검출 실험 프로토콜 시아 노 박테리아 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

요약

사람이 소비하는 담수 저장고에 시아노박테리아 독소가 존재하는 것은 물 관리 당국의 주요 관심사입니다. 수질 오염의 위험을 평가하기 위해 이 문서에서는 항체 마이크로어레이 칩을 사용하여 액체 및 고체 샘플에서 시아노박테리아 균주를 현장에서 검출하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

지구 온난화와 부영양화는 일부 수생 생태계가 신속하고 대규모 시아 노 박테리아의 성장을 유발 true로 생물 반응기를 작동 할; 이 관련 건강과 경제적 결과가 있습니다. 대부분의 시아 노 박테리아 균주는 독소를 생산하며, 단지 몇 세포는 환경에 치명적인 손상을 유도 할 필요가있다. 따라서, 물 바디 당국과 정부는 예방 또는 치료 의사 결정을 지원하기 위해 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 신속하고 효율적인 조기 경보 시스템이 필요합니다. 이 원고는 분류 학적 해상도 (CYANOCHIP) 17 항체 (ABS)와 항체 마이크로 어레이 칩을 사용하여 독소를 생산하는 시아 노 박테리아 균주의에서 필드 검출을위한 실험 프로토콜을보고합니다. 여기에, 17 시아 노 박테리아 균주의 동시 모니터링을위한 멀티 플렉스 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI)이 자주 담수 생태계에 피는 발견, 그들 중 일부는 독소 생산자는 설명한다. 멀티있는 마이크로 어레이PLE CYANOCHIP의 (24까지) 동일한 복제 동시에 샘플의 비슷한 번호를 테스트하기 위해 하나의 현미경 슬라이드에 인쇄되었다. 액체 샘플은 항체 (ABS)과 직접 배양에 의해 또는 1 내지 3 μm의 필터를 통해 여과하여 세포 농도 이후에 테스트 할 수있다. 이러한 퇴적물 접지 바위 고체 시료는, 제 균질화 인큐베이션 완충액 휴대용 초음파에 의해 분산된다. 거친 물질을 제거하기 위해 - (20 μm의 5), 여과와 ABS 배양 그런 다음 여과된다. 면역 반응은 17 형광 표지 복근의 혼합물 최종 인큐베이션 드러난다 휴대용 형광 검출기에 의해 판독된다. 전체 과정은 대부분의 배양이 1 시간주기에 대응하는 약 3 시간 걸린다. 출력은 밝은 반점이 시아 노 박테리아 마커의 양의 검출에 대응하는 이미지입니다.

서론

검출하고 복잡한 자연 미생물 지역 사회의 미생물 모니터링 생물 의약, 환경 생태, 그리고 우주 생물학 등 많은 분야에서 중요하다. 조수의 셀 꽃 (과도 증식)을 형성하는 능력에 대해 공지의 원핵 미생물은 박테리아이다. 그들은 어디에나있다, 많은 종은 인간의 건강에 대한 잠재적 인 위험뿐만 아니라, 생태에 미치는 영향에뿐만 아니라 선도, 독소를 생성 할 수 있습니다. 이 점에서, 박테리아 및 / 또는 토양, 물에서의 독소의 조기 발견을위한 빠르고 민감한 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 물 관리자가 적절한 물 관리 프로그램을 구현하는, 그 결과, 의사 결정을 도울 수 있도록이를 위해, 멀티 플렉스 형광 마이크로 어레이 샌드위치 면역 측정법 (FSMI)의 도구로 개발되고있다.

방법의 다양한 범위는 감지 시안 식별하기 위해 개발되었다광학 현미경, 분자 생물학 및 면역 학적 기술을 포함한 토양과 물에 obacterial 세포와 cyanotoxins. 이러한 방법은 그들이 제공하는 정보에 크게 다를 수 있습니다. 현미경 기술은 세포 형태 및 피코시 아닌 색소 등의 시아 노 박테리아로부터 생체 내 형광 감지 또는 ¹ 클로로필에 기초한다. 그들은 유형과 샘플에 존재하는 시아 노 박테리아의 수에 대해 알려 실시간 자주 모니터링을위한 신속하고 저렴한 방법이 있지만, 그들은 잠재적 독성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 또한, 그들은 종종 밀접한 관련 ^종이 구별하기가 매우 곤란하다는 점을 감안하면, 전문의 특정 수준을 필요로한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 광학 현미경은 생물학 및 생화학 검사 분석 및 cyanotoxins의 식별 및 정량 물리 화학적 방법 모두 동반해야합니다.

효소 면역 분석법 (ELISA), 단백질 인산 억제 분석 (PPIA), 및 생쥐에서 신경 화학 시험 cyanotoxins의 검출을위한 생화학 적 스크리닝 분석법의 예이다. 처음 두 빠르고 민감한 방법이지만하여 ELISA 및 PPIA 시험 독소의 세 가지 유형으로 제한되는 경우, 위양성이 설명되었다. 마우스 생물 검정이 필요 낮은 감도와 정밀도, 특별 라이선스 및 교육을 질적 기술이다. 또한, 시료에 존재하는 독소의 종류에 대한 정보를 제공하지 않는다. Cyanotoxins 식별 및 고성능 액체 크로마토 그래피와 같은 다른 분석법 (HPLC), 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 정량 할 수있다 (LC-MS), 가스 크로마토 그래피 (GC), 가스 크로마토 그래피 질량 분석 (GC-MS), 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 비행 (MALDI-TOF). 표준품 필요하는 경우, 이것은 가능복잡한 시료의 개별 독소의 농도를 결정하는 편은, ^{3, 4} 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 시간이 많이 소요된다; 비용이 많이 드는 장비, 소모품 및 샘플 준비가 필요합니다; 경험이 풍부한 전문 직원에 의해 수행되어야합니다.

분자 기반 방법은 게놈 데이터베이스에 게시 된 순서 정보 덕분에, 탐지, 식별 및 시아 노 박테리아와 해당 cyanotoxins을 정량화하기 위해 수십 년 동안 적용되어왔다 (예를 들어, 생명 공학 정보, NCBI을위한 국립 센터). 이들 방법 중에서 DNA 증폭 용 프라이머 세트의 설계를 필요로하고 다른 시아 노 박테리아 종의 DNA 시퀀스의 사전 지식에 의존하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 기초한 것들이다. 유전자 검출은 피코시 아닌 오페론 같은 속 레벨에서의 정확한 식별을 초래하지만, 어떤 종 또는 균주와 들키지있다이 방법. 그러나, 예를 들면 마이크로 시스틴 오페론에 속하는 것과 같은 독소를 코딩하는 유전자, 생산자는 ⁵ 부족하다 시료에서 독성 물질의 식별을 용이하게한다. 그럼에도 불구하고, PCR에 의한 독소 마커의 검출은 반드시 환경에 독성을 의미하지는 않습니다. 또한, 시료에 존재하는 박테리아 독소 생산 종의 전체 범위를 분석하기 위해 개발 된 프라이머 세트는 아직 완전하지 않으며, 추가적인 연구가 알려지지 종을 식별하기 위해 수행되어야한다. 다른 분자 기술 등 현장 하이브리드 (FISH) 및 DNA 마이크로 어레이에 형광 같이-PCR 비를 기준으로합니다.

지난 20 년 동안, 마이크로 어레이 기술은 특히 환경 모니터링, 응용 프로그램의 많은 분야에서 중요성을 얻고있다. DNA 마이크로 어레이는 종과 분석 ^{(4) 사이의 차별, 6, 7} 허용 SUP>, ^{8, 9, 10,} 그들은 거의 힘들고 시간 소모적 인 다단계 (예를 들어, 마이크로 어레이 성능 DNA 추출, PCR 증폭 및 혼성화) 관련 태스크를 고려한다. 그 때문에, 예컨대 샌드위치 경쟁 면역 마이크로 어레이와 같은 항체를 기반으로 적은 시간을 소모 분석은 여러 환경 분석 ^{11 (12, 13)의} 검출을위한 필수적인 안정적인 높은 처리량 방법이되었다. 항체의 기능을 구체적으로 타겟 화합물을 인식하고 거의 모든 물질에 대한 항체를 생산할 수있는 가능성과 함께, 분석 및 단백질의 적은 양을 검출, 항체 마이크로 어레이를 환경 적 용도를위한 강력한 방법을 만든다. 또한, 배수를 달성하는 능력은로 분석화롯불의 분석은, PPM로 PPB에 이르기까지 검출 한계,이 방법 ^(14)의 주요 장점 중 하나입니다.

항체 기반의 바이오 센서는 환경 모니터링 ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21} 병원균 독소의 넓은 범위의 검출에 민감하고 신속한 도구로 입증되었다. DNA 방법은 여러 단계를 포함하는 반면, 항체 기반의 마이크로 어레이는 주로 적절한 용액 버퍼 짧은 용해 공정을 기반으로 작은 시료 전처리를 필요로한다. Delehanty 및 Ligler ¹⁵ 4 PPB의의 단백질 농도를 검출 할 수있는 항체 샌드위치 면역 분석에 기초하여 단백질과 복합 혼합물 세균 분석 물의 동시 검출을보고D 10 ⁴ CFU / 세포의 용액. Szkola 등. ^(21)는 생물학적 전쟁에 사용될 수 proteotoxins 작은 독소, 화합물의 동시 검출을위한 저렴하고 신뢰할 수있는 다중 마이크로 어레이를 개발했다. 그들은보다 20 분에서 3 PPB의 검출 한계로, 리신 독소의 농도를 감지했습니다. 최근 CYANOCHIP 독성 및 독성 박테리아의 시츄 검출, 항체 마이크로 어레이 기반 바이오 센서 ^(22)를 설명 하였다. 이 마이크로 어레이는 주로 현미경으로 식별하기 어려운 수생 환경에서 잠재적 인 시아 노 박테리아 꽃의 식별이 가능합니다. 심지어 종 레벨에서 다중 검출 및 박테리아의 식별을위한 비용 - 효과적인 수단이 바이오 센서로 선회 가장 종 × ¹⁰³ 세포 - 마이크로 어레이의 검출 한계는 10 ^2이다. 이러한 모든 속성은 antibo을DY 마이크로 어레이 기술이 연구에서 제시된 방법은 특히,보다 신속하고 간단한 방법은 상기 기술들에 비하여.

이 작업은 토양, 물 샘플에서 박테리아의 존재를 검출하기위한 마이크로 어레이, 항체 기반의 바이오 센서를 사용하는 실험의 두 가지 예를 나타낸다. 매우 작은 샘플 볼륨과 매우 기본적인 시료 전처리를 필요로하는 샌드위치 면역 분석법 포맷에 기초하여 간단하고 신뢰할 수있는 방법이다. 이 방법은 짧은 시간을 필요로하고 현장에서 쉽게 수행 될 수있다.

프로토콜

면역원 1. 준비

1. 표 1에 기재된 조건 하에서 해당 배지에서 각각 시아 노 박테리아 균주를 성장한다.
   참고 : 각 시아 노 박테리아 균주에 대한 성장 매체와 문화 조건은 표 1에 나열되어 있습니다. 모든 시아 노 박테리아 균주, K17를 제외하고, 자치시 대학 (마드리드, 스페인)에서 안토니오 사다의 그룹에 속한다. Planktothrix의 rubescens에 대한 항체는 Vilasouto 저수지 (북부 스페인)에서이 cyanobacterium의 특이 꽃의 자연 시료에서 생성되었습니다.
2. 늦은 지수 또는 고정 성장 단계의 배양으로 약 ¹⁰⁸ 세포 / ㎖를 얻기 위해 광학 현미경으로 세포 계수 챔버를 이용하여 세포 수를 정량화.
3. 5 분 2,000 XG에 원심 분리하여 문화의 5 ㎖에서 수확 세포.
4. 뜨는을 취소하고 10 ML의 욕조에서 세포를 재현 탁1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (1X PBS)와 E는 / ㎖를 약 ¹⁰⁸ 세포를 얻었다.
5. 균질화 및 휴대용 핸드 헬드 초음파 처리기를 사용하여, 얼음에 30 내지 60-S, 일시 정지, 5 회, 30 초마다 초음파 처리하여 현탁액의 용균 또는의 수욕에 튜브를 침지하여 최대 진폭 (30 kHz에서)에서 셀 계 장애.
6. cyanobacterium의 각 변형 1.5 - 반복 1.3 단계를 반복합니다.
   주 : 초음파 처리가 세포 분열 및 세포 콘텐츠 자료를 생산하고 있습니다. 단백질과 다당류는 지질 및 핵산 좋은 면역원, 특정 분자가 있지만, 그들 자신에 의해 체액 성 면역 반응을 유도하지 않습니다. 따라서, 이들은 분자의 복잡성을 증가시키는 등의 다당류 나 단백질 등의 담체에 결합한다. 또한, 초음파 항체 생산을 트리거 할 수 있습니다 세포 내 물질을 해제합니다.

폴리 클로 날 항체 2. 생산

1. 첫 번째 IMM 준비완전 프로 인트 보조제 0.5 ㎖의 단계 150에서 얻어진 초음파 파쇄 0.5ml를 혼합하여 투여 unogen. 다중 클론 토끼 항체 생산 용 동물 시설의 오퍼레이터에게 제공한다.
2. 불완전 프로 인트 보조제 0.5 ㎖의 단계 150에서 얻어진 동일한 파쇄 / 해물을 0.5 mL로 혼합하여 항체 생산 공정 메모리 부스트로서 더 사용 전과 3 개의 투여 량을 준비한다. 항체의 제조 방법을 수행하기 위해 동물 시설에 보내기.
3. 반복 2.1 및 각각의 새로운 항체 생산 공정에 대한 2.2 단계를 반복합니다.
   참고 : 적절한 라이선스 및 교육을 동물로 작업해야하기 때문에 일반적으로 항체 생산, 전문 동물 시설이나 회사에 위탁된다. 회사는 혈청 시료 내에 존재하는 항원 - 특이 적 항체의 양의 상대적 효소 면역 분석법 (ELISA) 측정을 공급한다.

3. 항체을 정제ication

1. 면역 단백질-A 친화도 크로마토 그래피에 의해 2 단계에서 수집 된 예비 면역 혈청 모두에서 면역 글로불린 G (IgG의) 부분을 정제. 일부 상용 정제 키트, 카트리지 시스템을 기반으로, 잘 작동; 공급자의 지침을 따르십시오.
2. 정제 키트 탈염 시스템을 제공하지 않는 경우, 투석 또는 100 kDa의 (또는 그 이하) 막 공극 크기 원심 여과 장치를 이용하여 역시 PBS를 0.1X하는 정제 된 항체의 용출 버퍼를 변경.
3. 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 또는 브래드 퍼드 ⁽²³⁾ 라 ²⁴ 또는 Bicinchoninic 산 (BCA) ²⁵ 비색 방법을 사용하여 항체 농도를 결정한다.
   주 : 그들은 에폭시기로 활성화 된 고체 표면에 대한 결합에 대해 항체와 경쟁하기 때문에, 용출 버퍼 (예, 트리스 완충액) 아민기를 포함하지 않도록하는 것이 중요하다. 푸 후rification ELISA로 항체의 활성을 시험하는 것이 중요하다.

4. 형광 항체 라벨링

1. 디메틸 술폭 시드 100 μL (DMSO)로 표지 한 단백질 mg의 염료를 함유하는 상업적 바이알을 용해하여 형광 색소 (예를 들어, 원적외선 형광 염료)와 (3)에서 얻어지는 정제 항체를 라벨. 50mM의 인산 완충 식염수 (PH 8.5) 50 μL의 최종 부피에 2 ㎎ / ㎖의 농도에서 각각의 항체 제조에 용해 된 염료의 2 μL를 추가한다.
2. 주위 온도에서 1 시간 및 진동 플랫폼에서 1,200 rpm으로 연속 교반하에 라벨 반응을 유지한다.
3. 크기 배제 크로마토 그래피에 의해 표지 된 항체를 정제하여 (예를 들어, 컬럼에 포획 1.5 내지 30 kDa의 사이에 분별 범위의 겔을 사용하는) 제조업체 권고 다음.
4. 280 nm에서와 용출액에서 650 nm에서의 흡광도를 측정하고 라베를 계산공급 업체의 권장 사항은 다음 링의 효율성.
   참고 : 최대 50 × 50가-μL 항체 - 라벨 반응은 단백질의 표지 1 mg을위한 형광 염료의 단일 유리 병으로 수행 할 수 있습니다. 4.3 단계 후 담금질 처리를 피하기 위해 불투명 0.5 ㎖의 튜브를 사용하여, 또는 알루미늄 박이나와 튜브를 덮도록 권장된다. 의 IgG 항체의 경우, 최적의 라벨은 항체의 몰 당 3-7 몰의 염료에 의해 달성된다.

5. CYANOCHIP 생산

1. 인쇄 액의 항체 및 컨트롤
   1. 0.01 % (v / v)의 트윈 20 (비 - 이온 성 세제), 최종 농도로서 모두와 상용 1X 단백질 인쇄 버퍼에 1 ㎎ / ㎖에서 각각의 항체를 혼합하여 인쇄 솔루션의 각 정제 된 항체 30 μL를 준비한다.
      주 : 대안 적으로, 항체 용액을 20 % 글리세롤, 1 % 수크로오스 (또는 트레할로스, 보존제 등), 0.01 % (/ V w) (v / v)의 탄산 완충액 트윈 20 (PH 8.5)를 포함 할 수있다.
   2. 30 μL 컨트롤과 같은 프린팅 용액의 준비 : 1 밀리그램 (a) 1X 단백질 인쇄 버퍼 0.01 % (v / v)의 트윈 20, (b) 단백질 정제 된 예비 면역 혈청 / 1X 단백질 인쇄 버퍼와 용액 0.01 % (v / v)의 트윈 20, 1 밀리그램 (c) 소 혈청 알부민 (BSA) / ㎖의 0.01 %와 1X 단백질 인쇄 버퍼 (v / v)의 트윈 20.
   3. (예를 들어, 1 μg의 / mL의 50 μg의 / ㎖에서) 트윈 (20) 1 배 단백질 인쇄 버퍼, 단계 5.1.1에서와 같이 서로 다른 농도에서 형광 표지, 정제 미리 면역 혈청의 30 μL를 준비합니다. 이 샘플은 형광 프레임 마커로 및 안보 후 상대 형광 정량에 사용됩니다.
   4. 폴리 프로필렌과 같은 고품질로 384 웰 마이크로 마이크로 어레이 제조 30 단계 5.1.1, 5.1.2에서 제조 한 인쇄 용액 웰 당 μL 및 5.1.3 추가.
      주 : 단백질 인쇄 버퍼는 항체의 품질과 안정성을 증가시키고, 트윈 20은 스폿 모 균일화rphology 및 단백질 커플 링까지를 구축합니다. 사용하기 전에 4 ° C에서 384 웰 마이크로 플레이트를 유지하는 것이 좋습니다. 오랜 시간 동안 -20 ° C에서 보관합니다. 폴리 프로필렌은 낮은 DNA, 단백질, 세포 추출물 및 고유 바인딩 작은 분자를 가지고있다.
2. 현미경 슬라이드 상에 항체 인쇄
   주 : 접촉 분할 바늘 또는 압전 프린터 또는 "잉크 젯"기술로서 비접촉 형 장치와 같이, 서로 다른 배열의 플랫폼을 사용하여 활성화 된 현미경 슬라이드 상에 항체를 출력한다. 이 작품에서, CYANOCHIP는 정기적으로 μm의 규모에 항체의 거리 nL 수량에 얼룩을지게 할 수있는 로봇 시스템 (Arrayer에)를 사용하여 접촉에 의해 인쇄되어 있습니다.
   1. 상대 습도 50 % - 20 ° C, 40 행의 인쇄 실내의 환경 조건을 설정한다.
   2. 슬라이드 기판을 설정 (예를 들어, 75- × 25-mm 에폭시 활성화 현미경 유리 슬라이드는) 여러 동일한 항체 ARRA을 수행 할 수각 슬라이드에 YS.
   3. 중으로 스폿 패턴 제어 및 기준 프레임을 포함하여 각각의 정제 된 항체를 스폿; 직경이 200㎛ - 이러한 조건에서, 스폿 (180)이다.
   4. 인쇄 후, 4 ℃에서 보관 한 후이를 건조 수 있도록 주변 온도에서 적어도 30 분 동안 슬라이드를두고; 현장에서의 작업에 대한 상기 슬라이드를 반송 할 수 있고, 몇 달 동안 주위 온도에서 저장된다.
      주 : CYANOCHIP는 슬라이드 당 3 × 8 동일한 마이크로 어레이 또는 1 × 9 마이크로 어레이 형식으로 9 동일한 배열을 가진 세중 자리 마이크로 어레이 형식으로 인쇄됩니다. 각 배열의 크기는 24 웰 개스킷 (3 × 8 혼성화 챔버 내에서 일반적으로 7.5 X 6.5 mm)에 대한 반응 챔버의 크기보다 클 수 없습니다해야합니다.
   5. 환경 시료를 분석하는 마이크로 어레이를 사용하기 전에 적정 곡선의 각 항체 작용 희석액을 결정 FSMI를 사용한다. 각 항체에 대해 해당 IMM 표준 농도를 사용하여unogen ^(3월 10일에서 4월 10일까지 세포 / ㎖) 및 형광 항체의 연속 희석 (1 내지 500 및 1 : 32,000). 최적의 항체 농도는 적정 곡선에서 얻어진 최대 신호 강도의 50 %에 상당한다. 블란 등의 알에 기재된 바와 같이 또한, 각 항체에 대한 민감도와 특이도가 결정되어야한다. ^22.

형광 샌드위치 마이크로 어레이의 면역을위한 환경 다중 동시 추출 6. 준비 (FSMI)

1. 액체 샘플에서 다중 동시 추출
   1. (물이 저수지의 해안에서, 예를 들어 물) 멸균 주사기로 액체 시료 100 mL에 - 1을 시료의 양이 대상의 전위 농도에 따라 크게 좌우된다.
   2. 3 ㎛의 기공 크기, 47 mm 직경의 폴리 카보네이트 필터를 통해 물이 샘플을 통과시켜 세포를 농축; 휴대 농도⁽³⁾ 10 내지 - ¹⁰⁸ 세포 / ㎖의 양성 검출하는 것이 바람직하지만, 실제 농도는 알려져 있지 않다.
   3. 그것을 긁어; 변형 TBS 버퍼 1 ㎖, 트윈 20 보강 완충액 (0.4 M 트리스 -HCl (pH를 8), 0.3 M의 NaCl, 0.1 % 트윈 20 TBSTRR)와 필터에 수집 된 매스를 복구 15 ML의 튜브에 주걱.
   4. 균질화 또는 바로 아래로 여러 번을 피펫 팅에 의해 단계 1.5에 기재된 바와 같이, 휴대용 초음파 처리를 이용하여 해리하는; 이는 마이크로 어레이 분석을 위해 샘플을 준비한다.
2. 고체 시료에서 다중 동시 추출
   1. 10 ㎖의 튜브에 고체 시료 0.5 g (예를 들면, 바위, 토양 또는 퇴적물)까지 달아 TBSTRR 2 용액을 추가 할 수 있습니다.
   2. 강력한 초음파 처리 혼 수조로 튜브를 침지함으로써, 또는 휴대용 초음파 처리기를 사용하여, 상기 튜브에 소니 케이 터 프로브를 침지시켜 초음파 처리. 적어도 5 × 30의를 수행얼음 동안 30 초 동안 정지 30 kHz의에서 사이클.
   3. 10 - 12 mm 직경에 연결된 10 mL의 주사기 -5- 20 μm의 공경 나일론 필터 홀더 모래, 점토, 기타 거친 물질을 제거하는 필터. 1.5 mL의 튜브에 필터를 통해 샘플을 누릅니다. 필터가 포화되면, 주사기의 현탁액을 교반하고 새에 가지고; 이 면역 분석 (단계 7)에 여과 재료를 준비한다.
      주 : TBSTRR의 완충 능력은 시료의 종류에 따라 다릅니다. 이는 분석 물질의 효소 분해의 영향을 피하기 위해 환경 추출물의 제조 직후 면역 측정법을 수행하는 것이 중요하다. 대안으로, 다음 단계까지 -80 ℃에서 환경 추출물 및 동결로 프로테아제 억제제를 추가한다.

7. 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI)

1. CYANOCHIP 차단
   참고 : 즉시 사용하기 전에 페이지를 처리rinted 슬라이드 모든 자유 에폭시기를 차단 및 비 - 공유 결합 된 항체의 잉여를 제거하는 슬라이드.
   1. 5 %와 0.5 M 트리스 - 염산 (pH를 9)에 마이크로 어레이를 담가 5 분 로커 플랫폼에서 온화한 교반과 함께 깨끗한 표면에 BSA 용액 (예를 들어, 페트리 접시 또는 50 mL의 관) (/ V w). 또는, 직면하고있는 마이크로 어레이의 관광 명소와 상기 용액의 100 ~ 200 μL에 드롭에 아래로 슬라이드를 배치합니다. 3 남겨 - 5 분 ​​후 진행합니다.
   2. 조심스럽게 플라스틱 스쳐 집게를 사용하여 슬라이드를 선택; 감동 마이크로 어레이 영역을 피하려고. 부드럽게 종이 타월에 슬라이드를 노크하여 액체의 초과를 제거합니다. 2 %와 0.5 M 트리스 - 염산 (pH를 8) 로커 플랫폼에서 온화한 교반과 함께 30 분 동안 (w / v)의 BSA 용액에 담가.
   3. 현미경 슬라이드에 적합한 시판의 microcentrifuge 사용 - (1 분 동안 300 XG 200) 짧은 원심 분리를 수행하여 슬라이드를 건조. 또한, 부드럽게 ONT 노크하여 슬라이드를 건조OA 종이 수건.
2. 마이크로 어레이와 다중 동시 샘플 추출물의 배양
   1. 다수의 마이크로 어레이 24 우물과 상업 마이크로 어레이 혼성화 카세트에서 슬라이드를 설정; 공급자의 지침을 따르십시오.
   2. 슬라이드와 카세트 조립 후, 시료 추출물 또는 카세트의 각 웰에 TBSTRR에서의 희석액 50 μL까지 피펫.
   3. 각 샘플 단계를 반복 7.2.2 분석한다.
   4. 빈 대조군으로 TBSTRR 피펫 50 μL 카세트 중 적어도 두 개의 분리 된 웰로 버퍼.
   5. 매 15 분 또는 피펫 온화한 진탕을 남겨 혼합하면서 주위 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션. 또한, 4 ℃에서 12 시간 동안 배양.
      주 : 마이크로 어레이 패턴의 함수로 다른 배양 가스켓을 사용합니다. 시간 단계 7.2.5의 배양 온도는 통상의 친 화성 및 결합 KI에 의존 경험적 파라미터들이다각각의 동력학은 항원 - 항체를 쌍.
3. 세탁
   1. 아래 카세트를 넣고 조심스럽게 깨끗하고 흡수성 종이에 그것을 노크하여 샘플을 제거합니다.
   2. 위와 같이, 각 사람에게 TBSTRR 150 μL를 추가하여 우물을 세척하고, 버퍼를 제거한다.
   3. 단계를 반복 7.3.2 세 번 이상.
4. 형광 검출기 항체 배양
   1. 17 항 시아 노 박테리아 - 변형 항체를 포함하는 항체 혼합물의 50 μL를 추가, 각각 1 % (w / v)의 BSA와 TBSTRR의 형광 색소로 표지. (0.7 μg의 2 / ㎖로) 혼합물을 각 형광 항체의 농도를 측정 각 항원 / 항체 쌍 ^(22)의 적정 실험을 수행하여.
   2. 단계 7.2.5에서 설명하는, 4 ℃에서 12 시간에 관해서는, 주위 온도에서 1 시간 동안 배양.
5. 형광 항체를 세척 <> / 강해
   1. 단계 7.3에서와 같이, 형광 언 바운드 항체를 제거합니다.
   2. 카세트를 분해하고 빠른 헹굼 용 (50 ㎖의 튜브 예) 0.1X PBS로 슬라이드를 담가.
   3. 단계 7.1.3에서와 같이 슬라이드를 건조시킵니다.

형광 8. 검색

1. 형광을위한 스캐너에서 멀리 붉은 형광 염료의 최대 발광 형광 피크에서 형광의 슬라이드를 스캔합니다. 일반적으로, 레이저 이득 값을 낮춤으로써, 다른 주사 파라미터의 마이크로 어레이의 여러 이미지를 가라.
   참고 : 피 포화 반점 (> 65,000 형광 카운트) - 그들은 규모에서하고 정량화 오류가 발생할 수 있습니다.

9. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석

1. 이미지 분석 및 정량화를위한 ​​상용 소프트웨어를 사용; E의 (하나의 지점에서 모든 픽셀의 평균 또는 중앙값 FI) 소프트웨어는 형광 강도의 측정을 제공한다전체 마이크로 어레이의 ACH 지점. - FI _{지역 배경} FI = FI의 _자리 : 스팟 주변 지역의 배경을 뺍니다.
2. FI 데이터를 저장하고 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 엽니 다.
3. 거짓 탐지를 확인하고 폐기하는 음성 대조군으로 빈 배열에 대해 얻은 값을 사용합니다. 각 항체 지점에 대한 FI 계산하려면 다음 방정식을 적용 : - FI _샘플 = FI _지점 - 마이크로 어레이에서 FI _{지역 배경} 샘플 추출 및 _빈 FI = FI _지점 실행 - FI = (FI _빈 FI _샘플) FI _{지역 배경} 빈 마이크로 어레이한다.
4. 2-에 추가적인 차단 임계 적용 위양성의 가능성을 최소화하기 위해 마이크로 어레이 전체의 FI의 평균을 3 배; 이는 열악한 품질의 마이크로 어레이 이미지 및 낮은 신호대 잡음비에 특히 적합하다.
5. 플롯을 생성 및 / 또는 필요에 따라 추가 분석을 수행합니다.

결과

이 작품은 CYANOCHIP 항체 마이크로 어레이를 사용하여 가장 관련성이 담수 시아 노 박테리아 종의 동시 식별 (표 1)에 대한 다중 면역 테스트를 설명합니다. 마이크로 어레이는 현미경 슬라이드에 인쇄 된 3 × 8 마이크로 어레이 형식이 될 수 있습니다. 각각의 마이크로 어레이는 음성 대조군으로 A A 세중 자리 패턴 인쇄 (17) 항체의 설정, 해당 사전 면역 항체 및 BSA로 구성되어 있습니다. 마이크로 어레이는 마이크로 어레이 쉽게 패턴 ⁽²²⁾ (도 1)를 현지화하는 형광 표지 미리 면역 항체를 이용하여 형광 프레임을 포함한다.

마이크로 어레이는 마드리드의 도시를 공급하는 담수 Lozoya 저수지의 해안에서 수집 물 샘플의 현장에서

토론

여기서, CYANOCHIP, 시아 노 박테리아 장군의 넓은 범위의 검출 및 식별을 위해 17 항체 마이크로 어레이를 이용하여 멀티 플렉스 형광 샌드위치 면역 검정은 ^22를 설명한다. 이 시아 노 박테리아는 담수 서식지에서 그들 중 일부있는 독소 생산을 가장 많이 저서 및 플랑크톤 장군을 나타냅니다. 최근, 형광 면역 샌드위치 형식 애플리케이션 환경 ^{(26, 27, 28)를} 미생물 및 / 또는 bioanalytes를 식별하는 데 사용되어왔다. 프로토콜은 주로 두 단계에 기초한다 : (I) 특히 시료로부터 분석 대상 물질에 결합하는 항체를 고정화하거나 캡처 (II)의 형광 표지 된 항체 (탐침 또는 검출 항체)를 사용하여 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 mm 공극 직경 필터	Millipore	GSWP04700	면역원 준비용
Eppendorf  5424R 마이크로 원심분리기	Fisher Scientific		면역원
준비용 인산염 완충액 식염수(PBS) pH 7.4 (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011036	50mM 인산칼륨, 150mM NaCl, pH 7.4
초음파 프로세서 UP50H	Hielscher		면역 물질 준비를 위해
Freund의 보조제를 완료하십시오	Sigma-Aldrich	F5881	면역강화제
불완전 프로이트의 보조제	Sigma-Aldrich	F5506	부스트 주사용
단백질 A 항체 정제 키트	시그마-알드리치	PURE1A	IgG 분리용
원심 필터 장치 MWCO< 100 kDa	Millipore	UFC510096-96K	IgG
투석 튜브의 분리용, 벤조일화	Sigma-Aldrich	D7884-10FT
IgG Illustra Microspin G-50 컬럼 분리용	GE-HealthCare	GE27-5330-02	IgG
Bradford 시약	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	를 위해 항체 농도를 정량화하기 위해
MicroBCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23235	항체 농도 정량화
단백질 어레이 버퍼 2x	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	인쇄 버퍼; 30 - 40% 글리세롤이 있는 1x PBS에 0.01% 트윈 20
트윈 20	시그마-알드리치	P9416	비이온 세제
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  인쇄용; 차단 시약
384-웰 마이크로플레이트	Genetix	X6004	항체 인쇄
용 로봇 어레이어 Digilab		의 MicroGrid II TAS 어레이어	항체 인쇄용
에폭시 기판 유리 슬라이드	Arrayit corporation	VEPO25C	항체 인쇄를 위한 견고한 지원
Alexa Fluor-647 숙시니미딜-에스테르	분자 프로브	A20006	플루오로크롬
DMSO	시그마-알드리치	D8418	플루오로크롬 용해
Heidolph Titramax 진동 플랫폼 쉐이커	Fisher Scientific		항체 라벨링용
Illustra Microspin G-50 컬럼	헬스케어	27-5330-01	라벨링된 항체의 정제를 위해
안전 밀봉 갈색 0.5 mL 튜브	Sarstedt	72,704,001	라벨이 지정된 항체 보관을 위해
Nanodrop 1000 분광 광도계	Thermo Scientific		항체 농도 및 라벨링 효율을 정량화하기 위해
3 µ m 기공 크기 폴리카보네이트 47 mm 직경 필터	Millipore	TMTP04700	집중 세포
1 M Trizma 염산염 용액 pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	TBSTRR 제제용; 슬라이드를 차단하기 위해
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S7653	TBSTRR 준비
20 &마이크로; M 나일론 필터	Millipore	NY2004700	환경 추출물 준비용
10 - 12 mm 필터 홀더	Millipore	SX0001300	환경 추출물 준비용
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma-Aldrich	P8340	환경 추출물 저장용
1 M Trizma 염산염 용액 pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	슬라이드를 차단하려면
Heidolph Duomax 1030 흔들 플랫폼 쉐이커	VWR		슬라이드를 차단하려면; 인큐베이션 프로세스용
VWR 갤럭시 미니어레이 마이크로원심분리기	VWR	C1403-VWR	슬라이드를 건조하기 위해
멀티웰 마이크로어레이 하이브리드화 카세트	Arrayit corporation	AHC1X24	슬라이드당 24개의 분석을 위한 카세트
GenePix 4100A 마이크로어레이 스캐너	분자 소자		형광용 스캐너
GenePix Pro 소프트웨어	분자 소자		이미지 분석 및 정량화를 위한 소프트웨어