Method Article

검출 실험 프로토콜 시아 노 박테리아 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

DOI:

10.3791/54994

⸱

February 7th, 2017

 ,  , 
1Department of Molecular Evolution, Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC)

In This Article

Summary

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사람이 소비하는 담수 저장고에 시아노박테리아 독소가 존재하는 것은 물 관리 당국의 주요 관심사입니다. 수질 오염의 위험을 평가하기 위해 이 문서에서는 항체 마이크로어레이 칩을 사용하여 액체 및 고체 샘플에서 시아노박테리아 균주를 현장에서 검출하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

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지구 온난화와 부영양화는 일부 수생 생태계가 신속하고 대규모 시아 노 박테리아의 성장을 유발 true로 생물 반응기를 작동 할; 이 관련 건강과 경제적 결과가 있습니다. 대부분의 시아 노 박테리아 균주는 독소를 생산하며, 단지 몇 세포는 환경에 치명적인 손상을 유도 할 필요가있다. 따라서, 물 바디 당국과 정부는 예방 또는 치료 의사 결정을 지원하기 위해 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 신속하고 효율적인 조기 경보 시스템이 필요합니다. 이 원고는 분류 학적 해상도 (CYANOCHIP) 17 항체 (ABS)와 항체 마이크로 어레이 칩을 사용하여 독소를 생산하는 시아 노 박테리아 균주의에서 필드 검출을위한 실험 프로토콜을보고합니다. 여기에, 17 시아 노 박테리아 균주의 동시 모니터링을위한 멀티 플렉스 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI)이 자주 담수 생태계에 피는 발견, 그들 중 일부는 독소 생산자는 설명한다. 멀티있는 마이크로 어레이PLE CYANOCHIP의 (24까지) 동일한 복제 동시에 샘플의 비슷한 번호를 테스트하기 위해 하나의 현미경 슬라이드에 인쇄되었다. 액체 샘플은 항체 (ABS)과 직접 배양에 의해 또는 1 내지 3 μm의 필터를 통해 여과하여 세포 농도 이후에 테스트 할 수있다. 이러한 퇴적물 접지 바위 고체 시료는, 제 균질화 인큐베이션 완충액 휴대용 초음파에 의해 분산된다. 거친 물질을 제거하기 위해 - (20 μm의 5), 여과와 ABS 배양 그런 다음 여과된다. 면역 반응은 17 형광 표지 복근의 혼합물 최종 인큐베이션 드러난다 휴대용 형광 검출기에 의해 판독된다. 전체 과정은 대부분의 배양이 1 시간주기에 대응하는 약 3 시간 걸린다. 출력은 밝은 반점이 시아 노 박테리아 마커의 양의 검출에 대응하는 이미지입니다.

Introduction

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검출하고 복잡한 자연 미생물 지역 사회의 미생물 모니터링 생물 의약, 환경 생태, 그리고 우주 생물학 등 많은 분야에서 중요하다. 조수의 셀 꽃 (과도 증식)을 형성하는 능력에 대해 공지의 원핵 미생물은 박테리아이다. 그들은 어디에나있다, 많은 종은 인간의 건강에 대한 잠재적 인 위험뿐만 아니라, 생태에 미치는 영향에뿐만 아니라 선도, 독소를 생성 할 수 있습니다. 이 점에서, 박테리아 및 / 또는 토양, 물에서의 독소의 조기 발견을위한 빠르고 민감한 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 물 관리자가 적절한 물 관리 프로그램을 구현하는, 그 결과, 의사 결정을 도울 수 있도록이를 위해, 멀티 플렉스 형광 마이크로 어레이 샌드위치 면역 측정법 (FSMI)의 도구로 개발되고있다.

방법의 다양한 범위는 감지 시안 식별하기 위해 개발되었다광학 현미경, 분자 생물학 및 면역 학적 기술을 포함한 토양과 물에 obacterial 세포와 cyanotoxins. 이러한 방법은 그들이 제공하는 정보에 크게 다를 수 있습니다. 현미경 기술은 세포 형태 및 피코시 아닌 색소 등의 시아 노 박테리아로부터 생체 내 형광 감지 또는 1 클로로필에 기초한다. 그들은 유형과 샘플에 ....

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Protocol

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면역원 1. 준비

  1. 표 1에 기재된 조건 하에서 해당 배지에서 각각 시아 노 박테리아 균주를 성장한다.
    참고 : 각 시아 노 박테리아 균주에 대한 성장 매체와 문화 조건은 표 1에 나열되어 있습니다. 모든 시아 노 박테리아 균주, K17를 제외하고, 자치시 대학 (마드리드, 스페인)에서 안토니오 사다의 그룹에 속한다. Planktothrix의 rubescens에 대한 항체는 Vilasouto 저수지 (북부 스페인)에서이 cyanobacterium의 특이 꽃의 자연 시료에서 생성되었습니다.
  2. 늦은 지수 또는 고정 성장 단계의 배양으로 약 108 세포 / ㎖를 얻기 위해 광학 현미경으로 세포 계수 챔버를 이용하여 세포 수를 정량화.
  3. 5 분 2,000 XG에 원심 분리하여 문화의 5 ㎖에서 수확 세포.
  4. 뜨는을 취소하고 10 ML의 욕조에서 세포를 재현 탁1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (1X PBS)와 E는 / ㎖를 약 108 세포를 얻었다.
  5. 균질화 및 휴대용 핸드 헬드 초음파 처리기를 사용하여, 얼음에 30 내지 60-S, 일시 정지, 5 회, 30 초마다 초음....

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Results

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이 작품은 CYANOCHIP 항체 마이크로 어레이를 사용하여 가장 관련성이 담수 시아 노 박테리아 종의 동시 식별 (표 1)에 대한 다중 면역 테스트를 설명합니다. 마이크로 어레이는 현미경 슬라이드에 인쇄 된 3 × 8 마이크로 어레이 형식이 될 수 있습니다. 각각의 마이크로 어레이는 음성 대조군으로 A A 세중 자리 패턴 인쇄 (17) 항체의 설정, 해당 사전 면역 항체 및 BSA로 구성되어 있습니다. 마이크로 어레이는 마이크로 어레이 쉽게 패턴 (22) (도 1)를 현지화하는 형광 표지 미리 면역 항체를 이용하여 형광 프레임을 포함한다.

마이크로 어레이는 마드리드의 도시를 공급하는 담수 Lozoya 저수지의 해안에서 수집 물 샘플의 현장에서

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Discussion

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여기서, CYANOCHIP, 시아 노 박테리아 장군의 넓은 범위의 검출 및 식별을 위해 17 항체 마이크로 어레이를 이용하여 멀티 플렉스 형광 샌드위치 면역 검정은 22를 설명한다. 이 시아 노 박테리아는 담수 서식지에서 그들 중 일부있는 독소 생산을 가장 많이 저서 및 플랑크톤 장군을 나타냅니다. 최근, 형광 면역 샌드위치 형식 애플리케이션 환경 (26, 27, 28)를 미생물 및 / 또는 bioanalytes를 식별하는 데 사용되어왔다. 프로토콜은 주로 두 단계에 기초한다 : (I) 특히 시료로부터 분석 대상 물질에 결합하는 항체를 고정화하거나 캡처 (II)의 형광 표지 된 항체 (탐침 또는 검출 항체)를 사용하여 .......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 시아 노 박테리아 균주를 제공하기 위해 대학교 자치시 마드리드에서 박사 안토니오 Quesada에 감사합니다. 이 작품은 스페인 Ministerio 드 Economía y를 Competitividad의 Subdirección 일반 드 Proyectos 드 Investigación (MINECO)에 의해 투자되었다, 더를 부여하지 않습니다. AYA2011-24803 및 ESP2014-58494-R.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 mm 공극 직경 필터MilliporeGSWP04700면역원 준비용
Eppendorf  5424R 마이크로 원심분리기Fisher Scientific면역원
준비용 인산염 완충액 식염수(PBS) pH 7.4 (10x)Thermo Fisher Scientific7001103650mM 인산칼륨, 150mM NaCl, pH 7.4
초음파 프로세서 UP50HHielscher면역 물질 준비를 위해
Freund의 보조제를 완료하십시오 Sigma-AldrichF5881면역강화제
불완전 프로이트의 보조제Sigma-Aldrich F5506부스트 주사용
단백질 A 항체 정제 키트   시그마-알드리치PURE1A IgG 분리용
원심 필터 장치 MWCO< 100 kDaMilliporeUFC510096-96KIgG
투석 튜브의 분리용, 벤조일화Sigma-AldrichD7884-10FT
IgG Illustra Microspin G-50 컬럼 분리용 GE-HealthCareGE27-5330-02IgG
Bradford 시약Sigma-AldrichB6916-500 mL를 위해 항체 농도를 정량화하기 위해
MicroBCA 단백질 분석 키트 Thermo Scientific23235항체 농도 정량화
단백질 어레이 버퍼 2xWhatman (Sigma Aldrich) S00537인쇄 버퍼; 30 - 40% 글리세롤이 있는 1x PBS에 0.01% 트윈 20
트윈 20 시그마-알드리치 P9416비이온 세제
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-Aldrich A9418Control  인쇄용; 차단 시약
384-웰 마이크로플레이트GenetixX6004항체 인쇄
용 로봇 어레이어 Digilab의 MicroGrid II TAS 어레이어항체 인쇄용
에폭시 기판 유리 슬라이드Arrayit corporationVEPO25C항체 인쇄를 위한 견고한 지원
Alexa Fluor-647 숙시니미딜-에스테르 분자 프로브A20006플루오로크롬
DMSO 시그마-알드리치 D8418플루오로크롬 용해
Heidolph Titramax 진동 플랫폼 쉐이커Fisher Scientific항체 라벨링용 
Illustra Microspin G-50 컬럼 헬스케어27-5330-01라벨링된 항체의 정제를 위해
안전 밀봉 갈색 0.5 mL 튜브Sarstedt72,704,001라벨이 지정된 항체 보관을 위해 
Nanodrop 1000 분광 광도계Thermo Scientific항체 농도 및 라벨링 효율을 정량화하기 위해
3 µ m 기공 크기 폴리카보네이트 47 mm 직경 필터MilliporeTMTP04700집중 세포
1 M Trizma 염산염 용액 pH 8Sigma-Aldrich T3038TBSTRR 제제용; 슬라이드를 차단하기 위해
염화나트륨Sigma-Aldrich S7653TBSTRR 준비
20 &마이크로; M 나일론 필터 MilliporeNY2004700환경 추출물 준비용
10 - 12 mm 필터 홀더MilliporeSX0001300환경 추출물 준비용
프로테아제 억제제 칵테일Sigma-Aldrich P8340환경 추출물 저장용
1 M Trizma 염산염 용액 pH 9Sigma-Aldrich T2819슬라이드를 차단하려면
Heidolph Duomax 1030 흔들 플랫폼 쉐이커VWR슬라이드를 차단하려면; 인큐베이션 프로세스용 
VWR 갤럭시 미니어레이 마이크로원심분리기VWRC1403-VWR슬라이드를 건조하기 위해
멀티웰 마이크로어레이 하이브리드화 카세트Arrayit corporationAHC1X24슬라이드당 24개의 분석을 위한 카세트
GenePix 4100A 마이크로어레이 스캐너 분자 소자형광용 스캐너
GenePix Pro 소프트웨어분자 소자이미지 분석 및 정량화를 위한 소프트웨어
의 분리

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
  2. Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Env....

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