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방법 논문

다제 내성 항 감염 블루 라이트 치료의 생체 조사에서 아시네 토 박터 바우 마니는 생물 발광 영상을 사용하여 감염을 굽기

8.8K 조회수

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DOI:

10.3791/54997

⸱

2017년 4월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

이 논문에서

요약

다제내성(MDR) 박테리아 균주에 의한 감염은 공중 보건에 대한 심각한 위협으로 부상하여 대체 치료제의 개발을 필요로 하고 있습니다. 생물발광 영상을 사용하여 마우스 화상에서 MDR Acinetobacter baumannii 감염에 대한 항균 블루라이트(aBL) 요법의 효과를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

감염 이환율과 사망률의 중요한 원인으로 계속 굽습니다. 다제 내성 (MDR) 박테리아의 증가 출현은 전통적인 항생제 치료의 잦은 오류로 이끌었다. 대체 치료제가 절실히 MDR 박테리아를 해결하기 위해 필요하다.

혁신적인 비 항생제 접근 방식은, 항균 푸른 빛 (ABL)는 MDR의 감염에 대한 유망한 효과를 보여 주었다. ABL의 작용 기전은 아직 잘 이해되지 않는다. 이는 일반적으로 자연 (예를 들어, 철없는 포르피린, 플라 빈과 프르 등) 박테리아에서 내인성 감광 발색단을 발생하는 것은 광화학 프로세스를 다시 세포 독성 활성 산소 종을 생성 ABL (ROS)에 의해 여기되는 것을 가정한다.

또 다른 빛 기반 항균 접근 방식과는 달리, 항균 광 역학 치료 (aPDT)는, ABL 치료는 외래 photosensitiz의 개입을 필요로하지 않습니다어. 그것은을 적용 할 필요가 모든 푸른 빛의 조사입니다 따라서, 간단하고 저렴하다. 에이 비엘 수용체는 박테리아 세포의 내인성 감광제보다는 DNA이다. 따라서, ABL은 훨씬 적은 유전 독성 직접 숙주 세포의 DNA 손상을 일으키는 자외선 C (UVC) 조사보다 숙주 세포에 의한 것으로 생각된다.

본 논문에서는 화상 부상의 마우스 모델에서 MDR 된 Acinetobacter baumannii의 감염 ABL 치료의 효과를 평가하기위한 프로토콜을 제시한다. 조작 된 생물 발광 균주를 사용하여, 우리는 비 침습적 살아있는 동물에서 실시간으로 감염의 정도를 모니터링 할 수 있었다. 이 기술은 또한 동물에서 감염의 공간 분포를 모니터링하기위한 효과적인 도구이다.

서론

자주하기 때문에 피부의 열 손상의보고 굽기 감염, 이환율과 사망률 1의 중요한 원인이 될 것을 계속한다. 화상 감염 관리 더욱 의한 항생제의 대규모 사용 다제 내성 (MDR) 2 균주의 출현 증가에 의해 손상되었다. 한가지 중요한 MDR 그람 음성균 최근 전투 상처와 관련된 것으로 알려진 거의 모든 가능한 3 항생제에 내성이있다 아시네 토 박터 바우 마니이다. 부상당한 초점에서 바이오 필름의 존재는 지속적인 감염 8, 9가 발생, 4, 5를보고되었으며, 항생제 및 숙주 방어 6, 7에 대한 내성을 악화시킬 것으로 생각된다. 따라서, pressin이있다g 대체 치료법의 개발이 필요합니다. 퇴치 항생제 내성 박테리아에 대한 최근 발표 된 국가 전략에서, 항생제 대체 치료제의 개발은 미국 (10)의 정부 조치로 지적되고있다.

라이트 기반의 항균 접근 방식은, 이름으로 표시된 바와 같이, 또는 다른 에이전트없이 광 조사가 필요합니다. 이러한 접근은 항균 광역 동 치료 (aPDT), 자외선 C (UVC) 조사 및 항균 청색광 (ABL)을 포함한다. 이전의 연구에서, 그들은 MDR 균주 11, 12, 13을 죽이는 유망한 효과를 보여 주었다. 세 가지 빛 기반의 접근 방식 중 ABL 인해 감광제 (14)를 사용하지 않고 고유의 항균 특성에 최근 관심을 증가 모으고있다. 비교 예에서aPDT 빛과 감광제의 조합을 필요로하면서 aPDT에 ISON은 ABL은 빛의 사용을 포함한다. 따라서, ABL (14)는 간단하고 저렴하다. UVC 비교에서, ABL은 덜 세포 독성 세포 (15)를 호스팅하는 유전자 독성 것으로 여겨진다.

이 프로토콜의 목표는 마우스 모델에서 MDR의 A. baumannii에 의한 화상 감염의 치료를위한 ABL의 효과를 조사하는 것입니다. 우리는 실시간으로 세균 부담의 비 침습적 모니터링을 허용 화상 감염의 새로운 마우스 모델을 개발하기 위해 생물 발광 병원성 박테리아를 사용합니다. 체액 / 조직 채취 및 후속 도금 콜로니 16 카운트 전통적인 방법에 비해,이 방법은 정확한 결과를 제공한다. 조직 샘플링 과정은 실험 오차의 다른 소스를 소개 할 수있다. 박테리아 발광 강도는 corres에 선형 비례하므로박테리아 CFU 17 ponding 우리는 직접 광 조사 특정 투여 후 박테리아의 생존을 측정 할 수있다. 실시간으로 빛 치료를 받고 살아있는 동물에서 세균 부담을 모니터링함으로써, 세균을 죽이는의 반응 속도는 마우스의 상당히 감소 번호를 사용하여 특징으로 할 수있다.

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프로토콜

세균성 문화 1. 준비

  1. 뇌 심장 주입 (BHI) 50 mL의 원심 분리기 튜브에 매체의 7.5 ML을 추가합니다. 종자 A. baumannii가 상기 BHI 배지에서 세포 후 18 시간 동안 오비탈 인큐베이터 (37 ° C)의 A. baumannii에 문화를 배양.
  2. 5 분 동안 3,500 × g에서 세포의 배양 상등액을 원심 분리기를 제거하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 펠렛을 세척 하였다.
  3. 신선한 PBS의 세균 펠렛을 다시 중단하고 철저하게 정지를 피펫.
  4. 세균 현탁액 100 μL를 수집하고 신선한 PBS를 사용하여시 10 분 희석을합니다.
  5. 1.5 mL의 반 마이크로 큐벳에 희석을 전송하고 600 nm의 OD (600 ㎚)의 파장에서의 광학 밀도 (OD)를 측정한다.
  6. 희석의 측정 된 OD 600 nm의 값 및 상기 희석 계수 (10)에있어서 원래 PBS (원액) 현탁액의 OD 600 nm의 계산.
  7. 일을 조정PBS에 현탁 전자 원은 600 나노 = (108 CFU / ㎖의 세포 농도에 해당) 0.6 중독한다.

발광 생물 A로 인한 굽기 감염 2. 마우스 모델. baumannii가

  1. 사용 성인 여성 BALB / c 마우스 7-8주 세와 17-19g 무게. 생쥐 실험을 시작하기 전에 최소 3 일 동안 실험실 조건에 순응 할 수 있습니다. 21 ℃의 실온에서 12 시간 빛 / 어둠주기에서 쥐를 유지하고 그들에게 음식과 물을 자유로이을 제공합니다.
  2. (- 20 밀리그램 / kg 100 밀리그램 / kg)을 케타민 - 자일 라진 칵테일을 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 가볍게 면봉으로 각 마우스의 palpebra 접촉; 눈꺼풀 반사의 부재는 적절한 마취 깊이를 제안합니다. 마취 동안 건조에서 눈을 방지하기 위해 수의사 연고와 마우스 눈을 커버.
  3. 5를 사용하여 가능한 한 피부를 노출 뒷면 생쥐 쉐이브0 블레이드 머리 깎기.
  4. 상대적으로 수평 위치에 자신의 허리를 유지하기 위해 쥐의 복부 아래에 35mm 페트리 접시의 뚜껑을 놓습니다.
  5. 250 ㎖의 비커 (전체 80 %)의 물을 끓여 10 "X 10", 220 VAC 열판을 사용. 물과 열 평형에 도달 할 때까지 비이커 브라스 블록 (1cm X 1cm 단면)을 담근다. 열적 평형은 일반적으로 <5 분 걸리며 비이커에서 물을 다시 비등에 의해 표시된다.
  6. 레코딩 부상을 만들기 전에, 진통제 선제 진통제 (를 0.1 mg / kg 프레 노르 핀의 피하 주사) 투여.
  7. 십분 선제 진통제 후, 부드럽게 화상 창상 유발 7 초 동안 마우스의 뒷면 면도 영역으로 가열 황동 블록을 누른다.
    참고 : 굽기 절차를 수행 할 때 작업 인력에 열 손상을 방지하려면, 열 방지 장갑을 착용하십시오.
  8. subcutaneou 통해 멸균 식염수 0.5ml의 관리의 주입은 탈수를 방지합니다.
  9. 열 손상의 유도는 다음 5 분, 피펫을 이용하여 화상에 마우스 PBS에서 5 × 106 CFU를 함유하는 박테리아 현탁액 50 μL를 접종한다. 피부에 지그재그 운동 멸균 면봉으로 이동하여, 가능한 한 균등하게 연소 된 영역에서 균체를 분배하기 위해 화상에 분취 얼룩.
  10. 4 절에 설명 된 세균 접종 후 즉시, 감염에 대한 생물 발광 화상 촬상을 수행한다.
  11. 쥐가 마취로부터 완전히 회복 될 때까지 물을 가열 수술 침대 (37 ° C, 복구 영역)에 마우스를 놓는다. 하우스 바이오 안전성 레벨 2 동물 실에서 케이지 당 5의 최대 수와 마우스.
  12. 레코딩 손상 후 3 일에 대한 회 진통제 (0.1 ㎎ / ㎏의 프레 노르 핀을 피하 주사) 투여.

를했다. & # 3. 항균 블루 라이트 치료(160); 마우스의 baumannii의 감염

  1. 세균 접종 후 24 시간에서 ABL 치료를 시작합니다.
  2. ABL 조사에 대한 415 nm에서 발광 피크로 발광 다이오드 (LED)를 사용한다. ㄱ 방열판에 장착하는 LED 마우스 (18)의 조사 영역에서 열적 효과를 방지한다. 상기 LED가 상하로 이동하도록 클립 커넥터 광 지지봉에 고정 LED.
  3. 전력 / 에너지 미터 켜고 415 nm의 파장을 선택하기 위해 버튼을 누른다. 백그라운드 (주위 광)을 뺀 전력 / 에너지 미터 재설정.
  4. 바로 아래의 LED 전력 / 에너지 측정기를 놓는다. 푸른 빛 보호 고글을 착용 할 것. 광 스폿의 전체 ​​영역을 커버하도록 LED 라이트 켜고 LED 개구 (LED로부터의 광을 집광 렌즈) 및 전력 / 에너지 미터의 광 센서 (직경 2cm) 사이의 거리를 조정 광 센서.
  5. 조심스럽게 튜닝 LED 드라이버와는 포웨의 값을 기록R / 에너지 미터. 판독에 의한 조도를 계산 : 사조 = 읽기 (W) / 면적 (cm 2). LED 드라이버를 조정하여 100 mW의 / cm2로 LED의 광도를 조정한다.
  6. LED가 전원을 끄십시오. 발광 다이오드 개구 및 전력 / 에너지 미터의 광 센서 사이의 거리를 측정한다.
  7. (- 20 밀리그램 / kg 100 밀리그램 / kg)을 케타민 - 자일 라진 칵테일을 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 눈꺼풀 반사의 부재는 적절한 마취 깊이를 제안합니다.
  8. 임의로 ABL 처리 군 (N = 10) 및 미처리 대조군 (N = 10)로 쥐를 나눈다.
  9. 에이 비엘 처리 군의 경우, 광에 노출을 최소화하기 위해 알루미늄 호일로 마우스의 눈을 커버. 수평 위치에 자신의 허리를 유지하기 위해 마우스 복부 아래에 35 mm 페트리 접시의 뚜껑을 직접 LED에서 마우스 화상을 놓습니다.
  10. 사각형 페트리 디에 마우스로 단계 3.5에서 언급 한 전력 / 에너지 미터를 교체쉬. 단계 바와 같이 LED 개구 마우스 화상의 표면 사이의 거리가 LED 조리개 전력 / 에너지 미터의 광 센서 (레벨 간의 동일하다 다시 위치로 마우스의 높이를 조정 3.5).
  11. 100 mW의 / ㎠의 조사량에 감염된 화상을 조사한다. J / ㎠에 도달 할 때 (360)의 총 용량까지 72 J / ㎠의 투여 량으로 ABL을 제공 (예를 들면, 0, 72, 144, 216, 288, 360 J / cm 2). 제 4 절에서 설명하는 각 광 투여 후, 쥐에 대한 생물 발광 촬상을 수행한다.
  12. 제 4 항에서 설명한 바와 같이 미처리 대조군의 경우, ABL 처리 군에 사용되는 것과 동일한 시간 간격을 이용하여 마우스 생체 발광 화상의 촬상을 수행한다.
  13. 쥐의 복구 전에 열 손실과 저체온증을 방지하기 위해 물을 가열 수술 침대에 마우스를 놓습니다. 활동 및 복구 될 때까지 마우스의 눈꺼풀 반사를 관찰한다. 일 후쥐의 전자 복구, 그들에게 케이지 당 2-3 집.
  14. 마우스에서 감염 시간 바이오 부담을 모니터링 격일 후 처음 3 일 동안 매일 4 장에서 설명한 바와 같이 ABL 및 치료 후, 생물 발광 촬상을 수행한다.

마우스의 감염 4. 생물 발광 영상

  1. 이미지 강화 된 전하 결합 소자 카메라, 카메라 컨트롤러, 시료 챔버, 화상 처리부 (19)를 포함하는 낮은 광 이미징 시스템을 사용하여 마우스.
  2. (- 20 밀리그램 / kg 100 밀리그램 / kg)을 케타민 - 자일 라진 칵테일을 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 가볍게 면봉으로 마우스의 눈꺼풀을 만지지; 눈꺼풀 반사의 부재는 적절한 마취 깊이를 제안합니다.
  3. 라이브 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 표시되는 제어판에서 초기화를 클릭합니다. 온도 상자의 색을 나타내는 녹색으로 바뀔 때까지 기다리는 것이 무대의 온도시료 챔버에 37 ° C에 도달했다.
  4. 직접 카메라하에 감염된 화상과 상기 촬상 시스템의 시료 챔버 내의 스테이지 (37 ° C)의 마우스를 놓는다.
    참고 : 화상이 건조 될 때 세균의 생물 발광이 감소 할 수있다. 따라서, 이미징 전에 PBS와 마우스 화상을 보습하는 것이 좋습니다.
  5. 제어판에서 다음에 체크 표시를 "발광." 영상의 노출 시간이 생물 발광 강도를 기반으로 라이브 이미징 소프트웨어 최적화 될 수 있도록 "자동 노출"을 선택합니다.
  6. 은 "필드보기의"드롭 다운 목록에서 "C"를 선택합니다. 소프트웨어가 초점 거리를 결정하게하는 "스캔 중간 범위"옵션을 선택합니다. 오버레이 옆에 선택 표시를 넣습니다.
  7. 이미지를 캡처하는 "취득"을 클릭합니다. "OK;" "편집 이미지 레이블"상자에서 클릭 에 "이미지 창"과 "유료 팔레트"이 나타납니다.
  8. 자동 선택을위한 자동 ROI 매개 변수를 설정합니다.
  9. 상대 발광 유니트 (RLUs)와 생물 발광 강도를 정량화 (가장 강한)에서 핑크 청색 (가장 강한) 19 내지 20 범위의 거짓 컬러 스케일 생물 발광 표시.
  10. 생물 발광 강도 분석에 기초하여 시간 지점에서 마우스를 변화 화상에서 박테리아의 생존 비율을 계산한다. 주어진 시점에서 박테리아의 생존 분획 = 그 시점에서 측정 된 생물 발광 강도 / 생물 발광 강도 오른쪽 ABL 17 노출 전에 측정 하였다.

생쥐 항 안락사

  1. 다음 실험의 종점은 : 촬상 의해 결정된 생물 발광의 손실에 의해 입증되는 바와 같이 감염의 (a)의 해상도; (b) 조직적인 감염 발생되는 연소 이외의 생물 발광의 확산에 의해 지시 된 바와 같이에이; (c) 정상 연령대 마우스에 비해 ≥15 %의 체중 감소, 또는 수동 자극 부동 먹거나 마실 수 없기로 응답의 부족에 의해 표시된 바와 같이 통증과 고통으로부터 고통. 연구 기간 동안, 우리는 우리의 정의에 설명 된대로 마우스가 완전히 죽어가는 상태에 도달, 및 / 또는 우리는 우리가 그것을 안락사해야하는 경우 확실하지 여부를 알 수없는 상황이 발생할 경우, 우리는 CCM 수의학 직원에게 연락을 드릴 것입니다 행동 계획에 대한; (d)는 달리 마우스 30 일 연구 개시 후 안락사된다.
  2. 케이지로 (CO 2)의 압축 가스를 구체적으로 안락사 폐쇄 케이지로 쥐를 재배치 및 이산화탄소를 전달하여 마우스를 안락사.
    1. 가스의 흐름을 개시하기 위해 CO 2 탱크 또는 밸브 조절기를 연다. 레귤레이터는 기기에 게시 된 지침에 따라 올바른 PSI를 (파운드 평방 인치 당) 읽고 있는지 확인하고 재를 조정필요에 따라 올바른 PSI에 일반적으로 더 높은 PSI 5 이상을 gulator 없습니다.
    2. 천천히 입력합니다. (/ 분 7.5 L ~ 쥐 새장 ~ 2 L / 분, 전형적인 마우스 케이지) 유량은 분당 챔버 / 케이지 볼륨에는 30 % 이상을 대체 안된다.
    3. 이동 또는 호흡 정지 동물 대략 3-5 분을 기다린 눈은 고정 넓혀해야합니다. CO 2의 흐름을 중지 CO 2 탱크 또는 조절 밸브를 끄십시오.
    4. 마음이 엄지와 집게 손가락 사이의 가슴을 느낌으로 치고되지 않았는지 확인합니다. 안구를 터치하면 더 깜빡임이 없음을 확인합니다.
      1. 하트 비트 또는 깜박 반사가있는 경우, 안락사 과정을 반복하거나 기흉 (동물이 절차를 수행하기 전에 발가락 핀치에 응답하지해야합니다)을 만들 흉강을 엽니 다 가위를 사용합니다.

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결과

앞서 12, 17보고 우리가 사용한 A. baumannii에 균주는 임상 단리 MDR이다. 박테리아 균주 luxCDABE를 오페라 (11)의 형질 감염에 의해 생물 발광을 하였다. 도 1a는 대표적인 마우스에서 발광 박테리아 연속 화상이 5 × 106 A. baumannii에 감염된 화상 세균 접종 후 24 시간에 한 ABL 노광에 노출 나타낸다. 대표적인 마우스 피부의 조직 학적 단면의 그람 염색 (24 시간 후 접종 수확) 시편을 연소 감염된 화상 (도 1b)의 표면 상 A. baumannii에 생물막의 존재를 입증 하였다. 도 1a에 도시 된 바...

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토론

ABL은 감염을 치료하는 신규 한 방법이다. 그 작용 메커니즘은 화학 요법과는 완전히 다르기 때문에, 그것은 물리 치료의 더 많은 것이다. 항균 효과를 중재 에이전트는 청색 광 조사 (400-470 ㎚)이다. 청색 LED의 개발, 우리는 MDR 감염에 대한 효과적이고 간단한 빛 기반 항균 접근 방식에 대한 액세스 권한을 얻었다.

이 프로토콜에서는, 우리는 MDR, A. baumannii에의 생물 발광 변형에 의한 화상 감염 마우스 모델의 개발을 설명했다. 생물 발광 박테리아를 이용하여, 감염의 정도가 될 수있는 비 침습적 생체 발광 이미징 (imaging)을 통해 살아있는 동물에서 실시간으로 모니터링. 생물 발광 박테리아의 설계 변형 및 저조도 영상 법의 사용은 항생제 치료 중에 실시간으로 감염을 모니터링하기위한 효율적인 방법을 생성한다. 이 방법은 또한 감염의 연구에 사용할 수 있습니다다른 미생물 종에 의해 발생하는 다른 사이트에 있습니다. 항균 접근 방법의...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 미 육군 의료 연구 획득 활동 협력 협정(CIMIT No. 14-1894 to TD)과 미국 국립보건원(1R21AI109172 to TD)에 따라 의학 및 혁신 기술 통합 센터(CIMIT)의 일부 지원을 받았습니다. YW는 ASLMS 학생 연구 보조금(BS. S02.15). 우리는 YW를 위한 공동 멘토링에 대해 Wellman Center의 Tayyaba Hasan 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아이비스 PerkinElmer Inc, Waltham, MAIVIS Lumina Series III전임상in vivo 이미징
발광 다이오드 LEDVieLight Inc, 캐나다 토론토 조명용415nm
전력/에너지 미터Thorlabs, Inc., Newton, NJPM100D빛 방사 조도 감지기
마우스 Charles River Laboratories, Wilmington, MABALB/c7-8주 령, 17-19g 체중
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX임상 격리엔지니어드 발광 균주
인슐린 주사기Fisher Scientific14-826-79BD Lo-Dose U-100 주사기용 인슐린 주사기
Sodium Chloride Fisher Scientific7210160.9% Sodium
Chloride Phosphate Buffered Saline, 1x SolutionFisher ScientificBP24384 많은 생체 분자 절차에 사용되는 표준 인산염 완충액
Brain Heart InfusionFisher ScientificB11059세균 배양 매체
Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-959-70C세균 현탁액 원심분리기용
벤치탑 인큐베이션 오비탈 쉐이커Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH Incu-Shaker Mini세균 배양을 위한
접종 루프Fisher Scientific22-363-605   생쥐의 화상 표면에 세균성 inoclum 번뜨리기를 위해
Fisher Scientific Redi-Tip 피펫 팁, 1-200 &마이크로; LFisher Scientific02-707-502피펫 팁
써모 사이언티픽  Sorvall Legend X1 원심분리기Fisher Scientific75-004-220세균성 현탁액 분리용
Brass BlockSmall Parts, Inc., Miami, FL10 mm by 10 mm 마우스의 화상 생성을 위해
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat GlovesSuperior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NYPBI83514 내열성 장갑
Greiner 접시Sigma-Aldrich Co. LLCP5112-740EA35 mm × 10mm
Corning 디지털 핫 플레이트Cole-Parmer Instrument Company, LLCUX-84301-6510" x 10", 220 VAC, 끓는 물용 
마우스/랫 얇은 선 물 가열 수술 침대E-Z 시스템EZ-211수술 중 열 손실과 저체온증을 예방합니다
수의사 연고S& K Pharma, GmbHKerato Biciron 5%, 안구 건조증 예방을 위한 Augensalbe 안연 연고
광원.

참고문헌

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