사용 보상 추구 행동의 변화를 측정하는 간단한 방법 노랑 초파리

요약

우리는 보람 유도 및 보상 상태의 변화에 대한 조치로 자발적인 에탄올 소비를 사용하여 초파리 (Drosophila의 melanogaster의) 경험을 nonrewarding위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

우리는 보상 상태의 변화에 대한 프록시로 초파리에서 에탄올 자기 관리 (초파리)를 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 파리의 보상 시스템을 활용 자연 보상에 관한 경험을 수정하고 보상 상태의 변화에 ​​대한 조치로 자발적인 에탄올 소비를 사용하는 간단한 방법을 보여줍니다. 접근 방식은 내부 상태의 경험을 매개 변화에 중요한 역할을 신경 세포와 유전자를 연구하는 중요한 도구 역할을한다. 이 프로토콜은 두 개의 분리 된 부분으로 구성된다 보람 nonrewarding 경험 파리 노출 및 약물 보상을 얻기 위해 동기 척도로서 자주 에탄올 소비량을 분석. 두 부분은 각각 하류 분석을위한 초기 단계로 또는 독립적 인 두 선택 먹이 검정으로 환경의 조절을 유도하는 데 독립적으로 사용될 수있다. 프로토콜은 복잡한 설정이 필요하지 않으며, 따라서 모든 실험 실용으로 적용될 수있다기본적인 비행 문화 도구와 y를.

서론

경험의 질문에 답변 행동의 수정은 동물들이 환경 ^(1)의 변화에 자신의 행동을 조정할 수 있습니다. 이 과정에서, 동물은 외부 환경의 변화하는 조건에 내부 생리 학적 상태를 통합하고 이후 생존과 재생의 그들의 기회를 높이기 위해 다른 통해 하나의 동작을 선택합니다. 보상 시스템은 식사 또는 음주, 또는 ^자손이에 대한 성적 행동이나 배려 장기 생존을 보장하는 것과 같은 즉각적인 생존을 향상시키는 행동을 강화하여 개인과 종의 생존을 위해 필요한 행동 동기를 부여하기 위해 진화. 이러한 약물 남용 등의 인공 화합물은 자연 보상 ^(2)을 매개 공동 말인가 신경 경로에 의해 보상 시스템에 영향을 미칩니다.

지난 20 년 동안, 과일 molec을 공부 초파리 melanogaster의이 유망한 모델로 설립되었습니다 비행울라 행동 ^3,4-에서 에탄올의 효과를 형성하고 신경 메커니즘.

이전에, 우리는 약물 보상 ^(5)를 얻는 동기로, 파리에서 peptidergic 뉴런의 부분 집합 (NPF / NPF 수용체 (R) 뉴런) 등의 성적 경험으로 그 몇 자연 보상을 확인했다. NPF 표현은 모두 성적 경험과 에탄올 중독과 같은 약물 보상에 민감합니다. NPF 발현 수준의 변화는 높은 NPF는 줄이고 낮은 NPF 에탄올을 소비 할 수있는 환경을 증가 에탄올 자기 관리 ^5에 변경으로 변환됩니다. 그들은 또한 감소 에탄올 소비에 의해 반사되어 활성화,와 결합 냄새에 대한 강한 선호를 표시로 NPF 뉴런을 활성화하면, 파리에 대한 보람입니다. 더 중요한 것은, NPF 신경 세포의 활성화는 에탄올 중독과 냄새 큐 사이에 긍정적 인 관계를 형성하기 위해 파리의 기능을 방해한다. NPF / R 사이의 인과 관계시스템 보상 메모리 및 에탄올 소비 한 보상 ⁵ 상태의 변화에 대한 척도로서 에탄올자가 투여를 사용할 수 있음을 시사한다.

이 책에서 우리는 보상 지역에서의 비행 자연 보상 시스템과 시금 변경을 활용에 대한 통합 된 접근 방식을 보여줍니다. 접근 방식은 보상 상태의 변화에 ​​대한 추정치로 에탄올 자기 관리를 평가하기 위해 두 개의 선택 모세관 공급 분석 (CAFE) 다음에 두 개의 개별 부품, 천연 보상 관련 경험을 조작하기위한 훈련 프로토콜로 구성되어 있습니다. 카페 분석은 약물 자기 관리를위한 설치류 연구에 사용 된 두 병 선택 분석 유사과 파리 ⁶ 중독 같은 행동의 특정 속성을 반영하는 것으로 나타났다.

프로토콜

참고 : 실험 설계의 일반 개요 : 실험 디자인은 남성 파리가 4 (d)의 과정을 통해 3 연속 훈련에 보람과 nonrewarding 경험에 노출되는 구애 억제 ^7-9에 대한 적응 프로토콜을 포함한다. 4 D - 경험 단계의 끝에서, 파리 3 두 선택 자발적 에탄올 소비량 분석에서 시험된다. 다른 실험 (표 1)의 시작 이전에 적시에 이루어져야하는 동안 프로토콜은 본원에서 하나 이상의 실험에 사용되는 사전에 수행 할 수있는 몇 몇 가지 준비 단계를 포함한다.

1. 준비 단계

1. 모세관 공급 시스템 준비
   1. 27 G 바늘을 가열하고 유리 병 (그림 1)를 따라 작은 구멍을 천공하는 데 사용합니다.
   2. 면도날을 사용하여 반 (가로)의 유리 병 플러그를 잘라. squar를 마크를 생성하는 플러그의 표면에 네 개의 포인트E 형상 모세관 홀더에 위치한다. 플러그 (그림 1b)를 통해 4 구멍을 만들기 위해 18 G 바늘을 사용합니다.
   3. 그들은 단단히 어댑터 역할을 5 μL 유리 모세관을 보유 할 수 있도록 micropipets를 잘라 면도날을 사용합니다.
   4. 제조 된 플러그에 4 모세관 어댑터를 삽입합니다.
   5. 플러그에 2 에탄올 - 두 nonethanol 함유 모세 혈관의 위치를 ​​표시합니다.
      주 : 모든 병 일관성 모세 혈관의 2 종류의 위치를 ​​유지하는 것이 좋습니다. 큰 구멍은 튜브에서 파리의 탈출을 허용하는, 구멍의 크기에 주목. 또한,이 플러그를 절단하는 것은 파리에 얽힌 얻을 수있는 몇 가지 작은 느슨한 섬유를 생성로서, 유리 병에 삽입 할 때 아래로 향하게 옆으로 (일반적으로 절단 측 맞은 편) 플러그의 부드러운면을 사용하는 것이 좋습니다 .
   6. 튜브 및 어댑터 다수 모세관 공급 시스템에 사용될 준비 (카페)단계 2.3에서 설명한 실험.
2. 작은 유리 식품 유리 병을 준비
   1. 하루 파리 (단계 1.4)를 수집하기 전에, microcentrifuge 관 랙에 200 유리 병을 준비. 용융은 (는 옥수수 가루 당밀 레시피에 따라 재료의 표 참조) 음식을 비행 전자 레인지를 사용. 유리 병에 플라이 음식이 용액을 붓고 (유리 병 벽에 음식을 얼룩하지 않으려 고). 식품 경화하자, 플라스틱 포장으로 유리 병을 커버한다.
      주 : 식품을 함유하는 유리 바이알을 몇 주 동안 4 ℃에서 유지 될 수있다.
   2. 파리 컬렉션의 날, 냉장고에서 유리 병을 가지고 그들이 파리를 집에 사용하기 전에 RT에 도달 할 수 있습니다.
      참고 : 식품 유리 병이 몇 주 된 경우, 파리는 음식과 유리 사이의 균열에 갇혀 될 수있는 음식은, 그대로 및 유리 병에서 분리하지 있는지 확인하십시오.
3. 모세관 피더 분석 용 식품 메이커 스톡 용액
   1. 사전재고 음식 용액 (5 % 수 크로스, 5 % 효모 추출물) 깎다, 효모 추출물 5.88 g, 증류수 100ml에 수크로오스 5.88 g을 용해.
      주 : 원액 오염에 매우 경향이있다. 따라서,이를 오토 클레이브 추천 (121 ° C, 30 분, 및 건조 사이클없이) 분취 작업 850 μL로 나누어지는 것이 더 사용할 때까지 4 ℃에서 보관한다. 원액의 성분의 농도는 5.88 %이고, 단지 단계 230에서 그것의 사용 전에 15 %의 에탄올 또는 물 (이미 만들어진 식품 용액 850 μL에 150 μL)을 첨가 한 후 5 %의 최종 농도에 도달 할 것이다.
4. 실험 파리를 수집
   1. 공동 ₂ 패드를 사용하여 200 순진한 남성 파리를 수집합니다.
      주 : 실험적인 질문에 대한 관련 모든 실험실 균주를 사용합니다. 250 파리는 쉽게 우화의 선택 단계에서 파리의 다섯 병에서 수집 할 수 있습니다. 파리를 수집 할 때, 내지 컬럼에주의를 지불최근 eclosed있다 [선택] 파리 (처녀 보이는 파리 : 자신의 복부에 태변 자리를 함께 밝은 파리). 실험에 사용하기 전에 4 D 이전 - 파리 실험 3에 음식물 숙성을 포함하는 작은 유리 바이알에 단독으로 유지되어야한다.
   2. 유리 병을 닫습니다 부드러운 플러그를 사용합니다.
      참고 : 경험의 단계에와 유리 병 밖으로 여성을 삽입 입 포부를 사용할 때 같은 부드러운 플러그 트레이닝 단계에 매우 유용 할 것이다.
5. 트레이너 파리를 수집
   참고 : 모든 수집 파리 25 ° C 및 70 % 상대 습도 (RH)에서 12 시간 / 12 시간 빛 / 어둠 인큐베이터에 보관해야합니다. 12 시간 / 12 시간의 광 / 암주기 편리 시작 시간에 변경 될 수있다.
   1. 버진 여성 트레이너 파리
      1. 500 처녀 여성 트레이너가 WT의 주식 또는 처녀 받아 여성으로 사용하기 위해 virginator의 재고에서 날아 수집합니다. 일반 크기의 식품 유리 병 당 25의 그룹에서 여성의 파리를 유지하고, 모든실험에 사용하기 전에 4 D 세 - 3 세에게 오우.
   2. 성관계 여성 트레이너 파리
      1. 훈련 단계 (단계 1.6.1) 전에 짝짓기를 받아야하는 WT의 재고 또는 virginator의 재고 (300) 처녀 여성 파리를 수집합니다.
         참고 : 여성 파리는 일반 크기의 식품 유리 병 당 10 여성 그룹에 보관하고 3 세 있습니다 - 실험에 사용하기 전에 4 D 오래.
   3. 남성 파리 메이트 여성 트레이너 파리를 생성하는 데 사용
      1. (150) 남성 파리 (반드시 처녀)를 수집합니다.
         주 : 파리 3으로 일반 크기의 식품 유리 병 및 세 당 15 남성의 그룹에 보관 - 처녀 여자와 결합되기 전에 4 D 오래하면 결합 트레이너 여성을 만들 날아갑니다.
6. 성관계 여성 트레이너 파리를 생성
   1. (15) 남성이 여성-접점에 한 남성 함유 유리 병으로 젖혀 날아와 메이트 여성을 생성하려면 트레이너로 사용되는 파리, 10 처녀 여성의 쌍 그룹은 파리(2.1 단계) ¹⁰ 훈련 단계 전에 18 시간 - 유리 병 (16) ining.
      참고 :이 일반적으로 훈련 전에 저녁을 배치해야한다. 1.5 : 남자 사이 1 비율은 모든 여성이 성관계 될 것이라고 확신 여성 파리 (으)로 운항하는 항공사.
   2. 실험하는 날에, 입 흡입기를 사용하여 바이알로부터 수컷 흡입하여 수컷에서 암컷 짝을 분리한다. 각 훈련 일의 시작 전에이 권리를 수행합니다.

2. 실험 단계

1. 경험의 위상을 설정
   1. 인큐베이터에서의 광 위상의 시작에 가능한 한 가까이 실험을 시작한다. 동작 챔버 (처녀와 성관계를 모두) 트레이너 여성을 놓습니다.
      참고 :이 동작 챔버의 실험, 또는 조용하고 25 ° C, 60로 설정되어있는 한적한 환경 수행하는 것이 좋습니다 - 65 % RH합니다. 50 % 이상의 습도를 유지하는 것은 구애와 짝짓기 행동하기 때문에 매우 중요하다S가 습기에 민감한 것으로 알려져있다 페로몬 검출에 의존한다.
2. 보람 nonrewarding 경험에 남성 파리를 노출
   1. 랙의 가장자리를 따라 튜브를 배치, 마이크로 원심 랙에 단일 남성 파리를 포함하는 유리 튜브를 정렬합니다.
      참고 :이 배열은 실험자 쉽게 랙 밖으로 튜브를 복용하지 않고 교미를 받아야 파리의 쌍을 관찰 할 수 있습니다.
   2. 보람 nonrewarding 짝짓기 경험을받은 남성에 대한 별도의 랙 (즉, 거부 결합)에 파리 (단계 2.2.1에 설명 된대로) 단일 남성을 포함하는 100 유리 튜브의 두 그룹을 준비합니다.
   3. 기음 트레이너 여성과 남성 파리를 포함하는 각 유리 병에 추가합니다. 1 시간 동안 타이머를 설정합니다. 거부 된 그룹을 시작으로, 각 유리 병에 어울리게 여성을 추가합니다. 그런 다음, 결합 할 수있는 남자로 이동하고 각 바이알에 처녀 여성을 추가합니다.
   4. 밀접하게 결합 만남보기처녀 암컷과 상호 작용하는 남성이 첫 번째 시간 내에서 이전에 성관계 여성과 상호 작용 수컷이 짝짓기를하지 않는 것이 성공적으로 짝짓기되었는지 확인합니다. 1 시간에 걸쳐 거부 코호트 모니터링 15 분간 초 타이머를 설정하고, 남성에게 15 분마다를 시청할.
   5. 첫 번째 훈련의 말에 상대를 종료하지 않은 성관계 일대에서 거부 짝짓기를 관리 코호트과 남성의 남성 방전.
   6. 일반 즉석 식품 바이알에 이전에 정합 여성 트레이너를 흡입하여 제 1 트레이닝 세션을 종료하고, 다음의 컨디셔닝 세션을 유지한다. 부드럽게 결합 남성 그룹에서 여성을 흡입하여이 단계를 수행하십시오.
   7. 파리 1 시간 동안 휴식을 보자.
   8. 두 번 2.2.7 - 반복 2.2.3 단계를 반복합니다.
   9. 단계 2.2.3에서 훈련을 반복 - 2.2.8 세 이상의 D에 대한 매일.
3. 녹음 소비 (CAFE)
   1. 마지막 - 컨디셔너의 끝에g 세션 (네째 날), 모세관 공급 튜브에 하나의 남성과 그룹을 대기음. 파리를 삽입하는 동안 모세관 피더 유리 병을 커버하는 부드러운 플러그를 사용하여 모든 파리를 삽입 한 후 기성 모세관 공급 플러그로 신속하게 교체합니다. 그룹 6 - 조건에 따라 더 이상 8 튜브를 생성하지 않는 유리 병에 실험 그룹 각각 8 파리.
   2. 부드럽게 플러그의 위쪽에 물 5 mL를 추가하여 플러그 젖은. 물을 첨가하면 유리 병에 유출을 방지하는 동안주의해야합니다. 각 유리 병에 물을 같은 양을 추가합니다.
      주 :이 단계는 모세관으로부터 증발을 감소하기 위해 수행된다. 따라서, 실험의 나머지 동안 매일 반복된다. 상대 습도에 따라, 다음과 같은 일이 플러그에 추가되도록 적은 양의 물을 필요로 할 수있다.
   3. 15 %의 최종 농도를 생성 할 스톡 음식 분취 물에 에탄올을 첨가하여 두 가지 별개의 음식 용액을 준비한다.
   4. capill을 작성하려면두 음식 솔루션 양자리는, 액체 식품 실험실 필름 스트립에 상품 5 μL를 만들고이 5 μL 마크에 도달 할 때까지 용액이 모세관을 채울 수 있습니다. 5 μL 블랙 마크 라인에 가까운 모세 혈관의 명확한 끝을 사용하십시오.
      주 - 함께 8 모세관 어댑터 및 모세 혈관을 잡고 삽입으로 사용할 한번에 여러 개의 모세관을 입력하고, 그것을 6 접속할 수있다.
   5. 검은 색 마크에 정확히 음식 솔루션을 배치 파라핀 스트립에 부드럽게 모세 혈관을 누릅니다. 광유의 작은 방울로 각 모세관의 끝을 담가 모세관 인감. 이 단계는 음식 용액 전위 증발을 최소화한다.
   6. 모세 혈관의 노출 된 측면이 거의 유리 병 (플러그 표면에서 1mm 이하)의 내부에서 들여다 때까지 플러그의 4 어댑터 / 홀더를 통해 두 에탄올 함유 모세 혈관과 두 nonethanol 포함 된 모세 혈관을 삽입합니다.
      노트:파리는 일반적으로 플러그에 앉아서 먹이 노출 된 모세관을 아래로 상승으로 젖은 플러그에 가까운 모세 혈관의 개통을 유지하는 것은, 증발을 줄이고 음식에 쉽게 액세스 할 수 있습니다.
   7. 실험 파리를 포함하는 유리 병뿐만 아니라, 파리없이 모의 유리 병을 준비합니다. 이 컨트롤은 자연 증발을 평가하는 역할을한다.
      참고 : 차이가 변수 증발과 소비 데이터를 오해의 소지가 발생할 수 있으므로, 플러그에 비해 모세관 개방의 상대적으로 동일한 위치를 유지하려고합니다. 실험 기간 동안 적절한 습도를 유지하고 젖은 플러그에서 낮은 습도와 큰 거리로, 젖은 플러그에 최대한 가깝게 모세관 구멍의 위치를 ​​조절되지 않는 증발에서 모두 발생할 수 있습니다.
   8. 자를 사용 mm의 흑색 표시 라인에 대하여 각각의 모세관 내의 액체의 상대 위치를 기록하고,이 값을 기록해.
      주 : 용액 블랙 L 정확히 놓인 경우오프라인이 값은 0과 동일해야하고,이 위 또는 아래 인 경우에는 각각 양 또는 음의 값이되어야한다. 액의 초기 농도는 최종 O / N 소비 값의 참조 점을 설정한다.
   9. 24 시간 동안 인큐베이터에서 튜브를 설정합니다. 전체 실험에 ​​걸쳐 일정한 시간에 모세 혈관을 교체합니다.
   10. 바이알로부터 조심스럽게 제거 모세관 흑색 표시 라인에 대하여, 액체의 레벨을 측정한다.
   11. 조심스럽게 모의 유리 병의 액체 레벨을 확인합니다.
       참고 수준 이상 2mm 떨어진 경우 증발 높고 소모량 신뢰할 수없는 것으로, 그것은 나타낸다.
   12. 물 2 mL로 부드럽게 플러그를 적신 단계 2.3.3에 나타낸 바와 같이, 모세 혈관의 새로운 세트를 삽입 - 2.3.10. 24 시간 동안 인큐베이터에서 튜브를 설정합니다.
4. 확인 환경 설정
   1. 제 i에서 최종 레벨을 감산함으로써, 각 모세관의 총 소비량을 계산시작점 nitial 레벨.
   2. (에탄올 함유 모세 혈관 별도로 즉 nonethanol 모세 혈관) 같은 음식을 모두 모세 혈관의 값을 결합합니다.
   3. 에탄올 - 함유 모세관에서 소비되는 양에서 비 모세관 에탄올에서 소비 된 양을 뺀 에탄올 선호도를 계산하고 동일한 바이알 모든 모세관으로부터 총 소비량 값으로 값을 나눈다.
   4. 같은 실험 그룹의 모든 병의 기본 인덱스를 평균.
      
      참고 : Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), 에탄올 1 (E1), 에탄올 2 (E2), 총 nonethanol (총 NE) = NE1 + NE2, 총 에탄올 (총 E)가 E1 + E2를 =, 총 합 소비 (총 합계) = 총 NE + 총 E, 및 에탄올 선호 지수 (PI)

결과

FPreviously, Devineni 등은. 초파리는 에탄올 함유 식품을 소비 할 수있는 선택권을 부여 할 때, 그들은 음식 ^(6)을 포함 nonethanol 이상 에탄올 함유 식품에 대한 강한 선호를 표시하는 것으로 나타났다. 여기에 표시된 훈련 프로토콜을받지 않은 순진한 남성 파리의 타고난 에탄올 환경을 분석 할 때 우리가 얻은 몇 가지 대표적인 결과입니다.

순진 광저우 S 남성 파리는 4 일짜리까지 세, 우화에 수집하고, 4 D (그림 2)의 과정을 통해 에탄올을 소비하는 그들의 타고난 기본 설정에 대해 분석 하였다. nonethanol 음식을 통해 15 %의 에탄올 식품 소비에 대한 전시에게 강력한 환경 설정을 날아 에탄올 - 및 nonethanol 함유 솔루션 쇼에서 소비되는 양

토론

여기에서는 Devineni 등이 설명한 이전 작업을 기반으로 보상 추구 행동의 변화를 측정하기 위한 통합 접근 방식의 세부 사항을 설명합니다.⁶ 및 Shohat-Ophir et al 5. 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 다양한 유형의 성적 상호 작용을 경험 입력으로 사용하고, 두 번째 섹션에서는 2가지 선택 수유 분석을 사용하여 에탄올 소비 선호도에 대한 경험의 영향을 평가합니다.

Devineni et al.⁶, 파리의 에탄올 자가 투여는 강력한 행동으로, 처음에는 시간이 지남에 따라 증가하고 더 일관되게 되는 낮고 가변적인 선호도를 특징으로 합니다. 발달하는 선호도는 파리가 에탄올의 불쾌한 맛⁶ 및 에탄올 증기에 대한 초기 노출 동안 발생하는 것으로 알려진 혐오 반응에도 불구하고 에탄올의 약리학적 효과를 그 위치와 연관시키는 방법을 배우는 과정을 반영할 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리스티렌 25 x 95 mm 바이알	FlyStuff	32-109
좁은 플라스틱 바이알 flugs	FlyStuff	42-102
일회용 멸균 바늘 18 g 및 27 g		인수 할 수 있습니다	1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2 "), 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2 ")
10 x 75 mm 붕규산 유리 일회용 배양 튜브	kimble chase	73500-1075
보정 된 피펫 5 &# 956; L	VWR	53432-706	색상 코드 흰색은 5 μ을 포함합니다. L
미네랄 오일	시그마-알드리치	M5904
설탕, 분자 생물학 등급	CALBIOCHEM	573113
효모 추출물 미생물학용 분말	은 어떤 회사
에탄올	Sigma-Aldrich	32221
표준 피펫 팁(마이크로 피펫)	ThermScientific	T114R-Q	용량: 0.1 - 20 μ L (초극세)
IDENTI-PLUGS (폼 튜브 플러그)	Jaece	L800-A	는 6 - 13 mm의 개구부에 맞습니다
. IDENTI-PLUGS (폼 튜브 플러그)	Jaece	L800-D	는 35 - 45 mm
버진네이터 플라이 스톡에 맞습니다	블루밍턴 초파리 재고 센터	#24638
좁은 바이알, 트레이 팩(PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
초파리 미디어 조리법 및 방법	블루밍턴 초파리 재고 센터	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
프로피온산	Sigma-Aldrich	P5561
인산	시그마-알드리치
메틀 4-하이드록시벤조에이	트 시그마-알드리치	H3647
한천 한천	모든 회사에서
옥수수 가루	는 모든 회사에서
할머니의 당밀	B & G Foods, Inc	는