성체 신경 줄기세포(aNSCs) 확장을 위한 배양 시스템을 구축하면 치료를 위한 aNSC를 검사하고 적용할 수 있습니다. 굳은살하영역(subcallosal zone, SCZ)은 최근 성체 마우스에서 새로운 신경아세포 형성 영역으로 인식되고 있습니다. 여기에서는 SCZ-aNSC의 분리, 확장 및 분화 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
성체 신경 줄기세포(aNSC)는 손상된 뇌 조직의 재생에 사용할 수 있습니다. NSC는 뉴런(neuron), 성상세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)의 세 가지 유형의 세포로 분화 및 증식할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. aNSC 유래 영역을 식별하고 aNSC 특성을 특성화하는 것은 aNSC의 잠재적 사용과 신경 재생에서 aNSC의 역할을 규명하는 데 중요합니다. 백질과 해마 사이에 위치한 SCZ(subcallosal zone)는 최근 aNSC를 포함하고 지속적으로 신경아세포를 생성하는 것으로 보고되었습니다. SCZ에서 낮은 비율의 aNSC는 뉴런으로 분화됩니다. 대부분의 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 성상세포(astrocyte)와 같은 신경교세포(glial cell)로 분화됩니다. 이 세포는 외상성 피질 손상에 대한 치료 잠재력이 있는 것으로 제안됩니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 뇌에서 SCZ-aNSC를 생성하는 프로세스를 자세히 설명합니다. 1mm 간격의 뇌 매트릭스를 사용하여 SCZ가 포함된 코로나 절편을 얻고 전체 뇌에서 SCZ를 정밀하게 해부합니다. SCZ 섹션은 처음에 신경권 배양의 대상이 됩니다. 잘 발달된 배양 시스템은 이들의 특성을 검증할 수 있게 해주며 NSC에 대한 연구를 증가시킬 수 있습니다. 신경구 배양 시스템은 증식을 결정하고 진짜 NSC를 수집하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 단층 배양은 증식 및 분화를 분석하기 위한 in vitro 시스템이기도 합니다. 의미심장하게도, 이 배양 시스템은 신경구 배양 시스템보다 NSC에 더 동질적인 환경을 제공합니다. 따라서 이러한 배양 시스템은 별개의 뇌 영역을 사용하여 aNSC에 대한 지식과 치료 용도에 대한 응용을 확장하는 데 도움이 될 것입니다.
서론
NSC는 자기 재생과 다중 계통 분화의 특성을 가지고 있습니다. 이러한 특성을 확인하기 위해 신경권 배양 시스템이 널리 사용되었습니다. 신경구 배양 시스템은 1990년대 초에 개발되었으며 표준 줄기 세포 배양 시스템1으로 사용되었습니다. 자가 재생 효능에 따라 NSC는 지속적으로 증식하여 현탁 배양에서 세포 덩어리를 생성합니다. 세포의 수와 신경권의 크기는 NSC의 증식 특성과 밀접한 관련이 있는 것으로 간주됩니다. 단층 배양은 NSC의 유지 및 분화를 위해 널리 사용됩니다. 신경권 배양과 비교하여 단층 배양 시스템은 NSC의 더 나은 균질한 유지 및 확장을 제공합니다2. 이 두 가지 잘 발달된 배양 시스템은 in vitro에서 aNSC의 특성화에 기여했습니다.
NSC는 외심실의 뇌실하부(SVZ)와 해마의 과립하부(SGZ)와 같은 다양한 뇌 영역에 존재합니다3-5. 꼬리 피질하 백질의 굳은살하영역(subcallosal zone, SCZ)은 새로운 신경인성 영역(neurogenic region)으로 인식된다6-8. 최근 SCZ-aNSC가 외상성 뇌 손상에 대한 치료 잠재력이 있다고 보고되었다9. 다른 신경인성 영역과 비교했을 때, SCZ는 피질하 백질을 따라 존재합니다. 인간의 뇌에서 피질하 백질은 쥐의 뇌보다 더 큰 영역을 차지합니다10. 따라서 체외 배양 시스템을 사용하여 SCZ-aNSC의 특성을 이해하는 것은 신경 재생을 위한 이러한 세포의 잠재적 사용을 촉진하는 데 중요합니다. 활성 또는 정지 상태의 NSC를 포함하는 원치 않는 영역에 의한 오염 가능성을 배제하기 위해 원하는 뇌 영역을 정확하게 해부하는 것이 필요합니다. 예를 들어, 비신경인성 영역의 aNSC는 손상된 뇌에서 또는 체외 배양 중에 활성화되어 새로운 신경 세포를 생산할 수 있습니다11. SCZ로부터 NSC를 얻기 위해, SCZ를 포함하는 뇌 절편에서 세포를 수집하였다. 그런 다음 가는 바늘을 사용하여 SCZ 영역을 주의 깊게 미세 해부했습니다. SCZ에서 신경구를 생성하기 위해 미세 절개된 SCZ 조직 덩어리를 단일 세포로 해리한 다음 표피 성장 인자(EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 있는 상태에서 현탁액으로 배양했습니다. SCZ-aNSC가 신경구를 형성한 후에도 확장을 위한 신경구 또는 단층으로 유지될 수 있습니다. 이 절차는 또한 단층 배양에서 NSC의 확장 및 분화 후 NSC와 그 자손을 검출하기 위한 다양한 마커를 사용한 면역염색 과정을 보여줍니다. 여기에서는 SCZ-aNSC 배양 시스템의 시각적 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜에는 SCZ 영역의 미세 해부와 세포의 유지 및 전달에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.
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프로토콜
재료 및 문화 매체의 1. 준비
- SCZ의 해부와 해리를 들어, 알루미늄 호일로 뇌 매트릭스, 양날 면도날, 그리고 집게를 포장 한 다음 고압 증기 멸균하여 그들을 소독.
- 전체 마우스 뇌를 씻어 차가운 PBS 버퍼 50 ㎖를 준비합니다.
- 해부 현미경을 설정하고 뇌 (멸균 가위와 집게)의 해부에 필요한 수술 도구와 SCZ (1 ML의 주사기, 30 G 바늘, 뇌 매트릭스, 및 미세 집게)의 분리를 준비합니다.
- N2 매체의 제조 :
- F-12 / DMEM (+ L - 글루타민, + 탄산 수소 나트륨) 2 % B27, 1 % N2 보충, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 매체를 준비합니다.
주 : 성장 배지는 N2 배지 및 성장 인자로 구성 (20 NG / ㎖의 정제 된 표피 성장 인자 (EGF), 20 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF2)).
- F-12 / DMEM (+ L - 글루타민, + 탄산 수소 나트륨) 2 % B27, 1 % N2 보충, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 매체를 준비합니다.
- 소화 버퍼를 준비합니다 (40 단위 / ml의 파파인, 2.4 단위 / ㎖ dispas전자 II, 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 PBS에서) 조직 소화.
- 코팅 플레이트 및 커버 슬립의 제조 :
- (0.01 % PLO) 및 라미닌 (DH 2 O에 용해 10 ㎍ / ㎖) 폴리 -L- 오르니 틴을 준비합니다. 단층 또는 면역 염색 18 밀리 된 커버로 SCZ-aNSCs의 유지 보수를 위해 코트 6 웰 플레이트, 4 ℃에서 하룻밤 PLO으로 그들을 품어. 그런 O.는 판과 커버 슬립 마지막 세척 후 건조하도록 허용 DH 2로 3 회 씻는다.
- 다음으로, 하룻밤 4 ℃에서 라미닌과 번호판을 품어. 그런 다음, DH 2 O.로 3 회 세척
주의 : 세포 부착에 영향을 미칠 것이다, 라미닌을 건조하지 마십시오.
주 : 코팅 용액을 3 번 재사용 될 수있다.
2. 분리 및 성인 SCZ의 해리
- 문화 준비하기 전에, 얼음에 뇌 매트릭스와 양날 면도기를 배치합니다.
참고 : 뇌 행렬을 동결 BR 때문에하지 마십시오아인은 부착 할 수있다. - CO 2 질식 또는 자궁 전위에 의해 (8 주 이전) 마우스를 희생.
- 70 % 에탄올을 분사 한 후 날카로운 가위로 머리를 잘라. 머리를 고정하기 위해 단단히 머리의 양쪽을 잡고. 꼬리 - 주동이의 방향으로 중간 선에서 가위로 피부를 잘라. 이것은 두개골에서 피부의 완전한 제거를 촉진한다.
- 지느러미 중간 선 위치에서 두개골과 뇌 사이의 집게를 삽입 먼저 두개골 (람다에 후부)의 꼬리 부분을 제거하고. 왼쪽 (또는 오른쪽) 정수리 뼈를 잡고 조심스럽게 벗겨. 다른 정수리 뼈의 제거에 대해이 절차를 반복합니다.
참고 : 시신경과 뇌의 수막 제거의 단선이 쉽게 두개골에서 뇌를 분리 할 수 있습니다. - 차가운 PBS 버퍼 (25 ㎖)에 뇌를 전송하고 여분의 혈액을 제거하기 위해 두 번 씻어.
- 얼음과 엄마의 뇌 매트릭스로 뇌를 배치KE 관상 삭감 1mm 두께의 슬라이스를 얻었다. 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 차가운 PBS로 뇌의 후방 부에 위치하는 SCZ 영역을 포함하는 뇌 조각 (1mm)으로 옮긴다.
주의 : 뇌 균열이 뇌 매트릭스의 중심선에 배치되도록, 관상 부의 평행 평면을 얻기 위해; 이 부분에서 불필요한 변형을 방지하는 것이 중요합니다.
참고 : 브레 그마에 2-3mm 후방에서 뇌 조각을 얻습니다; 이것은 SVZ에서 SCZ의 분리를 허용한다. - 저배율로 해부 현미경, 절곡 30G 바늘 6,9와 피질 및 해마의 백질 영역으로부터 SCZ를 마이크로 - 해부. 그런 다음, SCZ 위의 피질 영역을 제거합니다. 차가운 PBS없이 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 슬라이스의 해부 SCZ 영역을 배치합니다.
주 : 성숙 뉴런을 포함하는 여분의 영역의 오염 및 aNSCs neurosphere 형성 B의 생존에 영향을 미칠 수있는ecause 그들은 aNSC 배양 조건에서 세포 사멸을 겪는다. - 구부러진 30 G 바늘을 사용하여 즉시 작은 조각으로 해부 조직을 잘라.
주 : 긴 시간이 SCZ 조직을 절개 필요한 경우 초핑 전에 차가운 PBS의 해부 조직 몰입. - 다시 일시 분해 완충액 1 ㎖와 다진 조직을 분해 완충액 2 ml를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 조직을 전송하고, 37 ℃ 수조에 30 분 정도 배양한다.
참고 : 잘 혼합 튜브마다 10 분 흔들어.
3. 뇌량 밑 영역에서 파생 된 성인 신경 줄기 세포 배양
- 소화 조직을 떼어 놓다 약간 튜브를 누른 다음 5 분 동안 145 XG에 튜브를 원심 분리기. 소화 버퍼 씻어 예열 N2 배지 1 ㎖로 상등액 재현 탁 분해 된 조직을 폐기하고, 부드럽게 검액에게 P1000 피펫을 사용하여 5 회 최대 피펫.
참고 : 오버 분쇄하여 좁은로피펫 팁은 세포 생존 및 후속 성장을 감소시킬 수있다. - 5 분 동안 145 XG에서 튜브를 원심 분리기. 상청액을 폐기 한 후, N2 배지 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시.
- 비 코팅 된 6- 웰 플레이트에 N2 배지 1 ㎖를 제조하고이 용액의 최종 부피를 위해 현탁 한 세포를 가하여.
- 각 웰에 EGF (20 NG / ㎖)과의 bFGF (20 NG / ㎖)를 추가합니다. 부드럽게 도금 셀에 추가 성장 인자를 혼합하여 손으로 6 웰 배양 접시를 흔들. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 6 웰 플레이트를 유지합니다.
- 팔일 동안 매일 각 웰에 EGF (20 NG / ㎖)과의 bFGF (20 NG / ㎖)를 추가합니다. 모든 세 번째 날, 배지의 대략 2 mL의 부피를 유지하기 위해 N2 배지 200 μl를 추가한다.
neurosphere를 같이하고 단일 플라이 문화에 NSCs의 4.과 Passaging
- neurosphere를 수집하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송.
참고 : neurosphere를 수 (> 50 μm의 직경) 체육를물론 한 번의 마우스 뇌의 SCZ에서 r은 SVZ의보다 작은 64.3 ± 7.31이었다 (190.5 ± 6.33) 9. - 하나의 세포로 neurosphere를을 해리 37 ° C의 물을 욕조에 5 분 해리 버퍼의 0.5 ml의와 neurosphere를 품어. 기본 neurosphere를 단일 세포로 해리와 neurosphere 또는 단일 층 문화 등 여러 통로를 통해 유지 될 수있다.
참고 SCZ-aNSCs가 neurosphere 배양 형식 단층 배양 포맷> 10 배이지만 <5 회 계대 수 있기 때문에 단층으로 SCZ-aNSCs neurosphere를 확대하여 우수하다.
주의 : SCZ-aNSCs 강한 응집을 나타내고, 하나의 세포로 해리를하기 어렵다. 따라서, neurosphere 문화 형식은 일상적인 세포 확장하지 않는 것이 좋습니다. - 부드럽게 5 분 동안 145 XG에 위 아래로 P1000 피펫 미만 5 회 원심 분리 튜브를 시료 용액을 피펫. 상층 액과 다시 스와 폐기N2 배지 1 ㎖로 neurosphere를 쓴다.
참고 : 세포 생존과 이후의 성장을 감소 할 수있는 좁은 피펫 팁으로 분쇄하여 이상. - 세포 현탁액 (10 μL) 및 0.4 % 트리 판 블루 용액을 1 혼합물, 다음에 hematocytometer를 생균 수를 계산 : 세포를 계산하는 일을 만든다. PLO / 라미닌 6- 웰 플레이트를 코팅 한 후, 각 웰에 대한 N2 배지 2 ml를 2.5 × 105 세포 / ml의 세포를 접시.
참고 : 세포 밀도의 변화가 자신의 상태 및 분화 가능성에 영향을 줄 수 있습니다. - 오일에 대한 성장 인자의 매일 치료 SCZ-aNSCs (2 ㎖, 20 NG / ㎖)을 유지하고, 이들 통로들을.
뇌량 밑 영역에서 파생 된 성인 신경 줄기 세포의 분화 (5)
- SCZ-aNSCs의 분화 성장 인자와 함께 1 ml의 N2 (20 NG / ㎖) 1 × 105 세포 / ml와 PLO / 라미닌 코팅 18mm 커버 슬립 위에 평판 aNSCs.
- 다음날,세포가 단단히 커버 슬립에 부착 될 때, 성장 인자를 제거하기 위해 N2와 함께 성장 배지를 교환한다.
- 6일 후, 세포 파편을 제거하고 면역 그들을 수정 PBS 1 ㎖에 분화 세포를 세척 하였다.
주 : BrdU의 증식은 세포의 신규 합성 DNA에 혼입 될 수있다. 필요에 따라서, BrdU의 (10 μg의 / ㎖) 세포를 고정하기 전에 세포 살에 첨가 될 수있다.
6. 면역 염색 성인 신경 줄기 세포와 차별화 된 전구 세포
- 면역 염색을 위해, PBS로 세포를 세척하고, 실온에서 20 분 동안 4 % PFA로 고정합니다.
주의 : PFA는 매우 독성; 피부와 눈에 접촉을 피하십시오. - 의 4 % PFA를 제거 PBS로 3 회 고정 된 세포를 씻어 후 4 ° Cuntil가 면역 염색에 필요한에 저장합니다.
- (3 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100, 1X P 용액을 차단하여 커버 슬립에 세포를 부화실온에서 적어도 30 분 동안 BS).
- 신선한 차단 솔루션의 기본 항체를 준비하고 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어.
- aNSCs를 면역 염색
- 안티 네 스틴 및 BrdU의 항 - 항체를 사용 aNSCs 얼룩. 고정하기 전에 aNSCs에 BrdU의 20 μg의를 추가하고 2 시간 동안 그들을 품어. 차단 단계를 수행하는 37 Cbefore에서 20 분 동안 2 N 염산을 사용하여 변성 단계를 수행합니다.
- 차별화 된 전구 세포를 면역 염색 :
- 차별화 된 전구 세포에 라벨을 방지 O4, 안티 bIII - 튜 불린, 및 안티 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 항체를 사용합니다.
- aNSCs를 면역 염색
- PBS로 3 번 샘플을 세척하고, 형광 염료 (1 : 500)에 접합 된 이차 항체로 배양 한 30 분 동안 실온에서 용액을 차단한다. 그런 다음, PBS로 샘플을 3 회 반복한다.
참고 : 차의 호스트와 일치를 사용하여 이차 항체를항체. Hoechest33343 (1 : 2000)은 핵 염색에 사용됩니다. - 슬라이드 글라스에 장착 솔루션을 추가하고 설치를 진행합니다. 여러 파장에서 공 초점 현미경에 샘플을 관찰하고 이미지 : FITC (488 나노 미터)를 Cy3 (543 ㎚), Cy5에 (647 ㎚), 및 Hoechest33343 (405 nm의).
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결과
알 수없는 신경성 지역에서 aNSCs을위한 문화 시스템을 정의하는 것은이 세포를 이해하기위한 뇌 수리 (12)에 자신의 잠재적 인 사용을 개발하기위한 필수적이다. 다른 발달 단계에서 또는 다른 지역에서 NSCs을 다르게 3,4 행동 것으로 알려져있다. 최근에는 SCZ 유래 세포는 SVZ 유래 세포 7-9에 비해 생체 내 및 시험관 내에서 신경 세포의 분화, 차동 전위를 나타내는 것으로보고되었다. 따라서 정확하게 각 신경성 영역을 분리하기 위해 상기 SCZ 포함 뇌 조각은 1mm 뇌 매트릭스 (도 1A)를 사용하여 절개 하였다. 성장 인자와 함께 배양 8 일 후, SCZ로부터 유도 aNSCs는 세포이어서 (도 1b)를 유지할 수있는 neurosphere를을 형성 할 수있다.
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토론
본 논문은 성인 마우스 SCZ에서 NSCs의를 생성하는 다양한 응용 프로그램을 유지하기 위해 상세한 프로토콜을 설명합니다. SCZ-NSCs을 정화하고 확장하는 데 필요한 체외 배양 시스템을 구축하기위한 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, SCZ 영역 정확하게 다른 잠재적 신경성 영역 (도 1b)로부터 절개하는 것이 중요하다. SCZ 영역을 포함하는 두꺼운 정확한 섹션은 1mm 간격 뇌 매트릭스 수득 한 후, 미세 바늘이 다른 피질 영역 (도 1a)에서 SCZ의 미세 절개에 사용되었다. 비 NSCs의는 대뇌 피질과 같은 인접 조직에서 SCZ-aNSCs와 함께 배양하면, 치명적인 죽음에 부정적인 가능성 및 SCZ-NSCs의 16-18,22 분야 형성에 영향을 발생합니다. 꼬리 SCZ (정수리 2-3 밀리미터 후방)는 별개 SCZ-aNSCs를 생성하기위한 최선의 영역으로 확인되었다. 둘째, approp채취 및 계대 단계 riate ...
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미래창조과학부의 자금 지원을 받는 국립연구재단(NRF)의 뇌 연구 프로그램(보조금 NRF-2015M3C7A1028790)의 지원을 받았으며, 보건복지부의 자금 지원을 받은 한국보건산업진흥연구원(KHIDI)을 통한 한국보건기술연구개발사업(Korea Health Technology R&D Project)의 보조금으로 이루어졌습니다. 대한민국(HI14C3347).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>중간 구성 요소 | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-글루타민, +중탄산나트륨 |
| 펜/스트렙 | 인비트로젠 | 15140-122 | |
| N2 보충제 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 보충제 | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R& D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x 희석 |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine junps | WPI | 555229F | |
| 가위 | Storz | E3321-C | |
| 뇌 매트릭스(1mm) | RWD | 68707 | |
| 양날 면도기 | DORCO | ST-300 | |
| 30G 바늘 | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15ml 튜브 | SPL | 50015 | |
| 50ml 튜브 | SPL | 50050 | |
| 35mm 접시 | SPL | 10035 | 페트리 접시 |
| 100mm 접시 | SPL | 10090 | 페트리 접시 |
| 커버 슬립 (18mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 웰 접시 | SPL | 32012 | 비 코팅 |
| 6 웰 접시 | SPL | 32006 | 비 코팅 |
| < 강력 >코팅 재료 < / 강력 > | |||
| PLO | 시그마 | P4957 | 0.01 % |
| 라미닌 | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| 1차 항체 | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | 마우스 (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | 토끼 (1:1,000) |
| DCX | 산타 | SC8066 | 염소 (1:500) |
| Tuj1 | 시그마 | T2200 | 토끼 (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | 쥐 (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | 마우스 (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | 쥐 (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| 안티 토끼 488 | Alexa | A21206 | |
| 안티 토끼 cy3 | 잭슨 | 711-165-152 | |
| 안티 토끼 647 | 잭슨 | 711-605-152 | |
| 안티 염소 488 | Alexa | A11055 | |
| 안티 염소 cy3 | 잭슨 | 705-165-147 | |
| 안티 염소 647 | Invitrogen | A21447 | |
| 안티 랫트 488 | Invitrogen | A21208 | |
| 안티 랫트 cy3 | 잭슨 | 712-166-150 | |
| 안티 랫 647 | 잭슨 | 712-605-153 | |
| < 강한>Immunostaining 재료< / 강력 > | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3 % BSA 0.1 % 트리톤 X-100 PBS |
| 트리톤 X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | 핵 염색용 염료 |
참고문헌
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