성체 신경 줄기세포(aNSCs) 확장을 위한 배양 시스템을 구축하면 치료를 위한 aNSC를 검사하고 적용할 수 있습니다. 굳은살하영역(subcallosal zone, SCZ)은 최근 성체 마우스에서 새로운 신경아세포 형성 영역으로 인식되고 있습니다. 여기에서는 SCZ-aNSC의 분리, 확장 및 분화 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
성체 신경 줄기세포(aNSC)는 손상된 뇌 조직의 재생에 사용할 수 있습니다. NSC는 뉴런(neuron), 성상세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)의 세 가지 유형의 세포로 분화 및 증식할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. aNSC 유래 영역을 식별하고 aNSC 특성을 특성화하는 것은 aNSC의 잠재적 사용과 신경 재생에서 aNSC의 역할을 규명하는 데 중요합니다. 백질과 해마 사이에 위치한 SCZ(subcallosal zone)는 최근 aNSC를 포함하고 지속적으로 신경아세포를 생성하는 것으로 보고되었습니다. SCZ에서 낮은 비율의 aNSC는 뉴런으로 분화됩니다. 대부분의 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 성상세포(astrocyte)와 같은 신경교세포(glial cell)로 분화됩니다. 이 세포는 외상성 피질 손상에 대한 치료 잠재력이 있는 것으로 제안됩니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 뇌에서 SCZ-aNSC를 생성하는 프로세스를 자세히 설명합니다. 1mm 간격의 뇌 매트릭스를 사용하여 SCZ가 포함된 코로나 절편을 얻고 전체 뇌에서 SCZ를 정밀하게 해부합니다. SCZ 섹션은 처음에 신경권 배양의 대상이 됩니다. 잘 발달된 배양 시스템은 이들의 특성을 검증할 수 있게 해주며 NSC에 대한 연구를 증가시킬 수 있습니다. 신경구 배양 시스템은 증식을 결정하고 진짜 NSC를 수집하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 단층 배양은 증식 및 분화를 분석하기 위한 in vitro 시스템이기도 합니다. 의미심장하게도, 이 배양 시스템은 신경구 배양 시스템보다 NSC에 더 동질적인 환경을 제공합니다. 따라서 이러한 배양 시스템은 별개의 뇌 영역을 사용하여 aNSC에 대한 지식과 치료 용도에 대한 응용을 확장하는 데 도움이 될 것입니다.
서론
NSC는 자기 재생과 다중 계통 분화의 특성을 가지고 있습니다. 이러한 특성을 확인하기 위해 신경권 배양 시스템이 널리 사용되었습니다. 신경구 배양 시스템은 1990년대 초에 개발되었으며 표준 줄기 세포 배양 시스템1으로 사용되었습니다. 자가 재생 효능에 따라 NSC는 지속적으로 증식하여 현탁 배양에서 세포 덩어리를 생성합니다. 세포의 수와 신경권의 크기는 NSC의 증식 특성과 밀접한 관련이 있는 것으로 간주됩니다. 단층 배양은 NSC의 유지 및 분화를 위해 널리 사용됩니다. 신경권 배양과 비교하여 단층 배양 시스템은 NSC의 더 나은 균질한 유지 및 확장을 제공합니다2. 이 두 가지 잘 발달된 배양 시스템은 in vitro에서 aNSC의 특성화에 기여했습니다.
NSC는 외심실의 뇌실하부(SVZ)와 해마의 과립하부(SGZ)와 같은 다양한 뇌 영역에 존재합니다3-5. 꼬리 피질하 백질의 굳은살하영역(subcallosal zone, SCZ)은 새로운 신경인성 영역(neurogenic region)으로 인식된다6-8. 최근 SCZ-aNSC가 외상성 뇌 손상에 대한 치료 잠재력이 있다고 보고되었다9. 다른 신경인성 영역과 비교했을....
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프로토콜
재료 및 문화 매체의 1. 준비
- SCZ의 해부와 해리를 들어, 알루미늄 호일로 뇌 매트릭스, 양날 면도날, 그리고 집게를 포장 한 다음 고압 증기 멸균하여 그들을 소독.
- 전체 마우스 뇌를 씻어 차가운 PBS 버퍼 50 ㎖를 준비합니다.
- 해부 현미경을 설정하고 뇌 (멸균 가위와 집게)의 해부에 필요한 수술 도구와 SCZ (1 ML의 주사기, 30 G 바늘, 뇌 매트릭스, 및 미세 집게)의 분리를 준비합니다.
- N2 매체의 제조 :
- F-12 / DMEM (+ L - 글루타민, + 탄산 수소 나트륨) 2 % B27, 1 % N2 보충, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 매체를 준비합니다.
주 : 성장 배지는 N2 배지 및 성장 인자로 구성 (20 NG / ㎖의 정제 된 표피 성장 인자 (EGF), 20 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF2)).
- F-12 / DMEM (+ L - 글루타민, + 탄산 수소 나트륨) 2 % B27, 1 % N2 보충, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 매체를 준비합니다.
- 소화 버퍼를 준비합니다 (40 단위 / ml의 파파인, 2.4 단위 / ㎖ dispas전자 II, 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 PBS에서) 조직 소화.
- 코팅 플레이트 및 커버 슬립의 제조 :
- (0.01 % PLO) 및 라미닌 (DH 2 O....
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결과
알 수없는 신경성 지역에서 aNSCs을위한 문화 시스템을 정의하는 것은이 세포를 이해하기위한 뇌 수리 (12)에 자신의 잠재적 인 사용을 개발하기위한 필수적이다. 다른 발달 단계에서 또는 다른 지역에서 NSCs을 다르게 3,4 행동 것으로 알려져있다. 최근에는 SCZ 유래 세포는 SVZ 유래 세포 7-9에 비해 생체 내 및 시험관 내에서 신경 세포의 분화, 차동 전위를 나타내는 것으로보고되었다. 따라서 정확하게 각 신경성 영역을 분리하기 위해 상기 SCZ 포함 뇌 조각은 1mm 뇌 매트릭스 (도 1A)를 사용하여 절개 하였다. 성장 인자와 함께 배양 8 일 후, SCZ로부터 유도 aNSCs는 세포이어서 (도 1b)를 유지할 수있는 neurosphere를을 형성 할 수있다.
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토론
본 논문은 성인 마우스 SCZ에서 NSCs의를 생성하는 다양한 응용 프로그램을 유지하기 위해 상세한 프로토콜을 설명합니다. SCZ-NSCs을 정화하고 확장하는 데 필요한 체외 배양 시스템을 구축하기위한 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, SCZ 영역 정확하게 다른 잠재적 신경성 영역 (도 1b)로부터 절개하는 것이 중요하다. SCZ 영역을 포함하는 두꺼운 정확한 섹션은 1mm 간격 뇌 매트릭스 수득 한 후, 미세 바늘이 다른 피질 영역 (도 1a)에서 SCZ의 미세 절개에 사용되었다. 비 NSCs의는 대뇌 피질과 같은 인접 조직에서 SCZ-aNSCs와 함께 배양하면, 치명적인 죽음에 부정적인 가능성 및 SCZ-NSCs의 16-18,22 분야 형성에 영향을 발생합니다. 꼬리 SCZ (정수리 2-3 밀리미터 후방)는 별개 SCZ-aNSCs를 생성하기위한 최선의 영역으로 확인되었다. 둘째, approp채취 및 계대 단계 riate .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미래창조과학부의 자금 지원을 받는 국립연구재단(NRF)의 뇌 연구 프로그램(보조금 NRF-2015M3C7A1028790)의 지원을 받았으며, 보건복지부의 자금 지원을 받은 한국보건산업진흥연구원(KHIDI)을 통한 한국보건기술연구개발사업(Korea Health Technology R&D Project)의 보조금으로 이루어졌습니다. 대한민국(HI14C3347).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>중간 구성 요소 | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-글루타민, +중탄산나트륨 |
| 펜/스트렙 | 인비트로젠 | 15140-122 | |
| N2 보충제 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 보충제 | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R& D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x 희석 |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine junps | WPI | 555229F | |
| 가위 | Storz | E3321-C | |
| 뇌 매트릭스(1mm) | RWD | 68707 | |
| 양날 면도기 | DORCO | ST-300 | |
| 30G 바늘 | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15ml 튜브 | SPL | 50015 | |
| 50ml 튜브 | SPL | 50050 | |
| 35mm 접시 | SPL | 10035 | 페트리 접시 |
| 100mm 접시 | SPL | 10090 | 페트리 접시 |
| 커버 슬립 (18mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 웰 접시 | SPL | 32012 | 비 코팅 |
| 6 웰 접시 | SPL | 32006 | 비 코팅 |
| < 강력 >코팅 재료 < / 강력 > | |||
| PLO | 시그마 | P4957 | 0.01 % |
| 라미닌 | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| 1차 항체 | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | 마우스 (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | 토끼 (1:1,000) |
| DCX | 산타 | SC8066 | 염소 (1:500) |
| Tuj1 | 시그마 | T2200 | 토끼 (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | 쥐 (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | 마우스 (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | 쥐 (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| 안티 토끼 488 | Alexa | A21206 | |
| 안티 토끼 cy3 | 잭슨 | 711-165-152 | |
| 안티 토끼 647 | 잭슨 | 711-605-152 | |
| 안티 염소 488 | Alexa | A11055 | |
| 안티 염소 cy3 | 잭슨 | 705-165-147 | |
| 안티 염소 647 | Invitrogen | A21447 | |
| 안티 랫트 488 | Invitrogen | A21208 | |
| 안티 랫트 cy3 | 잭슨 | 712-166-150 | |
| 안티 랫 647 | 잭슨 | 712-605-153 | |
| < 강한>Immunostaining 재료< / 강력 > | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3 % BSA 0.1 % 트리톤 X-100 PBS |
| 트리톤 X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | 핵 염색용 염료 |
참고문헌
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G.
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