방법 논문

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

44.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54903

⸱

2016년 12월 26일

 ,  , 
1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology, Oregon Health and Science University

이 논문에서

요약

문맥 주사를 통해 유선종양 세포를 쥐 간으로 전달하는 수술이 개발되었습니다. 이 모델을 사용하면 간의 종양 세포 유출, 파종, 생존 및 전이성 성장을 포함하여 완전히 면역이 있는 숙주에서 간 전이의 후기 단계를 조사할 수 있습니다.

초록

유방암은 전 세계적으로 여성의 암 관련 사망의 주된 원인이다. 15개월 - 간 전이은 4.8의 평균 생존율과 가난한 결과에서 유방암 전이의 경우 30 %의 위쪽으로, 그리고 결과에 참여하고있다. 일차 종양 세포 이종 자발적 종양 모델을 포함 유방암 전이 현재 설치류 모델은 거의 간으로 전이하지 않는다. 심내 및 intrasplenic 주입 모델 그러나 이러한 모델 인해 주입 부위에서 종양 성장을 방지하기 위해 비장의 제거에 수반 차 사이트 전이에 의해 혼동 또는 손상된 면역가 될 수 간전 결과 않는다. 개선 간전 모델의 필요성 간이 개발에 먼저 직접적으로 종양 세포를 제공하는 뮤린 문맥 주입법을 해결한다. 이 모델은 다른 기관 또는 비장 제거 동시 전이 합병증없이 간으로 종양 세포를 제공한다. 수신 거부혈액 손실을 제어하기위한 주사 부위에서 10 μL, ≥ 32 게이지 바늘 및 지혈 가제 - imized 문맥 프로토콜 5 작은 주입량을 사용한다. 전이성 전위 시험 하였다 가변 세 동계 유방 종양 라인을 사용을 Balb / C 암컷 마우스의 문맥 주입 방법; 높은 전이성 4T1 세포, 중간 - 전이성 D2A1 세포, 낮은 전이성 D2.OR 세포. 덜 공격적인 D2.OR 라인에 대한 높은 전이성 4T1 및 D2A1 라인 간 전이의 개발을 40 일 이상> 오십오일 - 20 ~의 대기 시간 ≤ 10,000 세포 / 주입 결과의 농도. 이 모델을 간으로 유방암 전이 연구에 중요한 도구를 나타내고, 자주 결장 및 췌장 선암종 포함 간으로 전이 다른 암에 적용될 수있다.

서론

간으로 유방암 전이

간은 뼈와 폐 1-3 함께 유방암 전이 공통 위치이다. 유방암 환자의 간전이 4.8에서 15개월 6-9에 간전 범위 유방암 환자의 생존 기간의 중앙값으로서 매우 불량한 결과 4,5- 대한 독립적 인 예후 인자이다. 반대로, 폐 또는 뼈 전이 유방암 환자는 9 개월 27.4 16.3 8,9 및 56 개월 각각 8,10-12, 메디안 생존율을 갖는다. 전이는 원발 종양에서 종양 세포의 보급 시작 의한 먼 기관 13-15 내 종양 세포 순환 시드 및 생장에 환자 사망률과 종료 전이성 캐스케이드라고 다단계 프로세스이다. 10 % - 전이 설치류 모델은 전이성 캐스케이드 0.02으로 현저히 비효율적 인 것으로 밝혀졌다명백한의 전이 (16, 17)을 설정하는 종양 세포를 순환. 전이성 비 효율성의 하나의 주요 병목 현상을 이해 사이트 별 전이의 중요성을 강조, 전이성 틈새 (18)라는 보조 사이트에 고유 한 조직의 미세 환경에 의해 결정됩니다. 전이성 틈새 재발 사이트에 고유하며, 부분적으로 별개의 세포 외 기질 단백질 (19, 20)의 증착, 다양한 면역 세포 집단 21-23의 침윤, 그리고 수많은 사이토 카인의 조절 이상 생산 포함 변화된 조직 항상성에 의해 특징되며, 케모카인 및 성장 인자 15,18,24,25. 따라서, 조직 특이 적 전이성 틈새 이해 전이성 질환을 타겟팅하는 방법에 대한 이해를 선행한다. 그러나, 간 전이의 강력한 모델이 부족하다. 또한, 간 전이의 개선 모델은 유방암 환자 위스콘신에 대한 새로운 목표와 효과적인 치료법을 식별에 필수적이다일 간 전이.

간으로 유방암 전이를 공부하는 모델 설립

간은 면역 손상 쥐에서 인간의 암 세포의 이종 이식을 포함에 현재 사용 가능한 모델은 유방암 전이를 공부합니다. - / - 또는 SCID 면역 감염된 뮤린 26-29 호스트이 모델들은 일반적으로 MCF-7 및 MDA-MB-231, 누드 Rag1 같이 잘 연구 인간 유방암 세포주를 사용한다. 이종 이식 모델은 인간 유래의 암 세포주를 포함하는 이점을 제공하지만, 전이 30-32 및 치료 내성 33-35에서 면역 세포에 대한 최근의 인식을 주어진 완전 면역 능력 호스트의 전이에 관한 연구가 중요하다. 면역 능력 호스트에서 간으로 유방암 전이 공부 모델 또는 수술없이 유방 지방 패드로 동계 종양 세포 (예를 들어, 4T1 및 D2A1 세포주)의 소성을 주입 포함기본 종양의 절제 및 전이 36 ~ 38의 후속 평가. 참고로, 동소 이식 모델의 간 전이의 속도가 매우 낮은 또는 폐 39, 40 등의 다른 전이 부위에 비해 존재하지 않는 경우, 또는 폐전이 설정된 후, 간 특이 적 전이 (37, 39)의 조사를 복잡하게 발생 .

자발 유전 공학적 유방암 모델에서 종양 이식편이 동계 종양 세포 등 나이브 호스트의 유방 지방 패드로 재 주입 될 수있다. 예를 들어, 최근 동소 야생형 호스트 주입시 K14 Cre 호텔 ECAD F / F의 P53의 F / F 마우스에서 자발적 종양 모델되는 침습성 소엽 성 유방암 종양을 개발하는 것이보고되었다. 이들이 15mm이 도달하면 이들 종양 절제술 이후, 쥐의 18 %가 간전 40, 41으로 진행. 세 번째 방법은 간 전이 분류기를 모델링유전자 조작 생쥐의 자발적인 전이. 지금까지 용이 간 확산 유방암 전이 자발 뮤린 모델을보고 드물다. 예외는 H19-IGF2, p53과의 FP / FP MMTV-Cre 호텔의 WAP-Cre 호텔 및 K14 Cre 호텔 ECAD F / f를 P53을 포함 F 간 전이 쥐의 낮은 비율에 개발 유전자 조작 마우스 모델, F / 38,41- 43. 유전자 변형 마우스 모델의 전이성 캐스케이드 강력하고 임상 적으로 모델을 제공하는 모든 단계에 대한 연구를 촉진하면서 따라서, 이들은 인해 간전이 (38)의 낮은 속도로 제한된다.

여러 전이 모델 차 종양 intravasation에서 종양 세포의 확산을 포함하는 전이 캐스케이드의 초기 단계를 우회. 이러한 모델은 넘쳐에서 보조 사이트에서 종양의 설립, 전이성 폭포의 이후 단계의 조사를 허용합니다. INTracardiac 주입 모델 대동맥을 통해 순환 시스템으로 종양 세포를 분배 좌심실로 종양 세포를 제공한다. 심장 내 주입은 성공적인 주사를 확인하기 위해 세포를 주사 부위 또는 루시 페라 제의 생물 발광 등의 다른 영상 방식의 초음파 유도 영상 태그가 필요합니다. 좌심실을 통해 종양 세포의 주입은 다른 기관 44-48 사이 뼈, 뇌, 폐, 및 / 또는 간 전이 될 수있다. 때문에 다기관 전이,이 마우스는 자주 완전히 간 내 전이의 성장을 조사하는 기능을 무효화 종래 명백한 간전 안락사 개발 될 필요가있다. 상당히 멀티 사이트 전이 현상을 최소화하는 다른 방법은 분사 intrasplenic 모델이다. Intrasplenic 주입 간문맥 49,50 될 장간막 정맥 조인 비장의 정맥을 통해 종양 세포를 제공한다. 동물 outgr 모니터링 할 수있다간에서 전이성 병변 owth 다른 부위에서 전이의 형성은 희귀하기 때문에, 결과적으로 동물의 전반적인 건강 49,50 유지된다. 그러나,이 절차에 영향을 미치는 면역 기능의 intrasplenic 모델은 비장 종양 49,50 않도록 비장 절제술을 요구한다는 것이 중요하다. 예를 들어, 심근 허혈 재관류 손상은 비장에서 유래 허혈 51,52 다음 상처 치유 동안 식세포 및 단백질 분해 활성을 담당 Ly6C + 단핵구 서브 세트들의 침윤을 특징으로한다. 비장 절제술로, 52 상처 치유에 도움이 단핵 세포 집단에서 관찰 된 감소가있다. 또한, 비장 절제술 특히 순환 인트라 종양 CCR2 +는 CD11b + Ly6C + 단핵구 myelo의 수의 감소를 통해, 비 - 소세포 폐암 모델에서 일차 종양 성장 및 폐 전이를 감소시키는 것으로 나타났다아이디 셀 (53). 또한 결장암 세포의 주사 intrasplenic 다음 비장 절제술은 장간막 림프절 및 상승 간전 54 항 종양 자연 살해 세포의 감소 된 수준의 결과. 결론적으로,이 연구 결과는 비장 절제술은 전이성 세포의 운명에 대한 후속 결과로 면역 체계의 역할을 타협하는 것이 좋습니다.

간 전이의 포털 정맥 주입 모델

마우스 인해 다기관 전이에 노출되지 않은 상태에서 완전 면역 능력 숙주에서 간으로 유방암의 전이를 조사하기 위해, 문맥 주입 모델을 개발 하였다. Intraportal 주입 모델 대장 55, 56 및 16 흑색 종 세포주의 간전 공부 이전에 사용되었다; 여기에 우리가 동계 유방 종양 세포의 전이를 모델링하기 위해 intraportal 주입의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 모델 연구하는데 사용될 수있다명백한 병변에 유방암 세포의 혈관 외 유출 및 시드, 죽음 / 확산 / 휴면에 대한 종양 세포의 운명 결정 및 파생물을 포함하여 전이성 캐스케이드의 나중 단계. 이 모델에서는 동계 유방 종양 세포주는 면역 능력을 Balb / C 암컷 마우스에서의 문맥, 비장을 제거하지 않고간에 먼저 직접적으로 종양 세포에 전달하는 방법을 통해 주입된다. 이 모델을 사용 하였다 오름차순에서 자신의 전이성 능력의 범위 네 유방 종양 세포 라인의 사용을 개발하려면 다음 D2.OR, D2A1 및 4T1, 그리고 녹색 형광 단백질 (D2A1-GFP) 태그 D2A1를 사용했다 종양 세포의 주입 후 시간의 포인트 초기 조사. 4T1 자발적 MMTV +을 Balb / C 마우스 여성 (36, 37)에 일어나 유방 지방 패드 기본 종양 39,57,58에서 폐, 간, 뇌, 뼈에 전이를 410.4 종양에서 파생 된 높은 전이성 세포 라인입니다. D2A1 종양 세포 WER전자는 원래 D2 증식 폐포 결절 세포의 이식 후을 Balb / C 호스트에서 발생하는 자연스러운 유방 종양에서 유래하고, 폐 59, 60에 기본 종양에서 전이 된 것으로 확인된다. 그들은 원발 종양 벗어나 보조 사이트에 도착하더라도 D2.OR 종양 세포들이 거의 원격 전이 (60, 61)을 구축하지 상기 D2A1 선 비 전이성 자매 라인이며.

또한, 비 스테로이드 성 항 염증성 약물 (NSAIDs) 중 또는 수술을 다음과 같은 일반적으로 사용되는 통증 관리의 약물 사용을 방지하는 것이 중요하다. 비 스테로이드 성 소염 진통제 특정 유방암 62-65에서 항 종양 활성을 가지고, 비 스테로이드 성 소염 진통제 일부 클래스는 잠재적 간전 연구 및 간 전이 틈새 저하 간독성 66,67의 위험을 증가시킨다. 또한, 연구는 프로 전이성 내선 감소, 비 스테로이드 성 소염 진통제 직접 조직의 미세 환경에 영향을 미치는 것이 좋습니다racellular 기질 단백질 68-C 테네 스틴과 섬유 성 콜라겐 62,65. 다르게는, 오피오이드 유도체, 부 프레 노르 핀의 사용은, 오피오이드는 항 종양 활성 (70)을 가지고 있기 때문에 쥐 통증 관리 (69)에서의 효능으로 인해 증거가 부족 하였다. 간 불필요한 손상을 방지하기 위해 10 μL -이 간문맥 주입 모델 (5)의 더 작은 주사 부피에 대해 최적화되었다. 이 모델은 또한 작은 직경 (≥ 32 게이지) 바로 절차 동안 혈액 손실을 최소화하기 위해 다음의 주사 지혈 거즈 사용하여 바늘을 포함하도록 최적화되었다. 이러한 최적화 된 주입 파라미터는 대조적으로, 세포 수는 세포주의 발암 가능성에 기초하여, 개별적으로 결정되어야한다. 그러나 장기 연구 / 주입 ≤ 10,000 세포에서 시작하는 것이 좋습니다. 예 짧은 엔드 포인트 (예를 들면, 24 시간 후 분사) 상당히 많은 종양 세포 (들면,1 × 105 - 보증 된 경우 1 × 106)를 사용할 수있다. 요약하면, 여기에 설명 된 문맥 주입 모델간에 유방암 전이 연구에 유용한 도구를 나타내고, 다른 간전 모델의 제한들을 회피. 이 모델은 종양 세포의 혈관 외 유출, 파종, 면역 능력이 쥐 호스트에서 생존, 증식 및 휴면 및 전이성 파생물의 초기 운명 결정의 연구를 용이하게한다.

프로토콜

이 문서의 모든 동물 절차를 검토하고 오레곤 건강 과학 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

외과 영역 및 악기 1. 준비

  1. 30 분 동안 124 ° C에서 고압 증기 멸균하여 가위, 집게, 및 지혈을 준비, 1 - 계획된 수술 2 일 전에. 수술 후 회복을위한 멸균 된 또는 멸균 침구, 케이지, 음식에 대한 액세스를 확인합니다.
  2. 바람직하게는 층류 후드에서 무균 수술 영역을 준비한다.
    1. 이 수행되는 동안 가열 패드, 광원 마취 배관 및 노우즈 콘 및 수술에 근접 될 수술실의 다른 부분을 포함하여, 10 % 표백제 외과 영역의 모든면을 닦아 .
    2. 무균 수술 영역에서 멸균 드레이프, 광원, 마취 튜브 및 원추형 두부, 인슐린 주사기와 청소 가열 패드를 배치1 ml를 주사기, 부피 바카, 인공 눈물, 멸균 생리 식염수, 2 × 2 "멸균 거즈 스폰지, 4 × 4"멸균 거즈, 0.5로 지혈 거즈 컷 - 1cm 2 개, 가위, 집게, 지혈, 4-0 vicryl 봉합사 멸균 용기에 테이퍼 바늘 및 50 ml의 2 % 클로르헥시딘 글루코 네이트.
    3. 얼음에 저장 준비된 종양 세포에 대해이 공간에서 공간이 있는지 확인하십시오.
    4. 외과 영역 옆에있는 벤치에, 살균 침구와 제 2 가열 패드와 깨끗한 케이지와 복구 영역을 준비합니다.
      주 : 이러한 비드 살균기로이 지역은 수 또한 집 항목.

2. 포털 정맥 주입

  1. 통증 관리를 위해 피하 0.015 ㎎ / ㎖ 부 프레 노르 핀, 100 ㎕ 15 주 - 계획 주사 한 시간 전에, 8 세의 Balb / C 암컷 마우스를 취급합니다.
    참고 :이 주입 프로토콜은 적절한를 사용하여, 모든 연령에서 여성 또는 남성 마우스의 변형에 적용 할 수있다변형에 대한 변경 세포주.
  2. 세포주 또는 선택 종양 이식편에 대한 프로토콜에 기초하여 주사 종양 세포를 준비한다. 동물 콜로니에 같은 병원체를 도입 할 위험을 줄이기 위해 뮤린 병원체의 존재를 투여 전 모든 종양 세포주를 테스트한다.
    1. 3 일전 주입 10cm의 조직 배양 플레이트로 D2A1, D2.OR 및 4T1 종양 세포를 해동 세포를 포함 동계의 Balb / C 종양 세포주와 같은 다음날 세포 ~ 90 있음 - 100 % 컨 플루.
    2. 일단 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 5 분 동안 37 ℃에서 0.05 % 트립신 용액을 사용하여 2 합류 종양 세포를 Trypsinize 1 다음날 종양 세포 융해 세척 세포. 완전한 미디어 10 mL로 신선한 10cm 접시에 팔 전체 미디어 ㎖ (DMEM 고 글루코스, 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신) 및 통로 1:10 추가한다.
    3. 주사의 날, 1X PBS와 t에 한 번 세포를 씻어전술 한 바와 같이 rypsinize.
    4. 1,500 XG에서 전체 미디어, 5 분 스핀의 8 ㎖에 트립신 세포를 재현 탁 PBS 1X 5 ㎖에 언론과에 resuspend를 제거합니다.
    5. 생존 능력 평가를위한 트리 판 블루 배제를 사용하여 혈구에 세포를 계산합니다. 미리 정해진 농도와 볼륨 1X PBS에서 주입 세포를 재현 탁.
      참고 : 5 - 작은 주입 볼륨이 간 불필요한 손상을 방지로 10 ㎕를 추천합니다.
    6. 주사의 기간 동안 얼음에 세포를 유지합니다. 주사 종료 후, 생존을 보장하기 위해 1 일 전체 미디어 문화 연구소에 세포의 샘플을 반환하고 배치합니다.
  3. 산소 전달 2.5 %의 이소 플루 란 (2- 클로로 -2- (플루오 로메) -1,1,1 트리 플루오로 에탄) - 2 마취에서 마우스를 놓습니다. 상기 가열 패드를 사용하여 체온을 유지한다. 발가락 핀치에 대한 반응에 대해 평가하여 전체 마취를 확인하고 anesthe을 유지2.5 %의 이소 플루 란 - 2에서 SIA.
    참고 : 속도를 호흡 동물을 모니터링하고 절차 전반에 걸쳐 이에 따라 이소 플루 란 유량을 조절하는 것이 중요하다.
  4. 수술 중에 눈의 과도한 건조를 방지하기 위해 각각의 눈을 통해 인공 눈물 또는 수의사 연고의 작은 금액을 놓습니다.
  5. 노출 된 복부와의 뒷면에, 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
  6. 화학 제모로 영역을 닦아 4 번째 사타구니 유선의 젖꼭지 아래로 두 번째 리브 공간에서 쥐의 복부 왼쪽에 머리를 제거합니다. 2 분 후 거즈와 H 2 O는이 단계 1을 수행 할 수 있습니다 완전히 제거 - - 수많은 수술을 계획하는 경우 시간을 절약하기 위해 사전에 2 일 제모는 1 앉아 할 수 있습니다.
  7. (2 % 클로르헥시딘에 배어) 한 2 × 2 "멸균 거즈 스폰지를 타고 머리 제거의 사이트에서 마우스를 아래로 닦아냅니다. 전체 주변 지역을 소독, 꼬리를 포함, 세균 계속을 최소화하기 위해악기의 아 민화.
  8. 머리 제거의 사이트와 알코올 준비 패드 아래로 주변 지역을 닦으십시오.
  9. 세 2 % 클로르헥시딘과 두 개의 알코올 준비 패드 세척 총 닦아 2 % 클로르헥시딘과 알코올의 단계를 한 번 더 반복하여 최종 클로르헥시딘 마무리. 최종 클로르헥시딘 화학 물질은 내장 타고 클로르헥시딘을 피하기 위해 수술 부위 주위에 적하되지 않도록 닦아 않는다. 주 : 클로르헥시딘 알코올 피부와 주변 모피 대용량 어플리케이션 체온 크게 저하 될 수있다. 단계 2.7-2.9 동안 초과 볼륨으로 닦지 마십시오. 가열 패드 체온을 유지한다.
  10. 멸균 장갑 멸균 블레이드 멸균 메스를 사용하여 마우스의 왼쪽 중간 시상 평면 사이의 피부에 하나의 1 인치 절개를 그냥 리브 이하부터, 단지 제 사타구니의 평면 위에 끝나는 유선 젖꼭지.
  11. 멸균 또는 비드 멸균 가위와 집게를 사용하여 복막에 비슷한 1 인치 절개를합니다. 유방 지방 패드로 절단 피와 내장, 간, 또는 격막을 절단하지 않도록 확인합니다.
  12. 내장이 거즈에 배치 및 주변 피부 외과 영역에 접촉하지 될 수 있도록 절개 하였다 마우스의 왼쪽에서 멸균 식염수에 침지 4 × 4 "거즈 패드를 배치했다.
  13. 종양 세포는 마우스의 제조 중에 침전되므로 최대 피펫으로 여러 번 아래 종양 세포를 준비한다. 종양 세포와 25 ㎕를 제거 바늘 주사기와 32 게이지 바늘을 준비합니다. 종양 세포는 바늘의 선단에 있고, 플런저 사출에 적합한 부피가 될 때까지 주사기 추진; 기포의 주입을 피하십시오.
  14. 외부 종양 세포를 제거하는 살균 알코올 패드 바늘의 외부를 닦습니다. 바늘 스틱을 방지하기 위해주의해야합니다.
  15. 중간 시드를 잡고따로 집게로 피부와 복막 안감을 포함하여 절개의 전자 및주의 깊게 멸균 식염수에 담가 멸균 거즈에 그들을 배치, 크고 작은 창자를 꺼내 멸균 면봉을 사용합니다. 포털 정맥이 가시화 될 때까지 크고 작은 창자를 잡아 당깁니다.
  16. 내부 수분과 불임을 유지하기 위해 식염수를 적신 거즈의 내부 장기를 커버.
  17. 또한 멸균 장갑을 착용, 조수이 멸균 솜으로 비켜 부드럽게 식염수를 적신 거즈에 싸서 창자를 개최 완전히 문맥을 나타 내기 위해 면봉을 냈습니다. 또한, 상기 절개의 중간 측에서 따로 조직을 유지하기 위해 또는 멸균 지혈 겸자를 사용하는 것이 필요할 수있다.
  18. 경사가 위를 향하도록 각도 <정맥 5 °에서 ~ 간 아래에 10mm를 포털 정맥에 5mm - 종양 세포 ~ 3로드 바늘을 삽입합니다. 천천히 종양 세포를 함유하는 전체 부피 주입. 혈액 니들 H지나 흐르게몇 초 EAD는 정맥에서 종양 세포의 역류를 방지한다. 주입하는 동안 정맥에 바늘을 이동 최소화합니다. 또, 바늘 스틱을 피하기 위해주의하십시오.
    주 : 문맥 시각화 바람직 그러나 스테레오 현미경으로 사용할 수도 있고, 배율없이 이루어진다.
  19. 동시에 압력으로 정맥에 멸균면 팁 어플리케이터를 배치하는 동안 바늘을 제거합니다. 정맥에 주사 부위를 통해 1cm 2 지혈 거즈 - 보조 여전히 장을 들고 옆으로 0.5의 한 조각을 놓습니다.
    참고 : 지혈 분말은 또한 프로토콜의이 단계에서 시도했지만 주입 다음 정맥 혈액 손실을 막는 효과가 아니었다.
  20. 5 분 동안 멸균면 팁 어플리케이터로부터 압력으로 주사 부위의 지혈 거즈를 잡습니다.
  21. 조심스럽게 거즈 스틱 경우 주변 조직, steril의 작은 양, 지혈 거즈를 올려 정맥의 폐쇄를 평가전자 식염수 적신 거즈를 해제 할 수있다.
  22. 혈액 손실이 시간에 발생하는 경우, 추가로 5 분 동안 압력 사이트에 지혈 거즈의 추가 부분을 놓는다. 혈액의 흐름이 완전히 정지되면, 마우스의 거즈를 제거합니다.
    참고 : 수술 중 혈액 손실이 조심스럽게 마우스 동안 심장 재관류에 의한 마취하에 안락사해야 평가 및 총 허용 혈액 손실 볼륨에 도달하거나 초과하는 경우 (연구자의 기관 생명 윤리위원회 규제 표준 운영 절차에 따라)해야합니다.
  23. 주사 부위가 주사 부위를 떠나없이 피가 그대로있는 것으로 간주되면, 조심스럽게 복강으로 내부 장기를 놓습니다.
  24. 복막 라이닝하고 단순한 연속 또는 단속 봉합 패턴을 이용하여 무균 4-0 vicryl 봉합사 테이퍼 바늘로 피부를 봉합. 일반적으로 절개를 폐쇄하는 것은 10 ~ 15 봉합이 필요합니다.
  25. bupi 100 μl를 주입인슐린 주사기를 사용하여 로컬 통증 관리 절개 부위를 따라 vacaine (5 ㎎ / ㎖). 수화 26 게이지 바늘로 1 mL를 주사기를 사용하여 멸균 식염수 0.5ml를 피하 주입한다. 완료하는 데 25 분 - 수술 15을.
  26. 수술을 통해 멸균 상태를 유지하려면 모든 도구 및 재료는 장갑을 낀 손을 포함하여 마우스와 접촉하는지 확인 연락을 적절하게 이전에 청소. 가능한 사용 멸균 물질 및 장갑, 또는 최소가 활용 어디 70 % 에탄올 수용액 또는 10 % 표백제 용액을 세척한다.
  27. 여러 수술이 하나의 세션에 대해 계획하는 경우 멸균 거즈, 지혈 거즈 0.5로 절단 "4 × 4, 멸균 거즈 스폰지", 2 × 2 신선한 멸균 드레이프, 인슐린 주사기, 1ml를 주사기, 멸균 식염수 초기 수술 영역을 리메이크 - 1cm 2 개, 테이퍼 바늘로 4-0 vicryl 봉합사, 2 % 클로르헥시딘. 수술 사이에 가위, 집게, 및 지혈을 구슬 - 살균 허용적절하게 이전하기 위해 재사용을 냉각합니다.

설치류 건강 및 엔드 포인트 분석 모니터링 3. 복구,

  1. 수술 완료 후, 20 분 이상 동안 침대 자유로운 깨끗한 회복 케이지 가열 패드 마우스 유지한다. 마취에서 깨어나 4 분 - 마우스는 일반적으로 2 걸릴.
  2. 완전히 마취에서 회복 될 때까지 다른 동물-거주 공동 수술을 시행 한 동물을 반환하지 않습니다. 동물 흉골 드러 누움 자체를 유지하는 능력을 회복 할 때까지 그것을 의식을 회복하면서 무인 동물두고 모니터링하지 않는다.
  3. 통증 관리를 위해 최대 72 시간마다 6-12 시간 다음 수술을, 0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀 - 쥐에게 0.05을 제공합니다.
  4. 그들은 치유하는 동안 그대로 유지하기 위해 매일 봉합을 확인합니다. 봉합이 취소 올 경우, 남아있는 봉합사를 제거하고 교체 마취 마우스를 놓습니다. 감염 inflamm의 경우ATION는 수의사 직원에게 문의하십시오.
    참고 : 감염 또는 염증이 프로토콜을 사용하여 발생되지 않았습니다.
  5. 전이 연구의 경우, 전이성 질환의 외부 징후를 포함하여 관찰, 이에 국한되지 때까지 매일 건강 검사를 수행 : 창백한 눈과 귀를> 10 %의 체중 감소 / 증가, scruffiness, 주변 환경에 대한 관심의 감소, 복부 부종 / 복수, 또는 웅크 위치.
    주 : 전이 막대 잘 이해 될 때까지 새로운 세포주 또는 세포 농도와 함께 사용하기위한 모델을 개발하는 경우 일일 상태 검사는 매우 중요하다.
  6. 연구 종료 시점에서, CO에 의해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입 쥐를 안락사.
    참고 : 연구자 '감독위원회의 승인을 안락사의 다른 방법은 마취하는 동안 1X PBS로 관류를 포함하여, 사용할 수있다. 간 관류는 1X PBS의 일을, 포털 정맥을 cannulating 대정맥을 자르는 것은, 그리고 밀고에 의해 수행된다1 / 분 4 ML의 속도로 거친 간 혈관 - 2 분은 혈액과 백혈구 순환 제거합니다.
    참고 : 연구, 세포주 및 사용 농도에 대한 엔드 포인트에 따라 명백한 간 전이가 또는 부검에서 나타나지 않을 수도 있습니다. 미세 전이 병변은 간 조직 학적 분석을 공개 할 수있다. 엔드 포인트는 연구 설계에 따라 달라집니다.
  7. 먼저 담낭을 제거하여 가위와 집게로 간을 추출하고 간 우수 대정맥을 통해 절단. 대정맥, 문맥, 그리고 간 열등 간 동맥을 잘라.
  8. 부드럽게 전체 간을 제거하고 1X PBS에 5 배를 씻는다.
  9. 왼쪽, 오른쪽, 중앙 및 미상의 로브로 간을 분리합니다.
  10. 48 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린에 고정 포르말린 간 실온에서 진탕하면서. 프로세스 크실렌 농도 증가에 알코올의 시리즈를 통해 어떤 조직이; 파라핀은 고정 된 조직을 포함 (71) 입니다.
    참고 : 또는 간 최적의 절삭 온도 OCT () 식을 가진 cryomold에 조직을 배치하고 95 % 에탄올에 빠져들 드라이 아이스 펠렛에 동결 스냅인을 동결 할 수있다.
    1. 마이크로톰을 사용하여, 조직의 일치 머리 크기에 노출되도록 파라핀 조직 블록으로 절단.
    2. 오 4 미크론 시리얼 부분을 잘라,이 분석을위한 첫 번째 레벨을 구성한다.
    3. 조직의 250 미크론을 통해 잘라, 폐기물에 이러한 섹션을 던져.
    4. 250 미크론에서 오 4 미크론 직렬 섹션의 두 번째 레벨을 잘라.
    5. 전체 간을 통해 섹션을 필요한만큼 반복합니다. 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 모든 수준의 첫 번째 섹션은 전이 (72)에 대한 평가합니다.
      참고 : 스냅 냉동 조직은 부분을 잘라 저온 유지 장치를 사용합니다.
      참고 : 미세 전이 질병의 검출이 종양 세포의 특정 염색이 필요합니다.
  11. 앉아 종양의 성장이 절개에있는 경우 연구에서 쥐를 제거즉,이 사출 다음 복강 내로 종양 세포 누출을 나타내고있다.
    참고 :이 문제는 관찰되지 않았다.

결과

종양 세포를 수술을 통해 간으로 직접 전달되는 문맥 주입 모델은 문맥으로 종양 세포 주입을 허용한다. 살균 조건에서 마취 된 마우스에서는, ~ 1 인치 수술 절개 단지 네 번째 사타구니 유선의 젖꼭지의 평면 위에 시작하고 바로 갈비뼈 아래 끝, 중간 및 시상 평면 사이의 마우스의 왼쪽에 이루어집니다 . 크고 작은 창자 부드럽게 포털 정맥 (그림 1A)의 시각화를 제공하기 위해 절개를 통해 뽑아 있습니다. 간문맥 성공적인 인트라 포털 분사의 정확한 식별은 해부학 먹물 또는 유사한 염료 주입 프로토콜을 실행하여 확인할 수있다. 포털 정맥을 통해 올바른 주사는 간 즉시 구체적으로 전달되는 잉크 될 것이며, (폐 인도 잉크 확산에 Figu을 초래하지 않습니다) 1B 재. 또한, D2A1 마우스 유방 종양 GFP 태그 세포, 종양 세포의 분산을 사용하여 간은 간 (도 1C)에 문맥 주입 전달 확인 구십 분 후 분사 명백한 걸쳐. 높은 배율로는 90 분 후 분사에서 종양 세포가 정현파 내뿐만 아니라 문맥 혈액은 간 (도 1C)에 입사 포털 화음 가까이에서 간 실질 내에서 발견되는 것이 명백해진다. 이러한 데이터는 활성화 된 종양 세포의 혈관 외 유출을 90 분 후 종양 세포 주입시 발생하는 것을 시사한다. 종합적으로, 이들 데이터는 문맥 주입 모델은 간, 폐에 주입 부피의 뚜렷한 전송을 통해 분산 잉크 또는 종양 세포 간 직접 주입 부피를 인도하는 것을 확인한다.

포털 정맥 주입 모델의 견고성을 평가하는 세 가지 separ동계 마우스 유방 종양 세포주는 성인 여성을 Balb / c 마우스에서 시험 하였다 먹었다. 이러한 유방 종양 라인은 유방 지방 패드 모델에서의 특징 행동을 기반으로 매우 공격적이고 전이성 4T1 세포주, 덜 공격적인 전이성 D2A1 라인, 그리고 저 / 비 전이성 D2.OR 라인을 포함하여 선택 하였다 37,61,73 74. 주입 당 2,000 만 셀은 이러한 낮은 세포 농도 명백한 전이의 개발에 시간을 더 주목할만한 차이를 시험 하였다. 이들 연구의 경우 전이 대리 마커 간 전이의 유무는 내부 포털 전달을 확인하기 위해 간 시각적 평가 및 다른 기관에 의해 확인 된에 부검을 정당화 미용 부족, 창백, 체중 감소 등의 사용 된 . 이러한 데이터는 짧은 전이없는 생존율 관찰 같이 4T1 및 D2A1 세포주가 주입 된 마우스에 비해보다 적극적인 유방 종양 라인을 나타낸다는 것을 확인 이전 보고서덜 공격적인 D2.OR 라인 (그림 2A)와 함께. 마우스는 30 ~ 의해 4T1 또는 D2A1 종양 세포 개발 명백한 간전 주입 - 사십일 후 분사 및 D2.OR 세포를 주입 하나만 마우스 한 반면 일부는, 후 분사 (도 2A)와 같은 초기 18 일 전이 개발 육십오일 후 종양 세포 주입 - 60이었다 연구 끝에 개발 한 명백한 간 전이. 전이는 이후 250 μm의 수준 간을 통해 절편과 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 부분 (그림 2B-D)를 분석하여 확인 하였다.

마우스 간에서 명백한 전이성 병변의 검출뿐만 아니라, 문맥 모델도 넘쳐 다음 단일 셀 / 셀 클러스터의 검출, 마이크로 전이성 병변의 형성을 포함하는 전이 캐스케이드 이전 사건을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 다중 면역 형광 염색법을 사용 하였다H & E 작은 병변의 존재를 확인하기에 충분하지 않다로가 단일 셀 또는 마이크로 전이성 병변 존재할 때 간에서 4T1, D2A1 및 D2.OR 유방 종양 세포를 검출한다. 도 3a는 간세포 마커 Heppar-1 팬 면역 마커 CD45에 대한 네거티브 상피 각질 CK18 긍정적 및 부정적 D2A1 종양 세포의 추정 미세 전이 병소를 가진 대표자의 Balb / C 마우스의 간을 나타낸다. 간세포는이 염색 패널에 Heppar-1의 사용을 필요로, CK18 양성 얼룩. 하나의 중요한 점은 담관 상피 간 전구 세포, 특히 문맥 주위 영역들 (도 3A)를 평가할 때, 종양 세포 및 담관 간의 차별주의를 필요 CK18 양성 염색 점이다. 대안 향상된 녹색 형광 태그 동계 유방 종양 라인을 이용하는 면역 단일 전파 세포 및 미세 전이 병소를 식별하는 다중화단백질 (eGFP는) 및 / 또는 루시 페라 제 및 태그 (그림 1C)에 대한 IHC를 수행합니다. 인해 eGFP는, 루시퍼 라제와 다른 단백질의 면역 원성, 이러한 전방 뇌하수체 75의 신규의 면역 능력 "적 선두"eGFP는 표현 마우스 루시퍼 이들 단백질 tolerized되는 마우스 모델을 사용하는 것이 필수적이다. 같은 D2A1 종양 라인과 같은 태그가없는 동계 라인의 macrometastatic 병변의 식별을 위해, CK18 / Heppar-1 / CD45 멀티 플렉스 면역 형광 (그림 3B)에 이상적이다.

figure-results-1
그림 1 : 포털 정맥 주입은 간으로 직접 종양 세포를 제공합니다. A) 포털 정맥 주사; 절개는 네 번째 사타구니 유선의 젖꼭지의 평면 위에 바로 리 아래 끝에서, 중간 및 왼쪽 시상면 사이에있다B 케이지. PBS 주입 (왼쪽)와 B)을 Balb / C 간. 문맥을 통해 인도 잉크 주입 후, 간 (중)이 아닌 폐 (오른쪽) 잉크를 차지한다. C) 문맥을 통해 1 × 106 개 종양 세포의 90 분 후 분사에서의 Balb / C 마우스 간에서 GFP 태그 D2A1 마우스 유방 종양 세포의 대표적인 얇은 부분 이미지. 간은 포르말린 고정 파라핀, 단면, 및 종양 세포의 검출을위한 항 GFP 항체로 염색 하였다. 상단 패널은 별표는 중심 정맥 주위의 비 특정 간세포 염색을 나타낸다 간 전반에 걸쳐 분산 진한 갈색 염색 종양 세포 (화살표)를 보여줍니다; 스케일 바 = 300 μm의. 하부 패널은 여전히 ​​밀접 혈관계와 연관된 90 분 후 분사에서 종양 세포의 대표적인 이미지를 보여준다; 스케일 바는 50 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 2 : 포털 정맥 주입 후 간에서 마우스 유방 종양 세포주의 파생물. A) 마우스에서 전이없는 생존율을 나타내는 카플란 - 마이어 곡선 2,000-10,000 4T1, D2A1 또는 D2.OR 마우스 유방 종양 세포를 주입. 마우스는 종양 세포를 주입하고 정리의 부족, 창백한 눈, 체중 변화를 포함하는 전이의 징후를 관찰 하였다. 전이는 부검시와 간의 조직 학적 섹션에 H & E에 의해 확인되었다. N은 = 2 4T1 2,000 셀; 2 4T1 10,000 세포. N = 2 D2A1 2,000 셀; 3 D2A1 10,000 세포. N = 3 D2.OR 2,000 셀; 3 D2.OR 10,000 세포. 주제 H & E B의 화상) 4T1 세포 병변 만, C) D2A1 병변 21 일 후 분사 10,000 암세포 이십육일 후 분사에, 그리고 D) D2.OR 병변에서10,000 세포 59 일 후 주입; 스케일 바는 75 μm의 =. 2000 4T1 D2A1 또는 종양 세포를 주입했을 때 유사한 병변이 관찰된다. 어떠한 병변 2000 D2.OR 세포 검출되지 않았다. 다른 기관이나 수술 절개 부위에서 전이의 증거는이 연구의 모든 마우스에서 알 수 없었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 3 : 멀티 플렉스 면역 형광을 사용하여 마우스 간에서 단일 세포 및 전이성 병변의 검출. 간문맥 주입 모델을 이용하여 90 분 후 분사에서의 Balb / C 마우스 간에서 D2A1 종양 세포의 A) 주제 다중 면역. 염색은 다중 키트를 사용하여 수행 하였다. 왼쪽에서 오른쪽으로 DAPI를 보여줍니다; CD45는 백혈구를 표시하는 단계; Heppar-1 훼손하는간세포 케이; 그리고 CK18는 종양 세포, 간세포, 및 담관 상피를 표시합니다. CD45 - - 밀접 포털 화음과 관련된 D2A1 종양 세포 병합 된 이미지는 CK18 + Heppar-1의 추정 클러스터를 보여줍니다. 화살표 = D2A1 종양 세포, 별표 = 담관 상피; 스케일 바는 25 μm의 =. B) A. 종양 세포와 같은 오염 패널을 사용하여 대표 명백한 D2A1 전이성 병변이 CK18 + 인접 간세포 CK18 Heppar + 1 + 반면; 스케일 바는 25 μm의 =. 현미경 이미지는 소프트웨어를 사용하여, 0.8 X 20 현미경에 40 X 13, 60 X 1.4 목적 및 CCD 카메라로 촬상 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

을 Balb / C 마우스 문맥 주입 모델 교란 다기관 전이의 부재 간에서와 완전 면역 능력 숙주에서 유방암 병소의 조사를 허용한다. 우리 프로토콜은 직접 간 16,55,56에 종양 세포를 주입하기위한 문맥에 대한 액세스를 허용 이전에 발행 된 수술의 발전이다. 우리가 만든 하나의 진보는 현저 만 종양 세포 / 주입하는 ≤ ≥ 1 × 105 세포 / 사출 다운 16,55,56으로부터 주입 된 종양 세포의 수를 감소시키는 것이다. 또한 간 유방암 전이 연구를위한 모델을 전개했다. 이 프로토콜을 이용하여, 공지의 전이 가능성이 유방암 세포주보다 대기 유방 종양 세포주보다 짧은 대기 시간 간 전이를 개발한다. 또한, 초기 시점에서, 종양 세포는 단일 CE 단일 또는 작은 그룹으로 간 실질 걸쳐 분포종양 세포 주입 후 LLS. 간에서 마이크로 전이성 및 명백한 전이성 질환의 발전에 기여하는 모든 표현형 - 모델은 종양 세포의 혈관 외 유출, 세포 생존, 휴면 및 증식을 포함한 전이 효율의 질문에 대한 답을 태세.

이는 시험을 개시하기 전에 문맥 주입 프로토콜의 다양한 측면을 고려하는 것이 중요하다. 조심스럽게 세포주, 세포 농도, 총 세포 수, 작은 탐색 적 연구를 기반으로 관심의 종점을 결정하는 것이 좋습니다. 또한, 면역 능력이 호스트와 동계 세포주의 사용은 호스트 종양 세포의 상호 작용을 이해하는 데 가장 중요하다. 앞쪽에 뇌하수체에서 새로 개발 된 "빛나는 머리"eGFP는 표현 마우스와 루시 페라 제는 외생 eGFP는과 루시 페라 제에 대한 호스트 응답을 제거하기위한 중요한 도구이며, 단백질은 종종 유방 종양 라인 (75)에 태그를 사용 . 은 "빛나는 머리"마우스와 동계의 사용은 종양 세포는 eGFP는 또는 루시 페라 제에 대한 염증 반응의 우려없이 IHC에 의해 하나의 전파 세포를 쉽게 식별 및 미세 전이 병소를 용이하게 태그. 마찬가지로, 최소 항 또는 약물 치료 요법에서 프로 종양 효과를 보장하기 위해주의 깊게 통증 관리 전략을 선택하는 것이 권장된다. 이 모든 결과를 혼동하는 바와 같이이 프로토콜의 중요한 단계가 발생하지 않는 감염을 확인하기 위해 수술을 통해 멸균 상태를 유지하는 것을 포함한다. 이 바늘 제대로 종양 세포가 간으로 전달되도록하여 문맥에 배치하는 것도 중요하다. 인도 잉크 등의 염료와 프로토콜을 연습하면이 문제에 도움이 될 것입니다. 피부 절개 사이트에서 종양 성장은 부적절한 바늘의 위치가 발생하는 가장 좋은 지표입니다. 마지막으로, 문맥 혈액 손실을 적절히 제어하는 ​​것이 중요하고 suturi 전적으로 종래 중지동물을 ng를. 지혈 가제를 사용하면 크게 주입 다음 문맥에서 제어되지 않은 혈액 손실의 위험을 감소시킨다. 우리 손에 의한 간문맥 다음 주사에서 혈액 손실 절차 관련 사망률 지혈 거즈를 이용하여 마우스의 2 %에서 30 % 감소되었다.

문맥 주입 모델 전체 전이성 캐스케이드 복제하지 않도록주의하는 것이 중요하지만, 혈관 외 유출 및 종양 성장 다음 암세포의 혈관 외 유출, 종양 세포 틈새 상호 작용 연구에 제한된다. 환자의 발생 등을 정확하게 간의 전체 전이성 캐스케이드를 복제 모델은, 시급히 필요하다. 간문맥 주입 모델의 추가 제한이 병의 진행에 영향을 76,77 공지 상처 치유와 호스트 수술의 영향에 의해 혼동된다는 것이다.

간문맥 주입 모델은 다른 주입의 개선을 나타낸다모델은 심장 내 및 intrasplenic 모델을 포함하여 간 전이를 공부합니다. 즉, 문맥 주입 모델들은 다른 조직에서 수반 전이에 의해 제한되는 심내 모델보다 질병 진행의 더 큰 범위의 연구를 허용한다. intrasplenic 모델 에서처럼 또한, 문맥 모델은 비장의 제거가 복잡하지 않다.

간문맥 주입 모델 일반 간전의 연구를위한 유용한 도구를 증명할 수있다. 간 전이> 특히 높은 췌장암의 비율 (전이의 85 %가 간으로 있습니다), 대장 및 직장 선암 (> 70 %)뿐만 아니라 위장과 식도 (와, 전체 30 선암의 전이의 가장 흔한 사이트입니다 %) 1. 췌장 및 결장 선암의 자발적 동소 차 종양 모델을 더 용이 78,79 간으로 전이되지만, 간문맥 주입 모델 잠 수도종양 세포의 조절 전달 이들 암의 전이 과정을 이해하는데 유용한 예는 종양 세포 도착 후 지정된 시간에, 생화학, 분자 조직 학적 평가를 허용한다. 요약하면, 문맥 주입 모델 유방암 가능한 간전이 모델에서 중요한 개선을 나타내고, 또한 일반적으로 간전 필드에 적용될 수있다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없으며 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 비디오 프로토콜 촬영 중 수술 절차를 지원해 준 Alexandra Quackenbush, 조직학적 지원을 제공한 Hadley Holden, 방법 개발 중 종양 및 간 병리학에 대한 의견을 제공한 Sonali Jindal, 원고에 대한 비판적 검토를 제공한 Breanna Caruso에게 감사를 표합니다. D2A1 및 D2.OR 유방 종양 세포는 Ann Chambers 박사의 선물이었고, D2A1-GFP 종양 세포는 Jeffrey Green 박사의 선물이었으며, 4T1 종양 세포는 Heide Ford 박사의 선물이었습니다. Jungers Center의 OHSU Advanced Light Microscopy Core가 이미징에 활용되었습니다. 이 원고에 포함된 작업에는 NIH/NCI, NRSA F31CA186524(ETG) 및 NIH/NCI 5R01CA169175(PS)의 자금 지원이 포함됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 ml 주사기 w/ 26게이지 바늘BD 주사기309597피하 부프레노르핀 주사를 위해; 주의하고 날카로운
알코올 준비 패드사용 Fisher Scientific06-669-62수술 절개 전 복부 청소를 위한
다목적 스폰지, 멸균Kendall80444" x 4", 대장과 소장을 보호하고 수분을 유지하기 위해 멸균 식염수에 담근 사용 수술
인공 눈물럭비370114미네랄 오일 15%, 백색 바셀린 83%; 수술 중 눈 보호를 위해 사용
레킷 벤키저NDC-12496-0757-10.05 - 0.1 mg/kg 체중에서 사용, 72시간 동안 매일 1 - 2회, 피하 주입
부피바카인 HCl, 0.5% (5 mg/ml)제조 Humira IncNDC-04091163-010.5%에서 사용, 수술 직후 1x, 10 μ L 절개 부위에 피하 주사 
항 CD45 항체BD Pharmingen550539전이성 병소 Celox&trade의 식별에서 백혈구를 배제하기 위해 다중 면역 형광에 사용
; 급속한 지혈 가제Medtrade 제품 주식 회사.FG088390115 mm² 조각으로 잘라, 주사 후 압력으로 문맥에서 혈류를 막는 데 사용하십시오.
화학적 탈모제를수술 부위의 털을 제거하는 데 사용하십시오; 여러 공급업체
가 Chlorhexidine, 2% SolutionVet One1CHL008주의하십시오, 마우스의 점막이나 귀에 chlorhexidine을 넣지 마십시오.
항-CK18 항체Abcamab53118전이성 병소를 식별하기 위한 다중 면역형광에 사용
Cotton Tipped Applicators, SterileFisher Scientific23-400-1146" Wooden Shaft 2개/봉투
D2A1, D2.OR 및 4T1 유방 종양 세포주와 함께 사용하기 위한High-GlucoseHyCloneSH30243.01
건식 유리 비드 살균기스테인레스 스틸 도구를 살균하기 위해 수술 사이에 사용하고, 매우 뜨거운주의를 사용하십시오. 여러 공급업체
의 에탄올, 70% 용액가연성 주의; 필요에 따라 수술 부위를 청소하는 데 사용; 여러 공급업체
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30071.03D2A1, D2.OR 및 4T1 유방 종양 세포주에 사용하기 위한 세포 배양 배지 첨가제, DMEM 고포도당 거즈에서 10%로 사용
, SterileKendall21462" x 2", 수술 절개 전 복부 세척을 위해 클로르헥시딘 2% 용액에 담근 사용
항녹색 형광 단백질 항체Vector LaboratoriesBA0702GFP 태그가 지정된 D2A1 또는 기타 유방 종양 세포주를 염색하는 데 사용
L-글루타민 200 mM (100x)Gibco25030-081D2A1, D2.OR 및 4T1 유방 종양 세포주와 함께 사용하기 위한 세포 배양 배지 첨가제, DMEM 고포도당 가열 패드에서 2 mM (1x)에서 사용
, x 2 - 3수술 및 회복 중 체온을 유지하기 위해 사용; 여러 공급업체
HemocytometerHausser Scientific1483세포 배양에서 세포를 세는 데 사용
Hemostatic Forceps스테인리스 스틸; 여러 공급업체
항Heppar-1 항체DakoM7158전이성 초점의 식별에서 간세포를 제외하기 위한 다중 면역형광에 사용
인슐린 주사기, 0.3 ml, 29-게이지BD   324702봉합 부위에 부피바카인 주사를 위해; 주의하고 날카로운
이소플루란피라말NDC-66794-017-252.5%이
소플루란 기화기에VetEquip911103주의, 마취 가스를 기화시
수술부위를 시각화하기 위한
중성 완충 포르말린, 10%Anatech 주식 회사.135유독성 물질 사용; 전이 종말점 및 전이 부담 평가에 대한 조직 고정제로 사용 조직학
Opal™ 4색 fIHC 키트PerkinElmer, Inc.NEL794001KT쥐 간에서의 전이를 감지하기 위해 Heppar-1/CD45/CK18의 다중 면역 형광에 사용
수술용 가위스테인리스 스틸; 주의, 날카로움 사용; 여러 공급업체
페니실린/스트렙토마이신, 100xCorning30-002-Cl세포 배양 배지 첨가제 D2A1, D2.OR 및 4T1 유방 종양 세포주와 함께 사용, DMEM 고포도
인산염 완충 식염수에서 1x 사용주사 전에 종양 세포를 재부유시키기 위해 1x에서 사용, 여러 공급 업체
Removable Needle Syringe, 25 μ l, 모델 1702Hamilton7654-01포털 정맥 주사용; 종양 세포가 장착된 바늘로 작업할 때는 주의해야 하며, 바늘이 부착되어 있을 때는 날카롭
메스 손잡이스테인리스 스틸로 되어
가 사용하는 메스 블레이드, #15탄소강, 멸균, 크기 15; 여러 공급업체
사용하는 작은 허브 제거 가능한 바늘, 32게이지Hamilton7803-04를 사용하십시오.문맥 주입의 경우 1" 길이, 포인트 스타일 4, 12°C; 각도, 33-34 게이지 재사용 가능한 바늘도 사용할 수 있습니다. 종양 세포가 로드된 바늘, 날카로운
차아염소산부식성 주의하십시오. 작업 공간과 표면을 소독하기 위해 10%에서 사용하십시오, 여러 공급업체
멸균 식염Fisher ScientificBP358-2120.9% NaCl 용액; 대안적으로, 집에서 만들고 멸균 여과할 수 있습니다
. 수술용 장갑, 멸균여러 공급업체
봉합사, 멸균 EthiconJ310H4-0 27" 코팅된 vicryl w/ 22 mm 1/2c 테이퍼 에탈로이 바늘; 주의하고 날카로운
테이블 탑 휴대용 마취기VetEquip901801소플루란 증발기를 마우스 마취에 사용하세요
. 엄지 드레싱 펜치스테인리스 스틸, 톱니형, 무뎌진; 여러 공급업체
수건 드레이프, 멸균;Dynarex441018" x 26", 히팅 패드를 덮고 수술 중 멸균 작업 공간을 제공합니다
Trypan BlueLife TechnologiesT10282생존력을 평가하기 위해 세포 배양에 사용하려면, 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x)Gibco25300-054조직 배양 플레이트에서 종양 세포를 분리합니다
DMEM, 세포 배양 배지 베이스의 의 투여됨 킴 광원 사용; 여러 공급업체당 습니다. 는 있습니다. 여러 공급업체가 나트륨을 사용하는 동안에는 주의를 사용하십시오. 가 있습니다. 수 이의 . 의 세포와 1:1로 사용하여 .

참고문헌

  1. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  2. Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
  3. Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
  4. Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
  5. Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
  6. Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
  7. Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
  8. Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
  9. Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
  10. Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
  11. Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
  12. Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
  13. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  14. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
  15. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  16. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
  18. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
  19. Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
  20. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
  21. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  22. Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
  23. Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
  24. Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
  25. Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
  26. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
  27. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
  28. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  29. Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489(2014).
  30. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
  31. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
  32. Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
  33. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
  34. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  35. Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
  36. Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
  37. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
  38. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212(2006).
  39. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
  40. Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
  41. Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
  42. Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
  43. Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
  44. Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
  45. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260(2012).
  46. Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
  47. Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
  48. Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
  49. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
  50. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677(2014).
  51. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
  52. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  53. Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469(2015).
  54. Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
  55. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29(2009).
  56. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
  57. Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
  58. Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
  59. Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
  60. Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
  61. Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  62. Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
  63. Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
  64. Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960(2015).
  65. Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35(2016).
  66. Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
  67. Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
  68. O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
  69. Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
  70. Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
  71. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
  72. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
  73. Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
  74. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
  75. Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
  76. Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
  77. Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
  78. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
  79. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).

재인쇄 및 허가

태그

유방암 모델종양 세포 주입마우스 간외과적 절개지혈 거즈생체 내 이미징H&E 분석면역형광 분석
포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.