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방법 논문

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

9K 조회수

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DOI:

10.3791/54981

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2017년 2월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

이 논문에서

요약

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

초록

파킨슨 병 (PD)에서 운동 완만, 강성 및 진동에지도하는 SNC에서 도파민 뉴런의 발음 변성 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실이있다. 형광 마커를 사용하여 기본 복부 중뇌 (VM) 문화 생활 도파민 신경 세포의 식별은 고정 된 세포의 면역 염색에 의존하지 않고 이러한 신경 세포의 선택적 취약점을 연구하는 다른 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 분리, 해리, 문화 마우스 VM 신경 삼주합니다. 우리는 그 다음의 (a 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터에 의해 구동) eGFP는 형광을 이용하여 문화에서 도파민 신경 세포를 식별합니다. 개별 뉴런 유리 가능한 Micropipette를 사용하여 마이크로 원심 튜브에 수확된다. 다음으로, 우리는 수확 된 세포 용균 및 단일 세포 RNA-SEQ 라이브러리 (1, 2)를 생성하는 cDNA 합성 및 트랜스포존 매개 "tagmentation를"행위엉덩이 = "외부 참조"> 3, 4, 5. 품질 제어 검사를 통과 한 후, 단일 셀 라이브러리는 서열화되고 후속 분석은 유전자 발현을 측정하기 위해 수행된다. 우리는 개인의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 사체 결과를보고한다. 우리는 수확 서열 된 라이브 TH-eGFP는 세포의 100 % 도파민 신경 세포라고보고한다. 이러한 기술은 신경 과학 및 분자 생물학에서 광범위하게 응용 프로그램을 제공합니다.

서론

파킨슨 병 (PD)는 불치, 노화와 관련된 퇴행성 신경 질환이다. 이 비교적 흔한 질환의 원인은 제대로 이해 남아 있습니다. 운동 완만, 강성 및 진동의 진단 임상 양상에 이르는 Substantia 그라 (SNC)에서 도파민 뉴런의 뚜렷한 신경 세포의 변성과 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실은있다.

SNC의 도파민 신경 세포를 포함하는 차 혼합 문화는 파킨슨 병에 특히 적합하다. 복부 피개 영역 (VTA) 도파민 뉴런은 보상과 중독에 연루되어있다. 복부 중뇌 (VM) 차 혼합 배아 문화 SNC와 VTA의 도파민 (DA) 신경 세포와 GABA 성 신경 세포 모두를 포함한다. VM 일차 배양 신경 분석에 유용 할 수 있고, 도파민 성 신경 세포의 선택적 취약점 해명. 형태에 따라 문화에서 도파민 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법은 없습니다. 그우리는 단일 셀, 고 수율 RNA 시퀀싱 라이브러리를 식별하고 하나의 도파민 신경 세포를 수확하고 구성하는 기술을 개발 재.

우리는 하나의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 대표의 RNA 전 사체 데이터를보고합니다. 이 프로토콜은 DA / GABA 사체의 다양한 치료법의 효과를 연구하기 위해 신경 보호, 신경 퇴화, 및 약리학 적 분석에 이용 될 수있다. 도파민 뉴런 VM 차 배양에서 발현 뉴런의 소수를 표현하기 때문에, 안정적으로 생활 문화 뉴런을 식별하는 능력은 단일 셀 연구 향상된 범위를 가능하게 할 것이다. 이 새로운 기술은 세포 수준에서 발생하는 메커니즘을 이해하는 발전을 촉진하고 다른 신경 및 분자 생물학 분야에서의 응용을 가질 수있다.

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프로토콜

참고 : 모든 실험 관리 및 국민 건강의 연구소 및 프로토콜에서 제공하는 동물의 사용에 대한 지침에 따라 수행 하였다는 캘리포니아 공과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

배아 마우스 뇌에서 차 도파민 세포 배양 1. 유도

  1. 솔루션 및 문화 매체
    1. 아스 코르 산 원액의 제조
      1. 아스코르브 산 352 mg의 칭량. 20 ㎖의 최종 총 부피에 멸균 H 2 O를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 넣어 용해합니다. -20 ° C에서 500 μL 씩 0.2 μm의 주사기 팁과 저장소를 통해 필터링합니다.
    2. 파파인 원액의 제조
      1. 15 단위 / 1 배 Hanks' 균형 소금 용액 ㎖ (HBSS)에 파파인을 희석. 최대 피펫 5 배 아래로 철저하게 혼합 할 수 있습니다. 해부의 날에 준비합니다.
    3. DNase의 원액의 제조
      1. DNase의 20 밀리그램을 달아. 20 ㎖의 총 최종 부피에 멸균 H 2 O를 추가합니다. 0.2 μm의 주사기 필터 팁 살균 필터. 1 mL의 분취 량에서 -20 ° C에서 보관.
    4. 정지 용액의 조제
      1. 45 mL의 1 배 HBSS에 10 % 5 ㎖ 기증자 말 말 혈청을 희석. 0.2 μm의 주사기 필터 팁 살균 필터. 4 ℃에서 보관하십시오.
    5. 4 % 소 혈청 알부민 (BSA) 원액의 제조
      1. BSA의 2g을 달아 45 mL의 총 최종 볼륨 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 필터는 0.2 ㎛의 주사기 필터 팁 살균. 4 ℃에서 보관하십시오.
    6. 도금 매체의 제조
      1. 494 mL의 매체에, L- 알라 닐 -L- 글루타민 (L-글루타민 안정화 소스)와 도너 말 혈청 5 mL를 포함 1.25 ㎖의 배양 배지를 추가한다. 필터 0.2 μm의 주사기 FIL과 소독터 팁. 4 ℃에서 보관하십시오.
    7. 세포 배양 배지의 제조
      1. 196 mL의 도금 매체로, 4 mL의 B27 200 μL의 아스 코르 빈산을 추가합니다. 필터 0.2 μm의 필터로 살균. 4 ° C에서 솔루션을 저장하고 주일 이내에 사용한다.
    8. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액의 조제
      주의 : 다음과 같이 파라 포름 알데히드를 사용하여 일반적인주의 사항은 다음과 같습니다, 증기의 흡입을 방지, 피부와 눈 접촉을 피하십시오, 흄 후드를 사용하여 열이나 화기에 가까이하지 말 것. 적절한 개인 보호 복을 착용 할 것. PFA 따라서 철저하게 취급 후에는 손을 씻고, 과민성 피부염의 원인이 될 수 있습니다.
      1. 1X PBS, pH 7.4의 30 mL의 16 % PFA의 10 ML을 추가합니다.
    9. 0.1 % 트리톤 X-100의 제조
      1. 피펫 1 mL의 트리톤 X-100을 9 mL의 PBS 1X로는 10 % 용액을 제조한다. 피펫 천천히 점성 용액을 피펫 팁을 채울 수 있습니다. DIS 37 ° C를 물을 욕조에 따뜻한풀다. 4 ° C에서 10 %의 주식을 저장합니다.
      2. 이 직렬 1시 10분 희석을 행함으로써, 예를 들어 0.01 % (10 % 스톡을 희석하여 1 % 용액을 만들기 위해 9 ㎖의 1X PBS로 1 ㎖의 10 % 용액을 희석 9 ㎖의 1X PBS에 1 % 용액 1 ㎖ 있도록 0.1 % 용액).
    10. 10 %의 제조 1 % 당나귀 혈청
      1. 10 %의 솔루션을 1X PBS의 9 mL의 당나귀 혈청의 1 ML을 추가합니다. 1 %의 솔루션을 1X PBS, pH 7.4의 49.5 mL의 당나귀 혈청 0.5 mL를 넣고.
    11. 1X PBS의 준비
      1. O.는 pH 미터를 사용하여 pH를 7.4로 용액의 pH를 조정 H 2 450 ㎖ 중에 50 ㎖를 첨가하여 10 배 PBS 1 배 희석.
  2. 문화 요리를 코팅
    1. 폴리 -L- 오르니 틴 코팅
      1. 멸균 기법을 사용하여 120 μL 폴리 -L- 오르니 틴과 모든 35mm 접시의 중앙 코트 만 10mm 직경의 유리 바닥. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어. 폴리 소호 흡인 진공 흡입기를 사용하여rnithine. 멸균 H 2 O로 두 번 요리를 씻어
    2. 라미닌 코팅 (1 mg을 재고 농도 / ㎖)
      1. 멸균 H 2 O (최종 농도는 0.01 ㎎ / ㎖) 2 ㎖의 20 μL 라미닌 희석.
      2. 0.01 mg의 희석 라미닌 120 μL 모든 접시의 중앙 코트 만 10mm 직경의 유리 바닥 / ㎖의 멸균 기술을 이용하여, 사용하기 전에 37 ℃에서 1 시간 또는 O / N 부화.
  3. 마우스 해부
    주 :이 문화 인큐베이터에 배아 주머니에서 전송로이 절개의 방법은, 세포의 최소한의 노출을 위해 설계되었습니다. 세포의 생존율은 중뇌 해부 뇌의 일부를 제거함으로써 유지된다. 필요없이 더 빨리 중뇌 진행 격리 지역에 액세스 할 수있는 전체 뇌를 해부한다. 본 연구에 사용 된 마우스 변형에 대한 재료의 표를 참조하십시오.
    1. CO 2를 사용하여 임신 14 일에 초과 임신 한 마우스를 안락사.
    2. 70 % 에탄올로 안락사 마우스의 복부를 스프레이. 2 × 3 이빨 집게를 사용하여 낮은 복부의 피부를 잡고 무딘 칼날 수술 가위를 사용하여 복강을 엽니 다. 각면에 횡 방향 및 근위 이동이 컷을 확인합니다. 복강을 노출 포셉을 사용하여 복벽을 통해 접어.
      참고 : 자궁 이제 노출된다. 흉막 캐비티 및 기흉의 생성을 노출하는 것은 동물이 회복되지 않는 것을 보장한다.
    3. 자궁을 분리하기 위해 자궁의 양쪽 끝을 잘라. 멸균 후드에 페트리 접시에 놓습니다.
    4. 각 손에 스트레이트 팁 집게를 사용하여 배아 주머니를 열고 배아를 제거합니다. 빨리 집게로 목에서 머리를 곤란에 의해 목을 베다. 지느러미 표면이 액세스 할 수 있도록 단단히 주둥이에 배치 된 집게로 머리를 안정.
    5. 다른 헥타르에서 개최 된 집게를 사용하여차 바로 중뇌의 능선 전에 피부와 두개골의 층을 꼬집어. 피부와 중간 선을 따라 꼬리 쪽 두개골을 다시 껍질. 피질과 중뇌 및 소뇌를 통해 다른 사이에 하나의 팁 능선 주위에 집게를 놓습니다.
    6. 핀치와 꼬리 쪽의 주동이의 측면과 소뇌의 전뇌 뒤에 남겨두고, 전체 중뇌를 제거합니다. 해부 현미경 차가운 HBSS와 페트리 접시에 놓습니다.
    7. 잔여 배아에 대해이 절차를 반복합니다.
    8. 복부 측이 지금 이용할 수 있도록 해부 현미경 뇌 세그먼트 뒤집어. 지금 4 사분면 볼 수 있습니다. 부드럽게 수막을 잡고 위로 떨어져 뇌에서 당겨 수막과 혈관을 모두 제거합니다.
    9. 중뇌을 분리하는 동안 뇌 세그먼트를 안정시키기 위해 집게를 사용합니다. 약 세그먼트의 중심에 뇌실에 포셉 한 통을 놓습니다. 내가 포인팅, 첫 번째 핀치 등쪽 확인다음 내측 양쪽의 접시, NTO. 양쪽 측면 절개함으로써 낮은 두 사분면을 가져 가라.
      참고 : 관심의 조직이 조밀 나타나는 복부 하부 섹션에 있습니다. 이 지역은 VTA와 SNC 모두 포함되어 있습니다.
    10. 트림 덜 조밀 조직 삭제 :이이 우수하고 열등한 colliculi를 포함합니다. 페트리 접시의 별도의 영역에 신선한 HBSS의 VTA와 SNC 모두를 포함하는 해부 조직을 놓습니다.
      참고 : 마우스 두뇌 발달이 단계 (E14)에서, 복부 중뇌에 대한 관심의 영역이 조나의 incerta 및 기타 시상 하부 셀 그룹에서 심실로 구분됩니다. 개발 배아 마우스 뇌의 더 긴 구조는 성인 마우스 뇌에 가깝게 위치한이 지역들 사이의 구별을 할 수 있습니다.
    11. 나머지 모든 뇌 세그먼트에 대해 반복합니다.
    12. 모든 뇌 세그먼트를 해부 한 후, 분기 개에 집게와 11 호 메스를 사용거의 동일한 크기의 조각으로 채널 중뇌 부분.
  4. 세포 해리
    1. 세포의 효소 처리
      1. HBSS에있는 모든 등분 중뇌 부분을 차지하고 15 ML 원뿔 튜브로를 배치하는 넓은 구멍 P1000 피펫 팁을 사용합니다. 세그먼트는 튜브의 바닥에 정착하고 등분 조각으로 채택 된 HBSS를 제거 할 수 있습니다.
      2. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브에 파파인 용액 500 μL를 추가하고 배치합니다. 7.5 분 후 튜브를 쓸어 넘겨 손가락으로 재현 탁 세포.
      3. 넓은 구멍 P1000 팁을 사용하여, 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase의) 용액 1 mL를 분취에 피펫 만 중뇌 부분. 세그먼트는 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
      4. 넓은 구멍 P1000 팁을 사용하여, 린스 냉간 정류장 용액 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 만 중뇌 세그먼트를 전송. 세그먼트는 튜브의 바닥에 정착하자에 린스를 반복더 많은 가전.
    2. 세포 현탁액의 기계적 분쇄
      1. 신선한 스톱 솔루션과 피펫 최대 1 mL로 마지막 헹굼을 교체하고 아래로 7 배 세포를 씹다하는 P1000 피펫 팁. 세포 용해를 최소화하기 위해 과도한 분쇄하지 마십시오.
      2. 천천히 튜브 바닥으로 4 % BSA 용액 200 μL 피펫 팅하여 세포 현탁액을 언더. 조심스럽게 세포 현탁액 층을 방해하지 않도록하기 위해 피펫 팁을 철회. 6 분 280 XG에 원심 분리 후, P1000과 뜨는을 대기음 매체 도금의 1 mL에 세포를 재현 탁.
  5. 세포를 계산하고 도금
    1. 혈구를 사용하여 세포 수를 수행합니다. 평판 배지에, 1000 세포 / μL로 세포 현탁액을 희석.
    2. 진공 흡입기를 사용하여, 많아야 세 요리 일괄 적으로, 코팅 된 접시에서 라미닌 대기음. 플레이트 120 μL (1.2 × 10 5 세포 / 접시 (78.5 mm (2) )) 요리의 코팅 된 표면에 세포 현탁액의 즉시 각 배치를 흡입 한 후. 이것은 건조 및 요철 표면을 형성에서 요리를 방지 할 수 있습니다.
    3. 1 시간 후, 세포를 조심스럽게 중단을 최소화하기 위해 배양 접시의 시드 화 영역 배양액 3 ㎖를 추가한다.
    4. 3 주 동안 3 일 간격으로 세포 배양 접시에 전체 매체 변화에 반을 수행합니다.

RNA 시퀀싱 2. 수확 교양 - 도파민 뉴런

참고 : 세포 수확 및 단일 세포 RNA-시퀀싱 프로토콜의 개요는 그림 1에 제시되어있다.

  1. 단계 실험의 날 전에 수행하는
    1. 15 분 동안 2 O 증류 H에서 다시 15 분 동안 100 % 에탄올로 초음파 처리에 의해 면도 붕규산 유리 모세관 튜브. 튜브 드레인의 RNase 불 활성화하기 위해 200 ℃의 오븐에서 하룻밤 동안 굽는다.
    2. 갓 열 사용의 RNase가없는 피펫 팁 미세 원심 분리 튜브에의 RNase 억제제 용액을 1 μL (20 μL 총 부피)로 시퀀싱 키트에서 배 용해 완충액 19 μL를 혼합하여 10 배 반응 완충액의 스톡 용액을 제조 하였다. 간단히 마이크로 원심 분리기를 이용하여 혼합물을 스핀과 얼음에 보관하십시오.
    3. (수확 뉴런을 수집하는 데 사용되는) 각 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브의 각각에 10 배 반응 완충액 2 μL를 추가한다. 신경 세포를 식별하는 적절한 태그가 수확 및 저장은 4 ℃에서 동결하기로 튜브 라벨.
  2. 단계 실험의 날에 수행하는
    1. 수확 피펫의 제작.
      1. 미세 전극 풀러와 microforge의 유리 코팅 가열 필라멘트를 사용하여 구운 모세관 튜브에서 - (8 μm의 2) 큰 팁 직경 가능한 Micropipette를 당깁니다. 긴 테이퍼 가능한 Micropipette를 형성하기 위해 풀러를 설정합니다. 보정 계수와 접안 고전력 OB 구비 한 microforge를 사용(- 20 μm의 10) 원하는 팁 크기로 마이크로 피펫의 팁을 깰 주관적인.
      2. microforge의 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 고정하고 microforge에 홀더를 탑재합니다. 이를 가열 필라멘트 전류에 microforge 및 스위치의 기계적 조작기를 이용하여 유리 피복 가열 필라멘트 상기 초점 마이크로 피펫의 선단을 가지고. 가열 된 필라멘트에 피펫 팁을 터치합니다. 피펫 팁은 적절한 직경에 녹아 때 전류를 끕니다.
        노트. 전류를 차단하면 필라멘트가 아래로 갑자기 이동하고 원하는 직경이 큰 오픈 팁 피펫을 생산, 피펫 팁에서 분리하게됩니다.
      3. 필요할 때까지 밀폐 된 상자에 완료 가능한 Micropipette를 저장합니다.
    2. 뉴런을 수확.
      노트. 배양 된 신경 세포는 이전에 게시 된 프로토콜 (6)의 수정 된 버전 다음 수확했다.
      1. 철저하게 카스티물 린스 액체 살균제와 물을 사용하여 배양 접시 및 수집 튜브와 접촉 세포 수확 방 모든 표면 EAN. 80 % 에탄올로 소독 표면을 닦은 다음의 RNase-억제제 주입이 닦습니다.
      2. 얼음이 절연 컨테이너, 일반 (물) 얼음 하나는 드라이 아이스와 다른를 입력합니다. 일반 얼음에 10 배 반응 완충액 2 μL와 이전에 채워진 0.2 ㎖의 PCR 수집 튜브를 놓습니다.
      3. 의 RNase없는 둘 베코의 PBS (DPBS)의 2 mL로 씻어 수확 DPBS의 1 mL로 교체 접시에서 배양 배지 드레인, 인큐베이터에서 신경 세포를 포함하는 배양 접시를 제거합니다.
      4. 40 배 상 목적하는 수은 램프 및 GFP 필터 세트를 갖추고 반전, 표면 형광 현미경을 사용하여 기본 중뇌 문화 형광, TH 양성 신경 세포를 식별합니다.
      5. 전동 또는 수동 마일을 사용하여 셀 소마를 통해 피펫의 위치를cromanipulator. 마이크로 피펫 홀더 측 포트에 부착 된 플라스틱 배관을 통해 입으로인가 부드러운 흡입을 이용하여 유리 마이크로 피펫에 신경을 대기음. 즉시 목욕 솔루션에서 셀을 포함하는 마이크로 피펫을 제거합니다.
      6. 0.2 mL의 PCR 튜브 컬렉션을 포함하는 반응 버퍼 내부의 피펫 팁을 배치하고 하단에 튜브의 측면에 대한 팁을 휴식. 마이크로 피펫의 뒤쪽에 멸균 21 G 주사기 바늘을두고 바깥쪽으로 압력을가함으로써, 마이크로 피펫의 선단에서 깨진 - (1.5 μL, 0.5), 나머지 액체를 배출.
      7. 데스크탑 마이크로 원심 분리기를 사용하여 5 초 동안 포집 관을 원심 분리하여 드라이 아이스에서 동결. -80 ℃에서 하나의 세포를 포함하는 수집 튜브를 저장한다. 전형적으로, 105 세포는 실온에서 1 시간 동안 접시 당 수확.

3. 단일 셀 RNA-SEQ 라이브러리 제작

    <첫 번째 가닥의 cDNA 리> 세대
    주 : 다음 단계는 상업 시퀀싱 키트에서 시약을 사용하십시오.
    1. PCR을 캐비닛에 얼음 아래 시약을 가져와. (2 μL 배 첫번째 가닥 완충액, 0.25 μL DTT (100 mM)을 1 μL의의 dNTP 믹스 (10 mM)을 1 μL의 올리고 뉴클레오티드 PCR의 캐비닛에 상온에서 다음의 시약을 조합하여 첫번째 가닥 마스터 믹스를 더한 10 %를 준비 12 μM), 0.25 μL의 RNase 억제제, 1 μL는 효소 (100 단위) 역. 이는 역전사 마스터 믹스 (반응 당 5.5 μL 총 부피)이다.
    2. 드라이 아이스에 -80 C에서 샘플을 채취하여 PCR 캐비닛에 가져다. 상기 하나의 세포 샘플에 다음을 추가 : 1 μL 1, 1 μL가 RNA 스파이크를 정량화 3 '프라이머. 72 ° C에서 핫 뚜껑 열 순환기 사전에 냉각 블록에 샘플을 가져와.
    3. 72 ° C에서 3 분 동안 열 순환기의 튜브를 품어 한 후 PCR 쿨러 선반에 샘플을 넣어.각 반응 관 (단계 3.1.1에서) 마스터 믹스의 5.5 μL를 추가하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다. 5 초 동안 0.2 μL 튜브 스핀 다음과 같이 열 순환기에서 배양한다 : 42 ° C를 90 분, 10 분, 70 ° C에 대한. 4 ° C에서 잡으십시오.
  1. 증폭 된 제 1 가닥의 cDNA의 정제.
    주 : PCR 증폭 cDNA를 자성 비드에 고정화하여 정제한다. 0.2 ㎖의 튜브에 대한 자기 분리 장치를 사용합니다.
    1. 1.5 ㎖의 튜브에 자석 구슬을 나누어지는. 각 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 실온 비드 분취를 가져오고 분산 잘 섞는다. 소용돌이 자석 구슬이 균일하게 혼합 될 때까지.
    2. 각 샘플에 자석 구슬 25 μL를 추가합니다. 철저하게 혼합 아래로 적어도 10 배 전체 볼륨 업을 피펫 팅에 의해 섞는다. 8 분은 구슬로 cDNA를 바인드를 수 있도록 RT에서 품어.
  2. PCR 마스터 믹스의 제조
    1. 되어온 모든 반응에 대한 DS-cDNA를 증폭 PCR 마스터 믹스를 준비합니다하는 ional 10 % 5 μL 10 배 PCR 버퍼, 2 μL의의 dNTP 믹스 (10 mM)을 2 μL PCR 프라이머 2 (12 μM), 2 μL 50 배 (2) 중합 효소 믹스, 39 μL 클레아 무료 물을 혼합하여 (50 μL 총 볼륨 / 반응).
  3. 첫 번째 가닥의 증폭
    1. 액체가 완전히 분명 나타날 때까지 자기 분리 장치 ≥5 분에 샘플 및 자기 구슬을 배치하고 상층 액에 남아있는 구슬이 없습니다.
    2. 분리 장치의 샘플을 유지, 상층 액을 피펫 버린다. 튜브 측으로부터 액체를 수집하기 위해 5 초 동안 샘플을 스핀. 다음, 30 초 동안 자기 분리 장치의 샘플을 놓습니다 P10의 피펫에 남아있는 모든 상층 액을 제거합니다.
    3. 이전 단계의 구슬에 바인딩 각 튜브 포함하는 DNA로 PCR 마스터 믹스 50 μL를 추가합니다. 온수 뚜껑 예열 된 열 자전거 타는 사람 (95 ° C)에서 튜브를 놓습니다. 다음 프로그래밍을 사용하여 열 순환을 시작할m : 1 분 95 ° C, 15 초 동안 95 ° C의 26주기, 30 초 동안 65 ° C, 6 분 동안 68 ° C. 그런 다음 72 ° C 10 분. 4 ° C에서 잡으십시오.
      참고 : 자세한 내용은 순서는 사용자 설명서를 참조하고 샘플 설정을 최적화 할 수 있습니다.
  4. 증폭 된 이중 가닥의 cDNA의 정제
    1. 각 샘플에 구슬 90 μL를 추가합니다. 철저하게 혼합 아래로 적어도 10 배 전체 볼륨 업을 피펫 팅에 의해 섞는다. 8 분은 구슬로 cDNA를 바인드를 수 있도록 RT에서 품어. 액체를 완전히 맑은 나타날 때까지 ≥5 분 동안 자기 분리 장치의 샘플 플러스 비즈를 배치하고, 상청액에 남아있는 비드는 없다.
    2. 시료는 자기 분리 장치이지만, 상층 액을 제거하고 폐기. 자기 분리 장치의 샘플들을 유지. 구슬을 방해하지 않고 각각의 샘플에 갓 85 % 에탄올 140 μL를 추가합니다. 30 초 동안 기다립니다. 상층 액을 피펫. 의 cDNA는 BEA에 결합 유지됩니다세척 공정 동안에 DS.
    3. 한 번 더 에탄올 세척을 반복합니다.
    4. 간단히 튜브 측으로부터 액체를 수집하기 위해 샘플을 스핀. 다음, 30 초 동안 자기 분리 장치의 샘플을 놓고 피펫에 남아있는 모든 에탄올을 제거합니다. 펠릿은 건조하고 더 이상 반짝 때까지 (균열이 나타납니다 즉 전) 2.5 분 - 2 상온에서 샘플을 놓습니다.
      참고 : 그냥 건조까지만 펠렛을 건조. 펠렛이없는 광택과 매트를 볼 것이다. 펠렛이 건조되지 않으면, 에탄올 증폭 된 cDNA의 회수 속도 및 수율을 줄일 수있는 샘플 웰에 남아있을 것이다. 펠렛 위에 건조 경우, 펠렛에 균열이있을 것이다. 그것은 재수하는 이상 2 분 소요되며 증폭 된 cDNA를 복구 및 수율을 감소시킬 수있다.
    5. 구슬이 건조되면, 비드 펠렛을 다루 용출 버퍼의 22.5 μL를 추가합니다. 자기 분리 장치로부터 시료를 제거하고, 비드를 재현 탁 철저히 혼합한다. 에서10 분 동안 실온에서 cubate는 재수합니다.
    6. 튜브 측으로부터 액체를 수집하기 위해 5 초 동안 샘플을 스핀. 이 솔루션은 완전히 깨끗해질 때까지, ≥1 분 동안 다시 자기 분리 장치의 샘플을 놓습니다.
      참고 : 구슬의 작은 인구는 배양 중에 자석에 펠렛하지 않을 수 있습니다. 뜨는 그들을 재현 탁하고 (기존의 펠렛을 방해하지 않고) 구슬의 나머지 부분은 이미 펠렛 화 한 자석으로 그들을 피펫 위아래 이러한 unpelleted 구슬을 피펫.
    7. 더 비즈가 뜨는에 남아 있지 않을 때까지 배양을 계속합니다. 클레아없는, 저 밀착성 튜브에 각 튜브의 정제 된 cDNA를 포함하는 명확한 뜨는을 전송합니다. -20 ° C에서 샘플 정보 저장과 각 튜브 라벨. 시료는 -20 ° C 무기한으로 저장 될 수있다.
  5. DNA 농도 및 단편 크기 측정
    1. 1 μL 등을 정량화하여 품질 관리 검사를 실시형광 분석기의 cDNA를 iquot. AS (1에서 설명 된) 전기 영동 시스템을 사용하여 DS-cDNA를 1 μL (3 NG)를 평가한다.
  6. DNA의 단편화
    주 : DNA 샘플 준비 키트를 사용합니다.
    1. 튜브로 cDNA를 20 μL (35 NG 합계)를 추가합니다. Tagment DNA 25 μL (TD)는 cDNA를 함유 튜브에 버퍼에 추가.
    2. 튜브에 TDE1 (Tagment DNA 효소)의 5 μL를 추가합니다. 최대 피펫과 10 배 아래로 혼합. 각 샘플에 대한 새로운 팁을 사용합니다. 1 분 동안 20 ° C에서 280 XG에 원심 분리기.
    3. 온수 뚜껑 열 순환기에 샘플을 놓고 그것을 실행 : 55 ° C, 5.5 분. 빨리 50 μL QG 용액 (겔 추출 키트)를 추가합니다. 최대 피펫과 10 배 아래로 혼합. 다음 단계로 직접 진행합니다.
  7. 조각난 DNA의 정제
    1. 구슬, 피펫 최대의 170 μL를 추가하고 아래로 10 배는 혼합 할 수 있습니다. 이 10 분 동안 앉아 할 수 있습니다. 자석에 튜브를 넣어. 튜브는 10 분 동안 자석에 앉아 보자.샘플이 자기 분리 장치에있는 동안, 상층 액을 피펫 버린다.
    2. 자석에 튜브를두고 85 % 에탄올 200 μL를 추가합니다. 에탄올을 제거, 30 초 동안 앉아 보자. 에탄올 세척을 반복합니다. 실온에서 튜브 1,000 XG에 스핀.
    3. 다시 자석에 튜브를 넣어. 잔류 에탄올을 피펫. 샘플은 15 분 동안 실온에서 건조하자.
    4. 겔 추출 키트에서 용출 버퍼의 21 μL를 추가합니다. 튜브 자석, 피펫을 위로 떨어져 앉아 보자 10 배 아래로 혼합. 튜브를 실온에서 15 분 동안 앉아 보자.
    5. 5 분 동안 자석에 튜브를 돌려줍니다. 새로운 튜브에 용액 (정제 DNA)의 피펫 20 μL.
  8. 조각난 DNA의 태그 및 PCR 증폭
    참고 :이 단계에서 정제 된 DNA가 제한된주기 PCR 프로그램을 통해 증폭된다. PCR 반응 단계는 인덱스 1 (I7) 및 인덱스 2 (I5)뿐만 아니라 공통 어댑터 (클러스터 생성 및 시퀀싱 필요) (P5 및 P7)를 추가한다. DNA의의를 참조하십시오자세한 내용은 충분한 준비 가이드.
    1. 새로운 튜브에서 인덱스 2 프라이머의 5 μL (흰색 모자)를 추가합니다. 새로운 피펫 팁을 사용하면 인덱스 1 프라이머 (오렌지 캡)의 5 μL를 추가합니다. 각 튜브에 PCR 마스터 믹스 15 μL를 추가합니다.
    2. 각 튜브에 PCR 프라이머 칵테일의 5 μl를 추가합니다. 튜브에 정제 된 DNA의 20 μL를 추가합니다. 5 회 - 부드럽게 아래로 삼을 피펫합니다.
    3. 열 순환기에 다음과 같은 프로그램을 사용하여 PCR을 수행 : 72 ° C를 3 분 동안, 98 ° C를 30 초, 10 초, 30 초 동안 63 ° C, 3 분 72 ° C 98 ° C의 5 사이클. 10 ° C에서 잡으십시오. PCR을 청소 즉시 진행 또는 최대 2 일 동안 4 ° C에서 샘플을 저장합니다.
  9. 증폭 된 DNA 조각의 정화
    1. RT에 구슬을 가져옵니다. 신선한 85 % 에탄올을 준비합니다. PCR 기계에서 샘플을 가지고 잠시 스핀 다운.
    2. 튜브에 구슬 30 μL를 추가합니다. 조심스럽게 피펫은 위아래로 10 배 혼합한다. 튜브를 5 분 동안 실온에서 앉아 보자. 장소 혈중 알코올 농도5 분 동안 상기 자석의 케이. 자석에 튜브로 뜨는을 폐기 피펫을 사용합니다.
    3. 각 튜브에 85 % 에탄올 200 μL를 추가합니다. 피펫은 30 초 후에 꺼 에탄올. 85 % 에탄올 세척을 반복합니다. 피펫은 30 초 후에 꺼 에탄올.
    4. 자석에 여전히 튜브와 뚜껑을 열어 둔 상태에서 15 분 동안 공기 건조에 구슬을 할 수 있습니다. 자석에서 튜브를 제거합니다.
    5. 용출 버퍼의 32.5 μL를 추가합니다. 부드럽게 피펫과 10 배 아래로. 15 분 - 10 자석을 품어.
    6. 2 분 동안 자석 튜브를 돌아가거나 상등액 클리어 할 때까지. 조심스럽게 새로운 튜브에 뜨는의 30 μL를 전송합니다.
  10. DNA 농도 및 조각 크기의 측정
    1. 형광 분석기의 cDNA를 1 μL의 DNA 농도를 정량화하여 품질 관리 검사를 실시한다. 전기 영동에 의해 DNA의 단편의 크기를 결정합니다. DS-의 cDNA 1 μL (3 NG)를 평가합니다.
  11. 시퀀싱
    1. 시퀀싱 시설에 단일 세포 RNA-서열 라이브러리를 가져옵니다. 100 bp의 염기 서열은 이전에 게시 된 프로토콜 4 다음 시퀀서에 읽 생성합니다.
      참고 : 각 시퀀싱 라이브러리는 매핑 읽기 고유> 20000000를 생성한다.

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결과

여기에서 우리는, 티로신 수산화 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-SEQ (그림 1)를 사용하여 자신의 RNA 전 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다. 데이터 수확 서열화 된 TH-eGFP는 양성 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체의 존재 TH, DOPA 데카 복실 라제 (DDC) 및 도파민 전달체 DAT에 기초하여, 도파민 뉴런 것으로 나타났다 (slc6a3). RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 각각의 단일 셀 RNA-서열 라이브러리에서 6,000 - 8,000 단백질 코딩 유전자 (그림 2) 검출되었다. 도파민 신경 세포는 견고 여러 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChR을) 서브 유닛 (표 1)에

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토론

여기에서 우리는 단일 셀 RNA-서열과 각 셀을 연구, 형광 태그를 사용하여 이기종 인구에서 단일 세포를 분리. 우리는 수확 서열 라이브 TH-eGFP는 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체, TH, DDC 및 slc6a3의 존재에 기초하여, 실제로 도파민 뉴런 있다고보고한다. RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 이는 각각의 TH-eGFP는 세포는 도파민 뉴런 (8, 9)와 연관된 이온 채널의 레퍼토리를 표시되었습니다 전기 생리학 연구와 일치율이었다. 이 프로토콜에서 우리는 라이브 도파민 신경 세포에 대한 신뢰할 수있는 표식으로 GENSAT 티로신 수산화-eGFP는 마우스 스트레인 (10)를 이용했다. WT 문화에서 현재 자신의 형태를 기반으로 라이브 도파민 신경 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법이 없습니다....

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(DA017279, AG033954, DA037743), 마이클 J. 폭스 재단, 캘리포니아 공과대학의 밀라드 앤 뮤리엘 제이콥스 유전학 및 유전체학 연구소에 자금을 지원하는 칼텍 혁신 이니셔티브의 보조금으로 지원되었습니다. RNA-Seq 라이브러리 프로토콜을 최적화하고 도움을 주신 Brian Williams에게 감사드립니다. 컴퓨터 교육에 대해 Henry Amrhein에게 감사드립니다. Barbara J. Wold가 자신의 장비와 실험실 공간을 사용해 준 것에 대해 감사드립니다. 도서관 염기서열 분석과 시설 관리에 대해 Igor Antoshechkin에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파파인워딩턴 생화학 공사 
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1xGibco 14175-095
기증자 말 혈청Thermo Scientific SH30074.03
소 혈청 알부민 (BSA)시그마 A7030-50G
매체: Neurobasal 매체Gibco 21103-049
L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민의 안정화된 형태를 포함하는 배양 배지: GlutaMAXGibco 35050-0610.5mM 최종 농도.
L-아스코르브산시그마 A7506
B27기코 17504-04450x 스톡 용액, 1x 최종 농도.
35mm 유리 바닥 접시MatTek   P35GC-1.5-10-C
폴리-L-오르니틴시그마 P4957
라미닌시그마 L2020-20 °에 저장되었습니다. C 20 & 마이크로; L 분취량
데옥시리보뉴클레아제 I (DNase)시그마 DN25
블루 피펫 팁 P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
10 mm 얕은 페트리 접시VWR 25384-324
37 ° C 수조
37 ° C, 5% 습도 인큐베이터
16% 파라포름알데히드(PFA)전자 현미경 과학 15710
트리톤 X-100시그마  X100-500ML
당나귀 세럼에퀴테크 SD-0100HI100% 원액, 1% 최종 농도.
표준 패턴 수술용 가위Fine Science Tools14000-14
Forceps - 2x3 teethFine Science Tools11022-14
Forceps - Dumont #55Fine Science Tools11295-51
Forceps - Dumont #5Fine Science Tools11252-23
10x PBS, pH 7.4Gibco 70011-044
Dulbecco의 인산염 완충 용액 (DPBS) 1xGibco14190-144500 mL
21 G 바늘BD PrecisionGlide 바늘305167 100 바늘
마이크로피펫 풀러서터 기기모델 P-87
마이크로매니퓰레이터 셔터 기기  MP-285
염기서열분석 키트: Illumina 염기서열분석을 위한 SMARTer 초저 RNA 키트Clontech634936 100 rnxs, incl Advantage2PCR Kit
올리고뉴클레오티드 (12 µ M): SMARTer IIA 올리고뉴클레오티드(12 µ M)SMARTer 키트에서 
역전사효소 (100 units)SMARTcribe 역전사효소SMARTer Kit에서 
프라이머 13' CDSIIa 프라이머 SMARTer Kit
Primer 2IS PCR 프라이머에서 SMARTer Kit
50x 2 중합효소 혼합물50x Advantage 2 중합효소 혼합물SMARTer Kit에서
10x PCR buffer10x Advantage 2 PCR buffer
RNA 스파이크ThermoFisher 4456740
PCR 쿨러 랙IsoFreeze PCR 쿨러 랙
DNA 샘플 준비 키트 (Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 샘플
PCR 마스터 믹스Nextera PCR 마스터 믹스 (NPM)Nextera 키트에서 
PCR 프라이머 칵테일 (PPC) 넥스테라 PCR 프라이머 칵테일 (PPC) Nextera 키트에서
FluorometerThe Qubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzer kitAgilent5067-4626110 rxns
전기영동 시스템 Agilent 2100 바이오분석기.G2938C
자석 비즈: Agencourt AMPure Beckman CoulterA638805 mL
RNAse wipe: RNAse Zap wipesAmbionAM9786크기 100 장
Qubit ds HS Assay Kit분자 프로브 Q32854500 분석
젤 추출 키트: Qiaquick 젤 추출 키트Qiagen 28704
유리 모세관(Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm 외경)
MicroforgeNarishige (또는 동급) 
시퀀서Illumina HiSeq 기기
GENSAT 티로신 하이드록실라제-eGFP 마우스 스트레인 MMRRC 재고 번호: 000292-UNC재고 Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/돌연변이 마우스 지역 연구 센터
LS003126은 , , 에서

참고문헌

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  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
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