비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

요약

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

초록

시험관 내에서 세포막 단백질 연구가 많이 소수성 막 횡단 도메인의 존재에 의해 복잡하게된다. 또한 이러한 연구를 복잡하게, 리포좀에 세제 - 가용화 된 막 단백질의 reincorporation 단백질 토폴로지를 적용하는 것은 불가능 확률 과정이다. 본 논문은 리포좀 기반의 발판을 이용하여 이러한 도전적인 기술에 대한 대체 방법을 제공합니다. 단백질의 용해성은 경막 도메인의 결실에 의해 강화되며, 이러한 아미노산 같은 그의 태그 같은 더링 잔기로 대체된다. 이것은 테더가 리포솜의 표면에 균일 한 단백질 토폴로지를 적용 (니트릴 로트리 아세트산 그의 태그 된 단백질 (NTA (니켈 ^2+))에 의해 조정 니켈 ²⁺⁾ 앵커링 그룹과 상호 작용한다. 필수 막 단백질 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)와 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 사이의 상호 작용이 INVE이었다 상기 예가 제시이 골격 리포솜 법을 이용 stigated. 이 작품에서 우리는 효율적으로는 GTPase 활동을 자극 리포좀의 표면에 용해 Drp1을 모집 MFF의 능력을 증명하고있다. 또한 Drp1 특정 지질의 존재 MFF 장식 지질 템플릿 관 모양 할 수 있었다. 이 예는 구조 및 기능 분석을 사용하여 골격 리포좀의 효과를 보여주고 Drp1 활성을 조절하는데 MFF의 역할을 강조한다.

서론

막 인접 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부 인해 ¹ 포함 된 통합 막 단백질의 기본 환경을 recapitulating 어려움에 도전적인 노력이다. 이 세제 용해 필요성 및 테오 단백질의 방향 불일치에 기인한다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 우리는 통합 막 단백질의 가용성 도메인 그의 태그 융합 단백질로서 발현된다 전략을 채용 한 이러한 가용성 단편 지질에 NTA (니켈 ²⁺⁾ headgroups와의 상호 작용을 통해 지지체 리포솜에 고정되고 표면. 이러한 발판 사용 근위 지질 단백질 상호 작용은 지질 및 단백질 조성의 범위를 조사 할 수있다.

우리는 효과적으로 홍보를 조절하는 지질 상호 작용을 미토콘드리아 분열 복합체의 조립을 지배하는 중요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하고 검토하려면이 방법을 적용했습니다ocess ^2. 미토콘드리아 분열 동안 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) ^{3이라고하는} 보존 막 리모델링 단백질은 에너지 항상성, 세포 사멸 신호, 및 기타 여러 가지를 조절 세포 신호에 응답하여 상기 외부 미토콘드리아 막 (OMM)의 표면에 채용되고 필수적인 미토콘드리아 처리합니다. ^{8 -이} 큰, 세포질....

프로토콜

1. 비계 리포좀의 제조

참고 : 이상적으로, 초기 실험은 DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 또는 PC)와 DGS-NTA (니켈 ^{2 +)} (1,2-dioleoyl로 구성된 비교적 간단하고 특색 발판을 (사용해야합니다 - SN -glycero -3 - [(N은 - (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산) 숙시 닐]. (니켈 염)) 건축 실험 오프 지질 전하, 유연성 및 굴곡 개별 요소로서 도입 될 수있다 잠재적으로 막 근위 상호 작용을 변경한다. 이러한 변경 또는 포스파티딜 리핀 (CL), 포스파티딜 에탄올 아민 (DOPE 또는 PE) 또는 락토 (β) 세라미드 지질 성분을 포함한 특정의 한정된 양의 첨가에 의해 달성 될 수있다.

1. 깨끗한 유리 시험관에 클로로포름 지질 결합. 얇은 지질막을 형성하도록 튜브를 회전시키면서 건조 질소 가스에 용제를 증발시켰다. centrifuga와 잔류 용매를 제거37 ° C에서 1 시간 동안 L 증발기.
   참고 : 다양한 리포좀 제제는 프로토콜에 사용되는 아래에 설명 : 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 ^{2 +)} / 96.....

결과

MFF Drp1과의 상호 작용은 미토콘드리아 분열에 중요한 것으로 입증되었지만, 이러한 상호 작용은 시험 관내에서 요점을 되풀이하기 어려웠다. 우리의 목표는 더 나은 Drp1과 MFF 상호 작용에있어서, 상기 세포 환경을 에뮬레이션하는 것이 었습니다. 이를 위해 리포좀 NTA (니켈 ²⁺⁾ headgroups의 제한 농도를 함유하는 전술 한 바와 같이 지질 막을 재수 화하여 제조 하였다. 용액 (도 1a)의 불투명도에 의해 입증 지질 용액은 초기 이종 직경의 단일 층 및 다중 층 소포로 구성된다. 이 불투명도는 다중 층 소포의 유병률을 감소 동결 해동 (그림 1b)에 의해 감소된다. 리포솜 직경은 상기 투명 용액 (도 1C)을 초래 폴리 카보네이트 필터를 통해 압출하여 균질화한다.

토론

이 프로토콜은 통합 막 단백질을 포함하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하는 방법을 제공한다. 모듈 리포솜 지지체를 이용하여, 연구자들은 지질 근위 환경에서 하나 이상의 단백질의 활성을 사정 할 수있다. ^{26 -} 이전 연구 세포막 수용체 ^(24)의 효소를위한 동일한 방법을 증명하고있다. 우리는 지질 보조 인자를 포함하고 미토콘드리아 분열 기계의 mechanoenzymatic 핵심을 구성하는 단백질 사이의 상호 작용을 탐구하는이 방법을 확장했다.

위에서 제시 한 모델 시스템을 위해, 우리는 MFF 장식 SL이 Drp1의 자기 조립을 강화 것으로 나타났습니다. 또한, 우리는 이제 MFF 장식 ESL 템플릿 효율적으로 확장 관 구조를 형성하도록 야생형 Drp1으로 개조 된 것을 나타낸다. 또한 음전기 리핀 및 원뿔형 지질 PE 등 다양한 미토콘드리아 지질의 역할을 평가 하였다.PE에 의해 부여 막의 유연성과 유동성 막 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포스파티딜콜린(DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine(DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics
리포좀 압출기	Avanti 극성 지질	610023
Cu/Rh 네거티브 스테인 그리드	Ted Pella	79712
마이크로퓨지 튜브	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
마이크로타이터 플레이트 스트립	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
염화 마그네슘	Acros 유기물	223211000
4 - 20% SDS-PAGE 젤	바이오 라드	456-1096
4x Laemmli 로딩 염료	바이오 라드	161-0747
HCL	피셔 사이언티픽	A144S
공작석 그린 카르비놀	시그마 알드리치	229105
암모늄 몰리브덴셜 테트라하이드레이트	시그마 Aldrich	A7302
실험실 필름	파라필름	PM-996
우라닐 아세테이	Polysciences	21447
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