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방법 논문

광열 각도 광산란와 신속하고 화학 무료 헤모글로빈 분석

9.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55006

⸱

2016년 12월 7일

 ,  ,  ,  , 
1School of Mechanical Engineering, Yonsei University, 2Department of Laboratory Medicine, Yonsei University

이 논문에서

요약

광열 각광 산란(PT-AS) 센서는 나노리터 규모의 혈액 샘플에 대해 빠르고 화학 물질이 없는 헤모글로빈 분석을 가능하게 합니다. 여기에서는 PT-AS 설정에 대한 세부 정보와 혈액 내 헤모글로빈 농도에 대한 측정 프로토콜이 제공됩니다. 빈혈 샘플에 대한 대표적인 결과도 제시됩니다.

초록

광열 각도 광산란 (PT-AS)은 혈액의 헤모글로빈 농도 ([헤모글로빈])를 측정하는 신규 한 광학 방법이다. 헤모글로빈 분자의 고유 광열 응답에 기초하여, 센서는 고감도 [헤모글로빈]의 무농약 측정을 가능하게한다. [혈색소] 0.35의 범위에서 0.12 g / DL의 한계와 검색 기능 - 17.9 g / DL는 이전에 증명되었다. 이 방법은 용이하게 이러한 레이저 포인터 웹캠으로 저렴 가전 기기를 이용하여 구현 될 수있다. 혈액 용기와 같은 마이크로 모세관 튜브의 사용은 또한 나노 리터 규모 혈액량과 낮은 운전 비용으로 헤모글로빈 분석을 가능하게한다. 여기서, PT-AS 광 설치 및 신호 처리 절차에 대한 자세한 내용은되게됩니다. 실험 프로토콜 및 빈혈 상태에서 혈액 샘플 대표적인 결과 ([헤모글로빈 = 5.3, 7.5 및 9.9 g / DL)도 제공되고, 측정은 그 이리저리 비교엄마의 혈액 분석기. 구현 및 운영에 단순 임상 실험실 및 자원 제한 설정에서 넓은 채택을 사용하도록 설정해야합니다.

서론

혈액 검사는 일반적으로 전체 인간의 건강을 평가하는 특정 질환에 관련 바이오 마커를 검출하기 위해 수행된다. 예를 들어, 혈중 콜레스테롤 농도는 밀접한 심혈관 질환 및 췌장염 관련되어 고지혈증의 기준으로서 역할을한다. 혈당 수준이 당뇨병 성 케톤 산증과 고혈당 삼투압 증후군과 관련된 합병증으로 혈당 내용은 자주 측정해야한다. 말라리아, 인간 면역 결핍 바이러스와 후천성 면역 결핍 증후군 같은 심각한 질병을 혈액 검사에 의해 진단하고, 적혈구, 혈소판을 포함한 혈액 성분의 정량 및 백혈구 췌장 및 신장 질환의 스크리닝을 가능하게한다.

헤모글로빈 (혈색소), 혈액의 중요한 구성 요소는 적혈구의 약 96 %를 구성하고, 사람의 장기에 산소를 수송한다. 질량 농도의 중요한 변경 ([혈색소])는 저를 나타낼 수있다tabolic 변경, 간담 질환,과, 신경 심혈관 및 내분비 장애 1. [혈색소 따라서 정기적으로 혈액 검사로 측정됩니다. 특히, 빈혈 환자, 투석 환자, 임산부에 강하게 중요한 작업이 같이 헤모글로빈]을 모니터링하는 것이 좋습니다.

다양한 [헤모글로빈] 검출 방법에 따라서 개발되었다. 헤모글로빈 시안화 방법 [헤모글로빈] 정량 가장 흔한 방법 중 하나는, 시안화 칼륨 (KCN)은 적혈구 (3)의 지질 이중층을 파괴하기 위해 사용한다. 540 nm의 주위 화학 나타낸다 높은 흡수에 의해 생성 된 시안 헤모글로빈; 따라서, [혈색소] 측정은 비색 분석을 통해 할 수있다. 이 방법은 널리 단순성 때문에 사용되지만 사용되는 화학 물질 (예, KCN 및 dimethyllaurylamine 산화물)은 인간과 환경에 독성이있다. 헤마토크릿 방식은 전체 혈액의 부피에 비하여 적혈구의 체적비를 측정원심 분리를 통해 매화; 그러나 비교적 큰 혈액량 (50-100 μL) (4)를 필요로한다. 측정법 방법의 측정은 [헤모글로빈] 정확히 어떤 화학 물질이없는,하지만 여러 파장과 큰 혈액량의 측정은 5,6 필요합니다. 유사하게, [헤모글로빈] 광학 측정을위한 여러 방법이 광 산란에 기초하여 검출 방법을 포함하는 제안되어 있지만, 그 측정 정밀도는 혈액 이론적 모델의 정확도에 강하게 의존한다.

이러한 한계를 극복하기 위해, 헤모글로빈의 광열 (PT) 효과에 기초하여 헤모글로빈] 검출 방법은 최근 7이 제안되어있다. 주로 산화철로 구성되어 혈색소는 532 nm에서 빛을 흡수하고 열 8-10로 빛 에너지를 변환합니다. 이 PT의 온도 상승은 혈액 시료의 굴절률 (RI)의 변화를 측정함으로써 광학적으로 검출 할 수있다. 임 등. 고용 스펙트럼 영역 빛 간섭 reflectometrY는 피 수용 실 (11) 내의 PT 광로 길이의 변화를 측정한다. 상기 방법은 무공해 직접 [헤모글로빈] 측정 가능하지만, 분광기의 사용과 간섭계 장치는 소형화를 저해 할 수있다. 최근 대안 [헤모글로빈] 검출 방법을 제시 장치 (12)의 소형화에 더 적합 광열 각도 광산란 (PT-AS) 센서를 불린다. PT-AS 센서 모세관 안에 혈액 샘플의 RI PT의 변화를 측정하는 백 산란 간섭계 (BSI)의 RI 높은 감도를 이용한다. BSI 다양한 솔루션 13-15의 RI를 측정하는 자유 용액 16 생화학 적 상호 작용을 모니터링하는 데 이용되어왔다. 태평양 표준시-AS 센서는 BSI와 같이 유사한 광학 장치를 사용하지만, 혈액 샘플에서 RI의 PT 증가를 측정하는 광열 여기 설정을 결합한 제품입니다. BSI에 상기 PT-AS 센서의 작동 원리는 다른 곳에서 상세하게 설명된다 12,15. PT-AS 센서는 넓은 감지 범위 (0.35-17.9 g / DL)을 통해 고감도 [혈색소] 측정을 입증하고 <100 NL의 샘플 볼륨으로 운영 할 수있다. 혈액 샘플의 어떤 전처리가 불필요하며, 측정 시간은 5 초 ~하다. 여기서, 실험 장치 상세한 측정 프로토콜이 설명된다. 주제 PT-AS 결과 빈혈 환자의 혈액 샘플을 이용하여 제공되고, 그 결과는 PT-AS 센서의 정확도를 평가하기 위하여 혈액 분석 장치에서 그와 비교된다.

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프로토콜

혈액 샘플 실험은 관련 법률 및 제도적 지침에 따라 수행 하였다. 샘플은 인수 기관에서 임상 시험에서 처리했다 잔류 혈액 샘플을했다.

1. PT-AS 광 설치

참고 : 하나는 초기 PT-AS 설정에 빈 마이크로 모세관 튜브를 사용할 수 있습니다.

  1. 각각 200 및 330 μm의의 내부 및 외부 직경을 갖는 빈 마이크로 모세관 튜브 및 모세관 고정구에 큰 ~ 5 cm 이상의 길이를 탑재. 시판 섬유 일정 튜브 치구로서 사용할 수있다.
  2. 안전하게 모세관을 조명하는 광원을 조사, 즉, 650 nm의 레이저 포인터를 고정. 프로브 빔이 모세관보다 커야한다. 각도주기적인 패턴을 관찰하는 모세관 뒤에 화면 (예 : 흰색 종이)를 놓습니다.
  3. 검출부를 들어, 직접 scatt 캡처 웹캠 어떠한 렌즈를 제거패턴를 끄기. 프로브 빔 방향에 대해 25 ~ 35 °의 각도에서 모세관 뒤에 웹캠 배치. 모세관에 의해 생성 된 각주기 패턴 검출기 (도 1)에 의해 측정 될 수 있음을 보장한다. 이미지 센서가 위치 될 때, 이미지 센서의 중간 각도주기 패턴을 관찰한다.
  4. 모세관을 조명 할 수있는 532 나노 PT의 여기 광원을 배치합니다. 만큼 PT 여기 광이 모세관 튜브 프로브 빔과 중첩 직접 검출기에 도달하지 않는 한, 임의의 각도로 PT 광원을 배치. 는 RI에 큰 변화를 초래으로 일반적으로 높은 광 출력을 이용하여 혈액 샘플의 PT 여기는 PT-AS 감도를 향상시킨다.
    1. 채용 된 PT 여기 광원에 가장 높은 광 출력을 사용한다. 또한, PT 여기 광이 모세관에 탐침 광을 중첩되도록. 태평양 표준시 여기 광의 빔의 크기를 사용하여배 이상의 광 프로브의 전체 프로브 체적을 가열.
  5. 532 nm의 광을 차단하고 단지 650 nm의 프로브 광을 측정하는 검출기 앞에 긴 패스 필터를 배치했다.
  6. 모세관을 조사하기 전에 PT 여기 광의 경로에 광 초퍼를 설치한다. 광 초퍼는 PT의 여기 광 강도를 변조하는데 사용된다.

2. 혈액 샘플 준비

  1. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 혈액 샘플링 튜브에 빈혈 상태에 신선한 전혈 6 ml의 그리기, 잘 샘플을 섞는다. 다른 처리가 필요하지 않습니다.
  2. 혈액 응고를 방지하는 추출 24 시간 안에 PT-AS 센서를 이용하여 혈액 시료를 측정한다.

3. PT-AS 측정 프로토콜

  1. 측정하기위한 혈액 샘플을 마이크로 모세관을로드. 혈액의 튜브에 배치하여 모세관 작용을 통해 혈액 모세관 채우기충분한. 측정에 필요한 최소 샘플 량은 모세관의 내경 및 프로브 빔의 크기에 의해 결정된다.
    1. 200 μm의 내경을 가진 튜브를 이용한다. 프로브 빔 사이즈 측정이> 63 NL 샘플 부피로 수행 될 수 있음을 시사 대표적인 결과 2 mm였다.
  2. 고정구에있는 지정된 위치에있는 모세관 튜브를 탑재합니다.
  3. 혈액이 장착 된 마이크로 모세관 튜브를 조명하기 위해 650 나노 프로브 레이저를 켭니다. 각도주기적인 패턴은 웹캠으로 관찰해야한다.
  4. 튜브를 조명하기 위해 532 나노 PT 여기 레이저를 켭니다.
  5. 2 Hz에서의 PT 여기 광의 강도를 변조하는 광 초퍼를 실행.
    주 :이 운전 조건의 선택을위한 이론적 근거는 토론 및 Kim 등으로 설명된다. 12.
    1. 광 초퍼 모터 헤드 어셈블리 초퍼 휠 장착체계.
    2. 헬기 컨트롤 박스의 전원을 켜고 변조 주파수를 설정 콘솔의 컨트롤 노브를 사용합니다.
    3. 컨트롤 노브를 사용하여 헬기를 실행합니다.
  6. MPEG-4 (MP4) 형식으로 5 초 동안 웹캠을 통해 변동 산란 패턴을 기록합니다.

4. 신호 처리

주 : PT-AS 신호 처리 실험실 개발 MATLAB 코드를 사용하여 수행 하였다.

  1. 이미지를 추출 할 동영상 파일을로드합니다. 각 화상의 세로 방향의 화소 값의 평균을 계산하여 평균 산란 패턴을 얻었다 [대표 이미지도 2 (a)를 참조]도 2 (b, c)].
  2. 푸리에 평균 산란 패턴의 변형 평가하고 최고 공간 주파수에서의 위상을 계산한다. 모든 녹화 된 영상의 모든 프레임에 대해 이러한 작업을 수행합니다.
  3. 모든 이미지로부터 획득 된 위상 값을 이용하여, 시간 상 플롯변동 [그림 2의 (d)]. 위상이 PT 변조 주파수 변동합니다. 푸리에 변조 주파수의 크기를 시간 영역에서의 위상 변동 변환 및 수득보십시오. 이 신호는 PT-AS 신호라고한다 [도 2의 (e)].
  4. 내로의 PT-AS 신호를 전환하여 혈액 샘플의 [헤모글로빈]을 측정 프로토콜 (5)에서 얻어진 검량선을 이용하여 헤모글로빈] 대응.

5. PT-AS 교정

  1. (- 18g / DL 예컨대, 0)의 Hb] 균일 PT-AS 센서의 검출 범위에 분포 값을 갖는, 혈액 샘플을 준비한다.
  2. 보정 전, 기준 혈액 분석기를 사용하여 샘플의 [헤모글로빈] 값을 정량화. 샘플의 PT-AS 신호를 측정한다.
  3. experimenta의 교정 최소 제곱 적합 선형를 수행하여 PT-AS 신호 [헤모글로빈] 관련 곡선 [헤모글로빈] = A [PT-AS 신호] + B를 도출리터 결과. 표 1에 규정 된 작동 조건 [헤모글로빈] 및 PT-AS 신호 사이의 관계는 [헤모글로빈]였다 = 5.13 [PT-AS 신호] - 0.09. 선형 피팅을 수행하기 위해 MATLAB 코드를 사용합니다.

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결과

헤모글로빈 분석은 PT-AS 센서를 이용하여 수행하였고, 그 측정은 혈액 분석 장치에서 비교 하였다. 실험은 1.4 W / cm 2 초, 5, PT 변조 2 Hz의 주파수 및 측정 시간 PT 여기 광 강도로 하였다. 표 1은 실험 조건을 요약한다. 프로브 및 PT 여기 광의 빔의 크기는 각각 5.5 및 2mm이었다. 웹캠 30 fps의 프레임 율로 이미지를 기록했다. 측정을 위해, 세 가지의 Hb 농도 빈혈 혈액 샘플을 사용 하였다. PT-AS 측정 전에 샘플 [헤모글로빈] 값은 제 5.3, 7.5 및 9.9 g / 혈액학 분석기로 하향으로 측정 하였다.

도 3 (a) 상기 변조 된 광 PT 조명하 각도 산란 패턴을 나타내는 경과 위상 변동을 나타낸다. 일정보 푸리에 각도 산란 패...

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토론

PT-AS 센서는 처리되지 않은 혈액 샘플을 직접 [헤모글로빈] 측정 할 수있는 모든 광학 방법을 나타낸다. 상기 방법은 적혈구의 헤모글로빈 분자의 고유 PT 응답하여 혈중 [헤모글로빈] 정량화한다. 532 nm의 빛에 의해 조명 아래에서, 헤모글로빈 분자는 빛 에너지를 흡수하고 열을 생산하고 있습니다. 얻어진 온도 상승은 혈액 샘플의 RI를 변화시킨다. BSI의 높은 RI 감도는 혈액에서이 RI의 변화를 측정하기 위해 이용되었다. 이전에, 우리는 PT-AS 센서 시장에서 상업적 [헤모글로빈] 센서들의 것과 비교할 0.35-17.9 g / DL의 범위에 걸쳐 0.12 g / DL의 검출 한도 [헤모글로빈] 측정 할 수 있음을 보여 주었다.

PT-AS 센서의 주목할만한 특징은 혈액 또는 화학 중 전처리를 필요로하지 않는다는 것이다. 따라서, 센서가 직접 급속한 (<5 초), 친환경 측정을 가능하게한다. 샘플 계속 같은 유리 기반 마이크로 모세관 튜브의 사용ainer은 낮은...

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공개 사항

이해 상충은 선언되지 않습니다.

감사의 글

본 연구는 한국연구재단(NRF) 연구 프로그램(NRF-2015R1A1A1A05001548 및 NRF-2015R1A5A1037668)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
650 nm 레이저 포인터LASMACLED-1프로브 라이트
중공 원형 유리 모세관VitroComCV2033혈액 샘플 용기
웹캠LogitechC525CMOS 광학 센서
광학 초퍼 시스템ThorlabsMC2000-EC광학 초퍼
플라스틱 장역 통과 필터Edmund Optics#43-942532nm PT 여기 광을 거부하려면
광섬유 클램프ThorlabsSM1F1-250모세관 고정 장치
EDTA 코팅 혈액 샘플링 튜브Greiner Bio-OneVACUETTE 454217혈액 샘플링 및 항응고
혈액Siemens AGADVIA 2120i참조 혈액학 분석기
분석기

참고문헌

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