن الحادي PTZ 1 في الفئران. تحدث الأنشطة الصرع بعد حقن ال 5 PTZ (ج) وبعد ذلك. وترد ECoGs الصرع المتكررة التي تحدث على بعد اليوم الموافق 5 حقن PTZ في (د). وترد ECoGs الصرع المتكررة سجلت بعد 5 أيام من الحقن PTZ الموافق 5 في (ه) . الرقم في الجزء السفلي (أ ') يمثل ECoGs المستخرجة من المربع الأحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصنيف الولايات اليقظة: اليقظة، NREM النوم، والنوم REM. يتم تصنيف الدول يقظة الفئران من قبل المعلمات من ECoGs، ECoG الأطياف، EMGS، والنشاط الحركي، ودرجة الحرارة القشرية. وتتميز الدول يقظة الفئران عن طريق نفس المعلمات، باستثناء درجة الحرارة القشرية غير قابلة للتطبيق.
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
pload / 54896 / 54896fig3.jpg "/>
الرقم 3: آثار 100 هرتز و EA 10 هرتز على الصرع. في الفقرة (أ)، يدل على أول أثر ECoG وECoGs الأساس (أ). Microinjection من بيلوكاربين في CEA الأيسر يدفع TLE البؤري (ب). تطبيق EA 100 هرتز في نقاط الوخز Fengchi الثنائية تفاقم ECoGs صرعي (ج). في (ب)، يدل على أول أثر ECoG وECoGs الأساس (أ). وMicroinjection من بيلوكاربين في CEA الأيسر يدفع TLE البؤري (ب). تطبيق EA 10 هرتز على نقاط الوخز Fengchi الثنائية يقمع ECoGs صرعي (ج). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: آثار 100 هرتز و EA 10 هرتز على برنامج التحصين الموسعاضطرابات النوم التي يسببها lepsy. (A) TLE البؤري الناجمة عن Microinjection من بيلوكاربين في CEA الأيسر يقلل NREM النوم خلال فترة الخفيفة. تتدهور 100 هرتز EA كذلك اضطراب النوم الناجم عن داء الصرع. (ب) تطبيق 10 هرتز كتل EA الحد الناجمة عن مرض الصرع من النوم NREM خلال الفترة الخفيفة. وعلاوة على ذلك، 10 هرتز EA يعزز NREM النوم خلال الفترة المظلمة. يتم تمثيل القيم كما يعني ± SEM. تمثل الدائرة السوداء القيم التي تم الحصول عليها قبل Microinjection من بيلوكاربين، دائرة مفتوحة يصور البيانات التي حصل عليها بعد حقن بيلوكاربين، ومثلث مفتوح يوضح القيم التي تم الحصول عليها بعد المحفزات EA. يمثل شريط أسود على فترة مظلمة من ضوء 12 ساعة: دورة الظلام، وشريط أبيض يصور فترة الخفيفة. * يمثل الفرق الإحصائي بين EA 100 هرتز + مجموعة بيلوكاربين والتحكم (أنوفا، ف <0.05) و# يدل على فرقا إحصائياالبريد بين EA 10 هرتز + مجموعة بيلوكاربين ومجموعة بيلوكاربين (أنوفا، ف <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اختيار نموذج حيواني الصرع ممكنا من الضروري لكل غرض تجريبي. واحد من أهدافنا هو لتوضيح آثار EA على قمع الصرع. EA هو الطب البديل الذي قد يحمل تأثير علاجي في الصرع وتم توثيقها في الأدب الصيني القديم. ومع ذلك، هناك نقص في الأدلة العلمية التي تثبت ذلك. لتحديد آثار EA على الصرع، وركزنا بشكل أساسي على آثار EA على الصرع البؤري معتدل، بدلا من التركيز على الاستيلاء معمم شديد أو SE. استخدمت دراستنا السابقة نموذجا TLE التنسيق في الفئران للتدليل على آثار التردد المنخفض (10 هرتز) وعالية التردد (100 هرتز) EA من نقاط الوخز Fengchi الثنائية على يسببها بيلوكاربين التنسيق TLE والتنسيق الناجم عن اضطرابات النوم TLE 7- 9. نتائجنا تشير إلى أن 10 هرتز EA من نقاط الوخز Fengchi الثنائية يقمع البؤري TLE واضطراب النوم، في حين أن 100 هرتز EA تفاقم كلا TLE التنسيق واضطرابات النوم التي يسببها TLE. مثال آخر هو رس إظهار آثار التحفيز العميق في المخ في مرض الصرع الحرارية، الاستيلاء خاصة المعمم وSE. وقد قررنا أن جانب واحد التحفيز العميق للمخ النواة الأمامية من المهاد (ANT) مع التيارات عالية التردد ومنخفضة الكثافة يمنع بنجاح تكرار الصرع المعمم ومدة SE 13. ونحن أيضا وضعت بشكل عفوي ومعمم متكرر الصرع باستخدام طريقة تأجيج PTZ في الفئران. هذا النموذج الذي تأجيج PTZ يمكن تطبيقها على نطاق واسع للدراسات الصرع. في خطوة حاسمة لإنشاء هذه النماذج الصرع هو استخدام الجرعات المناسبة. وMicroinjection من كميات أكبر من بيلوكاربين في CEA قد تتطور الصرع المعمم الثانوي. إدارة الملكية الفكرية من أكثر من 300 مغ / كغ بيلوكاربين يدفع الصرع المعمم وSE. ومع ذلك، فإن معظم الفئران لا البقاء على قيد الحياة بعد وضعت SE. وبالإضافة إلى ذلك، جرعات أقل من 280 ملغ / كغ لا يمكن أن تؤسس الصرع المعمم وSE بنجاح. هذا نفس الاشتراكيةtuation يحدث مع نموذج تأجيج PTZ. قد يسبب جرعات أكبر من PTZ SE، ولكن العديد من الفئران لا البقاء على قيد الحياة. في المقابل، الجرعات المنخفضة من PTZ تتطلب المزيد من الحقن لإنشاء الصرع المتكررة من تلقاء أنفسهم.
ويستند تصنيف الدول اليقظة مختلفة في الجرذان والفئران في المقام الأول على ملامح ديمسديل المسجلة من البشر. نحن تعديل البروتوكول من أجل تحليل النشاط النوم واليقظة من القيم المسجلة من ECoG والتوزيع الطيفي، EMG، والنشاط الحركي، ودرجة الحرارة القشرية. خصائص ECoG والتوزيع الطيفي، EMG، والنشاط الحركي، ودرجة الحرارة القشرية المسجلة من اليقظة والنوم NREM مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من البشر. ومع ذلك، والنوم REM في بعض الأحيان غامضة ويصعب تصنيفها في القوارض. يصف معظم الأدب النوم REM في القوارض وفقا لECoGs وEMGS. نطاق التردد ثيتا من ECoGs هي السائدة وقوة العضلات من EMG هو أدنى عند الجرذان أو الفئرانإعادة في النوم REM. من أجل زيادة الثقة من النوم REM التهديف، سجلنا زيادة النشاط الحركي ودرجة الحرارة القشرية. لوحظ طورية نشل الجسم ودرجة الحرارة القشرية يزيد بسرعة عندما تدخل الفئران من النوم REM. النشاط الحركي ودرجة الحرارة القشرية، بالإضافة إلى ECoGs والتوزيع الطيفي، وEMGS، وتعزيز دقة لتحليل حركة العين السريعة. لمزيد من المعلمات التي تم تضمينها، ويمكن إجراء التصنيفات أكثر دقة.
دائما انتقد نقطتين أساسيتين عند أداء الباحثين الوخز بالإبر اليدوي أو التجارب EA. القضية الأولى هي كيفية تحديد الباحثين وتأكيد نقاط الوخز في الفئران. يتم تأسيس نظام خط الطول ونقاط الوخز في البشر بشكل جيد، ولكن لا يوجد نظام ونقاط الوخز ميريديان خريطة أكد في القوارض. لذلك، يتم تحديد توطين نقاط الوخز المقابلة في القوارض وفقا لموقع التشريحية النسبي. على سبيل المثال، نقاط الوخز Fengchi (GB 20) هيتقع في الاكتئاب بين الجزء العلوي من القصية الترقوية الخشائية العضلة والعضلة شبه المنحرفة في البشر. لقد وجدنا الموقع التشريحي ذات الصلة في القوارض وأكد كذلك أنه من خلال قياس مقاومة منخفضة الجلد. مقاومة من نقاط الوخز هو أقل من ذلك من الجلد المحيطة بها. والمسألة الثانية هي كيف يتم التحكم في الجرعات الوخز بالإبر أثناء التجربة. إذا تم استخدام الوخز بالإبر اليدوي للتجربة، يجب أن يتم تنفيذ التلاعب إبرة الوخز من قبل الباحث نفسه في نفس الطريق لكل تلاعب. سيكون من الأسهل للسيطرة على جرعة الوخز بالإبر إذا EA هو المعمول به، كما يضمن EA تردد التحفيز المستمر وشدة التيار. وعلاوة على ذلك، في تسكين الألم، EA يسلك أكثر فعالية من الوخز بالإبر اليدوي 16. ومع ذلك، والوخز بالإبر اليدوية وEA مع التردد المنخفض والتحفيز عالية التردد في نفس نقاط الوخز قد ينشط مناطق دماغية مختلفة 17، والذي قد يدل underly مختلفةجي الآليات.
وباختصار، فإن هذه الورقة توضح عدة نماذج الصرع الناجم عن المواد الكيميائية في الجرذان والفئران، بما في ذلك TLE البؤري، والصرع المعمم، SE، والصرع المعمم بشكل عفوي ومتكرر. أنشأنا أيضا نموذج الصرع تأجيج الكهربائية التقليدية والسريع في الفئران. إذا القراء المهتمين في نموذج تسعير الكهرباء، يرجى الرجوع إلى مراجع 4 و 5. كما نقوم بتوفير معايير لتحليل النشاط النوم واليقظة في الجرذان والفئران. لتقييم تأثير EA على النشاط الصرع والنوم، ونحن تصف كيفية إضفاء الطابع المحلي على نقاط الوخز ذات الصلة في الفئران وكيفية تنفيذ الوخز بالإبر، ونحن أيضا تقديم بعض النتائج ممثل لإظهار آثار EA على الصرع واضطرابات النوم التي يسببها مرض الصرع .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X.
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W.
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
