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방법 논문

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

20.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55015

⸱

2016년 12월 30일

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 재생 가능한 생성 유도 인간 T 조절 세포 (iTregs)의 표현형을 설명한다. Foxp3의 유도를위한 다른 프로토콜은 각각의 프로토콜로 얻은 특정 iTreg의 표현형 연구를 허용합니다.

초록

조절 T 세포(Tregs)는 말초 내성의 필수적인 부분으로, 자기 구조에 대한 면역 반응을 억제하여 자가면역 질환을 예방합니다. Tregs를 양자로 옮기거나 암에서 Tregs를 고갈시키는 임상 접근법이 진행 중이며 유망한 첫 번째 결과가 있습니다.

자연적으로 발생하는 Tregs(nTregs)의 수가 매우 제한되어 있기 때문에 in vitro induced Tregs(iTregs)를 사용하여 특정 Treg 기능을 연구하는 것이 유리할 수 있습니다. 현재까지 Tregs를 설명하는 절대적으로 특이적이지는 않지만 가장 좋은 단백질 마커는 전사 인자 FOXP3입니다. 말초적으로 유도된 Tregs의 중복되지 않는 역할을 포함한 Tregs의 중요성에도 불구하고 iTregs를 생성하는 프로토콜은 현재 특히 인간 세포에 대해 논란의 여지가 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 다양한 Treg 유도 인자(TGF-β와 IL-2만 또는 레티노산, 라파마이신 또는 부티레이트와의 조합)를 병렬적으로 사용하여 인간 미접촉 T 세포에서 인간 CD4+FOXP3+ iTregs의 체외 분화를 설명합니다. 또한 유세포 분석 및 qRT-PCR에 의한 이러한 세포의 표현형에 대해 설명합니다.

이러한 프로토콜은 FOXP3 및 기타 Treg 시그니처 유전자의 재현 가능한 발현을 초래하고 일반적인 FOXP3 조절 메커니즘 및 프로토콜 특이적 효과를 연구하여 특정 요인의 영향을 설명할 수 있도록 합니다. iTregs는 Treg 유도의 분자 메커니즘뿐만 아니라 다양한 표현형 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 상세한 분자 연구는 얻을 수 있는 비교적 큰 세포 수에 의해 촉진됩니다.

iTregs의 적용에 대한 한계는 nTregs에 비해 이러한 세포에서 FOXP3 발현의 상대적 불안정성입니다. 이러한 프로토콜에 의해 생성된 iTregs는 TGF-β와 레티노산 및 라파마이신에 의해 유도된 iTregs가 우수한 억제 활성을 나타내는 억제 기능 연구와 같은 기능적 분석에도 사용할 수 있습니다. 그러나 iTregs의 억제 능력은 nTregs와 다를 수 있으며 적절한 제어의 사용이 중요합니다.

서론

CD4 + CD25 + + Foxp3를 조절 T 세포 (Tregs)는 다른 면역 세포를 억제 말초 관용의 중요한 매개체 방지자가 면역 과도한 염증 일이다. Tregs의 중요성은, 중증 전신성자가 면역 질환에 이르게하는 Tregs의 손실로 인해`master' TREG 전사 인자 forkhead 상자 P3의 돌연변이로 인간의 질병 immunodysregulation의 polyendocrinopathy의 병증의 X 연결된 증후군 (IPEX), (Foxp3를)을들 수있다 어린 나이에 치명적. 그러나 Tregs는 또한 특정 설정이있는 항 종양 면역을 방해 할 수있는 면역 체계의 양날의 검으로 작용한다. TREG 번호와 기능의 치료 조작은 수많은 임상 연구에 따라서 달라질 수 있습니다. 암에서 Tregs의 고갈은 바람직 할 수 있으며, 임상 적 접근 방법의 일부 성공은 추가 연구 (3)를 권장합니다. 세비에서 Tregs의 치료 효과뿐만 아니라자가 면역 및 염증 질환에RAL 마우스 질병 모델, 입양 TREG 전송의 최근 처음에 남자 임상 시험 그라프 대 -host 질환 (GVHD) 4 방지 - 7 매우 유망한 결과를 보여 주었다 제 1 형 당뇨병 (8) 치료에 안전성을 평가하기 위해.

11 - 자연 Tregs (nTregs가) 건강 (9)을 유지하는 비 중복 필수 기능과 흉선 유래 tTregs 및 주변으로 유도 pTregs를 포함 발생. 그러나 nTreg 번호는 순진한 T 세포 전구체 (12)으로부터 체외에서 유도 Tregs (iTregs)의 보완적인 접근 방식을 장려, 제한됩니다. 아마도 인해 Foxp3의 유전자 좌위 (13)의 소위 TREG 별 탈 메틸화 지역 (TSDR)에서 탈 메틸화 부족 iTregs의 또 안정성, 우려 남아 있고 여러 연구는 Tregs 유도 생체 내에서 14 더 안정되어 있음을 나타냅니다.

지금까지 Foxp3의 최고의 단백질 m 남아인간 기존의 CD4 + CD25- T 세포가 일시적으로 활성화 (15, 16)에 Foxp3의 중간 수준을 표현하기 때문에 Tregs에 대한 arker하지만 그것은 절대적으로 특정하지 않습니다. 상당한 진전은 Foxp3를 발현 조절되는지 설명 하였지만, 더 특히 인간 세포에서의 유도 Foxp3의 안정성 및 기능에 대하여 발견되고 유지된다. nTregs에 차이에도 불구하고, 시험 관내에서 Foxp3를 유도 + CD4 + T 세포는 Foxp3를 유도 분자 메커니즘을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용할 수있는 더 유사한 iTregs의 생성을 허용 장래 프로토콜을 개발하는 시작점 미래의 입양 전송 전략에 적용 할 수있는 생성 Tregs를 생체.

거기에 인간 iTregs 유도 할`금 standard' 프로토콜은없고, 현재 프로토콜 생체 TREG 유도 조건을 모방에 기초하여 개발되었다 : 2 (IL-2 인터루킨) 및 변형 성장 인자 β (TGF-β) 시그널링은 생체 17 Foxp3의 유도에 매우 중요하고, 올 - 트랜스 레티노 산 (ATRA) - 창자 연관된 수지상 세포에 의해 생체 내에서 생성되는 - 자주 Foxp3의 유도를 향상시키는 데 사용된다 21-18을 체외있다. 우리는 부티레이트 (22), 최근에 쥐 TREG 유도 (23, 24)을 증가시키기 위해 도시 된 장내 미생물 유래 단쇄 지방산을 사용하여 추가 인간 TREG 유도 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 최근 그을 촉진하는 것으로 알려져 억제제 후자는 라파 마이신 (mTOR의)의 임상 적으로 승인 된 포유류 대상인, TGF-β, ATRA의 조합을 사용하여, 22 라파 마이신에 의해 시험관 내에서 우수한 억제 기능 iTregs의 생성을위한 새로운 프로토콜을 확립 인간의 TREG 확장 25, 26시 Foxp3의 유지 보수.

이 방법의 재현성을 설명합니다인간 CD4 + Foxp3의 + 상이한 조건들의 세트를 이용 iTregs 및 유세포 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 그 이후의 표현형의 체외 세대 (QRT-PCR)은 Foxp3를 발현하고, 다른 TREG 서명 분자 등을의 프로토콜 별 무늬를 공개 CD25, CTLA-4, EOS뿐만 아니라, IFN-γ 및 SATB1 식 (22)의 억압 등. 생성 된 세포 집단은 일반적 Foxp3의 규제에 관한 또는 부티르산 또는 라파 마이신과 같은 특정 화합물은 특정 효과를 연구하거나, 억제 활성에 대한 기능 분석을 위해 또는 분자 연구에 사용될 수있다. TREG 차별화를 운전하는 분자 메커니즘의 추가 이해는 특히 TREG 생성과 기능에 관여하는 분자를 대상으로자가 면역 암에서 미래의 치료 접근에 매우 관련이있다.

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프로토콜

인간의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)은 갓 카롤린스카 대학 병원, 스웨덴에서 구입 한 익명 처리 건강한 기증자 버피 코트에서 고립되었다. 실험에 대한 윤리 허가가 스톡홀름의 국가 윤리 심의위원회 (Regionala etikprövningsnämnden 내가 스톡홀름)로부터 얻은 스웨덴 (승인 번호 : 2013 / 1,458에서 31 사이 / 1).

말초 혈액에서 1. T 세포 분리

  1. PBMC 분리
    1. 15 ml의 밀도 원심 분리 배지 50 ㎖ 튜브 (버피 코트 당 5 관)에서 (예 : 피콜 등) 솔루션을 사전 배치합니다. 실온에 미리 따뜻한.
    2. 180 ml의에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) (실온)과 버피 코트를 입력합니다. 신선한 혈액을 사용하는 경우의 PBS 동량 혈액 희석.
    3. 와 측면 천천히 오버레이 밀도 원심 분리 매체 ~ 튜브 당 혈액을 희석하여 35 ml의에 기울기 튜브. 의대 밀도 원심 분리의 혼합없이, 매우 신중하게 피를 추가IUM 상 및 혈액 층.
    4. 브레이크없이 상온에서 1,150 XG에 원심 분리기 20 분. 브레이크없이 원심 분리기를 작동 매체 가속을 둘러과 가능하면 레이어의 혼합을 방지하기 위해.
    5. 밀도 원심 매체 플라즈마 상간 PBMC를 함유 흰색 환을 꺼내. (2 ml의 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 1 시간에 5 ml를 피펫과 2 번) 새로운 50 ML 튜브로 전송합니다. 가능한 플라즈마 밀도 원심 분리 매체로 조금 가라. 붉은 적혈구 펠렛을 만지지 마십시오.
    6. 워시 PBMC를. 50 ㎖ 튜브 (버피 코트 당 4 튜브)에 PBMC를 분할합니다. PBS와 50ml로 각각 입력합니다.
    7. 실온에서 10 분 동안 원심 분리기 (450) XG.
    8. 제거하고 상청액을 버리고, 10 mL의 1 튜브 RPMI / 10 % 소 태아 혈청 (FCS) 배지를 세포를 풀링하고 잘 재현 탁. 세포 덩어리는 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 현재, 변형 세포는 경우.
    9. 광고 T175 세포 배양 플라스크에서 세포를 이동내재 세포. (50 ㎖ 전체) 40 ml의 매체와 튜브를 씻어 세포와 결합한다. 필요한 경우 (1.4 단계 참조) 분석 유동 세포 계측법에 대한 나누어지는을 제거합니다. 일반적으로, CD4 + T 세포는 림프구 게이트 셀의 30-40 %를 포함하고, 나이브 T 세포는 도너에 따라서 CD4 + T 세포의 약 30 내지 60 %를 포함한다.
    10. 37 ° C / 5 % CO 2에서 45 분 90에 대한 플라스크에 누워 세포를 품어. 이 단계는 플라스틱 준수하여 단핵 세포를 고갈됩니다. 이는 필수적인 것은 아니지만 다음 단계 PBMC를 양 당 비율 T 세포의 수율을 증가시킬 것이다.
    11. 재현 탁 된 세포 (50 ㎖ 중의 중간 플라스크에 포함) 및 웰 플라스크의 바닥에 전지 층을 헹군다. 마찬가지로 두 개의 50 ㎖ 튜브에 세포를 분배 (이전 튜브 같은 도너 위해 재사용 될 수있다). 50 ml의 신선한 RPMI / 10 % FCS 배지로 플라스크를 씻어과 같은 2 튜브에 동일하게 전송합니다.
      참고 : PBMC를이 관에 누워 4 ° C에서 하룻밤 저장 될 수있다사이드가 이상적이나, 직접 T 세포의 분리를 위해 사용된다.
  2. 마그네틱 활성화 셀 정렬에 의해 nTreg 격리
    1. 차단 완충액을 준비 : 0.5 % (W / V) 인간 혈청 알부민 및 PBS 2 mM의 EDTA. 항상 4 ℃에서 버퍼를 유지합니다. 또는 인간 알부민, 소 알부민을 사용합니다.
    2. 재현 탁과 트리 판 블루의 존재에 자동 또는 수동 셀 카운터 PBMC를 계산 (작은 혈소판에 포함되지 않습니다). 세포 덩어리가 관찰되는 경우, 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 변형 세포.
    3. 실온에서 10 분 동안 450 × g으로 원심 분리 한 PBMC.
    4. 재현 탁 된 세포를 107 PBMC를 당 90 μl의 차단 완충액 (1 ml를 피펫으로) 단일 세포 현탁액을 얻었다. 원래 50 ㎖ 튜브 (버피 코트 당 2 관)에서 세포를 유지합니다.
    5. 10 7 세포 당 2 μL의 CD25 구슬을 추가 혼합, 4 ℃에서 15 분 동안 품어.
    6. 30 ml의 PBS로 채 웁니다. 4에서 10 분 동안 450 XG에 원심 분리기6; C.
    7. 3 ㎖ 분리 버퍼 평형과 흐름을 통해 폐기 : LS 열 (버피 코트 당 2) 준비합니다. 튜브는 더 열을 씻어 다시 사용할 수 있습니다.
    8. 튜브 당 3 ㎖ 분리 버퍼에 재현 탁 세포 (1 ML의 피펫과). 전송 세포는 열을 LS, 신선한 15 ml의 튜브를 통해 흐름을 수집합니다.
    9. 2 ml의 분리와 50 ㎖ 튜브 각 버퍼 씻어. 열에 버퍼를 세척 전송.
    10. 3 ㎖ 격리 씻을 열 배는 각각의 버퍼. 열이 새로운 액체를 추가하기 전에, 떨어지는 중지 될 때까지 항상 기다립니다. 상점은 이후 단계 4 ° C에서 통해 흐른다.
    11. 자석에서 열을 제거합니다. 15 ML 튜브에 열 당 3 ㎖ 분리 버퍼 용출 배.
      주 : 도너 당 2 열의 용출액은 결합 될 수있다. 액체에 열을 찍어하지 마십시오.
    12. 준비하고 새로운 LS 열 (버피 코트 당 1 열) 평형. 열에 1.2.11에서 용출액을 전송합니다. 폐기 할 수 있습니다 통해 흐름. 용출액 패스포트를 가지고 후칼럼을 통해 D, 튜브를 씻어 3 ㎖ 절연 버퍼 열 배 씻는다.
      참고 : 두 번째 열은 결정적으로 순도를 증가시키기 위해 필요하다.
    13. 자석에서 열을 제거합니다. 3 ㎖ 격리 버퍼 용출 CD25 ++ "nTregs"배.
    14. 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 제거합니다.
    15. 4 ° C에서 10 분 동안 450 XG에 15 ml의 T 세포 배양 배지, 원심 분리기와 세포를 씻으십시오. 완전히 뜨는을 제거합니다.
    16. 100 IU / ml의 IL-2를 각각 보충 된 0.5 ㎖의 T 세포 배양 배지에 재현 탁 된 세포. 24 웰 플레이트로 전송 세포. 0.5 ml의 매체와 린스 튜브 (+ 100 IU / ㎖의 IL-2) 24 웰 플레이트에 결합한다.
    17. (단계 1.2.2에서와 같이) nTregs를 계산합니다. 수율은 일반적으로 버피 코트 당 약 1-4 × 10 6 Tregs입니다. T 세포 배양 배지 + 100 IU / ml의 IL-2와 1-2 × 106 세포 / ml로 Tregs의 농도를 조정.
    18. 37 ° C / 5 % CO 2를 사용까지에서 Tregs를 품어.
  3. 마그네틱 활성화 셀 정렬하여 순진한 CD4 + T 세포 분리
    참고 : 세포 분리를 진행하는 단계 1.2.8-1.2.10에서를 통해 흐름을 가져 가라. 더 nTregs가 분리되어 있지 않은 경우, 또는, PBMC를 직접 진행합니다.
    1. 50 ㎖ 튜브에 TREG가 고갈 된 PBMC를의 기증자 당 2 개의 튜브를 결합합니다. 실온에서 50 ml의 PBS로 채 웁니다.
    2. 실온에서 5 ~ 10 분 동안 200 XG에 원심 분리기 PBMC를. 제거하고 상층 액을 버린다. 50 ml의 PBS에 재현 탁 세포.
    3. 단계를 반복 1.3.2 두 번.
      주 : PBS 세척 다음과 같은 음의 분리 키트와 함께 제거되지 않습니다 혈소판의 제거를 위해 중요하다. 혈소판이 저속 원심 분리로 상청액에 남아있다. 혈소판 결핍은 현미경 슬라이드의 각 단계에서 모니터링 될 수있다. 절차는, 실온에서 PBS와 회 원심 수행되어야한다.
    4. 50 ml의 PBS에 재현 탁 PBMC를. 단계 1.2.2에서와 같이 세포를 계산합니다.
    5. 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에 원심 분리기 PBMC를. 10 7 세포 당 40 μl를 분리 버퍼 (4 ° C)에서 상층 액과에 resuspend 세포를 폐기하십시오.
    6. 10 7 세포 당 나이브 CD4 + T 세포 비오틴 - 항체 칵테일 II의 10 μl를 추가합니다.
    7. 믹스, 4 ℃에서 10 분 동안 품어.
    8. 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에 40 ml의 PBS (4 ° C)를 추가하고 원심 분리하여 세포를 씻으십시오. 10 7 세포 당 80 μl를 분리 버퍼에 뜨는 및에 resuspend 세포를 제거합니다.
    9. 10 7 세포 당 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 잘 혼합, 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
    10. 차가운 PBS와 50ml로 작성하고, 원심 분리기 450 XG에 4 ℃에서 10 분 동안.
    11. LS 열 (3 ml의 분리 버퍼 평형) 준비합니다. 열 과부하를 방지 PBMC를 많은 적혈구가 포함 된 경우 최대로 250 × 106 PBMC를, 이하에 대해 하나의 열을 사용합니다.
    12. 상층 액과에 resuspend C를 제거3 ㎖ 분리 버퍼의 ELL. LS 열 세포를 전송합니다. 15 ml의 튜브에서 순진한 CD4 + T 세포를 포함 통해 흐름을, 수집합니다.
    13. 2 ml의 분리 버퍼 튜브를 씻어. 컬럼에 전송합니다.
    14. 3 ㎖ 분리 버퍼 씻을 열 배. 열이 새로운 액체를 추가하기 전에, 떨어지는 멈출 때까지 항상 기다립니다.
    15. 4 °의 C에서 (순진한 CD4 + T 세포)을 통해 흐름과 원심 분리기 450 XG에 10 분 가져 가라. 열은 폐기 될 수있다.
    16. 완전히 뜨는을 제거합니다. 실온에서 15 ml의 매체, 원심 분리기 450 XG에 10 분으로 세포를 세척하고 완전히 뜨는을 제거합니다.
      주 : 격리 버퍼가 칼슘 이온을 킬레이트 EDTA를 포함하고, 따라서 T 세포 활성화를 저해. 어떤 자극 분석하기 전에 완전히 절연 버퍼를 제거하고 15 ml의 매체로 두 번 세포를 씻으십시오.
    17. 용액 2-3 × 106 세포로 T 세포 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 해당 플라스크 오의 나머지 세포R 잘 인큐베이터에서 하룻밤. 세포 자극 분석법에 직접 사용하는 경우 그들 배지로 한번 더 세척 하였다.
  4. 순도 제어 염색
    1. 20 μL에서, 각 ~ 50,000 세포 (PBMC를; nTreg Tnaïve)를 가져 가라.
      참고 : Tnaïve 및 nTreg 패널 모두 염색 할 경우,이 샘플 각을.
    2. 예를 들어, 악기에 맞게 2 배 농축 항체 프리믹스를 (PBS)에서 준비 : Tnaïve 패널 : CD4-를 PerCP 1 : 5; CD45RA-FITC 1:10 CD45RO-PE 1 : 5, CD8-eFlour450 1 : 8. TREG 패널의 경우, CD25-PE 1:10으로 CD45RO-PE를 교체합니다.
      참고 : CD25 - 마이크로 비드 다른 에피토프를 인식 만 특정 CD25 항체는 CD25 마이크로 비드와 격리 nTregs을 염색하는 데 사용할 수 있습니다.
    3. 20 μl의 세포에 20 ㎕의 항체 프리믹스를 추가합니다. 또한 settin 유세포, 각각의 형광 색소 (예를 들면, 양성 세포를 함유 한 PBMC 시료를 사용) 및 흠 샘플 하나의 염색을 준비GS 및 보상.
    4. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
    5. 200 μl의 PBS와 각 샘플을 입력하고 5 ~ 10 분 동안 원심 분리기 450 XG.
    6. 정렬 형광 활성 셀 (FACS) 버퍼 (= 분리 버퍼 EDTA 제외)에서 세포를 가지고 유동 세포 계측법에 의해 분석한다. 나이브 CD4 + T 세포의 순도는 일반적으로> 95 %이다 (도 2 참조).

2. TREG 유도 문화

  1. 자극 미디어 및 플레이트의 제조
    1. 준비하고 미리 따뜻한 T 세포 배양 배지를 혈청이없는 배지 조혈 2 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민.
    2. 사이토 카인, 자극 항체 및 화합물 재고 농도를 준비합니다.
      1. IL-2 주식 솔루션을 준비 : 400,000 IU / ml의 멸균 여과 (부식 방지 필터) 100 mM의 아세트산 (167 ㎍ / ㎖의 사용 된 로트의 활동이 1 μg의 당 2,400 IU 경우, 공급자와 확인). 0.5 ml의 튜브를 결합 멸균 낮은 단백질로 나누어은 파라 필름으로 밀봉 장기 저장을 위해 -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소의 동결 또는 -20 최대 3 개월 동안 C °.
      2. (10 μg의 유리 병, 캐리어 무료) TGF-β1 주식 솔루션을 준비 : 원심 분리기 TGF-β1 분말 (1,000 XG에 3 분) 4 mM의 HCl을 100 μl를 추가 원액을 제조 (부식 방지 필터로 멸균 여과) 100 μg의 / ㎖에 완전히 용해 할 수; 와동. 0.5 ml의 튜브를 결합 멸균 저 단백질에 각각 나누어지는 5 μL는, 파라 필름으로 밀봉 최대 6 개월 동안 -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소의 동결.
      3. ATRA 주식 솔루션을 준비 : DMSO 20 밀리그램 / ㎖ (66.6 밀리미터)에서 분말을 녹여. 최대 1 년 동안 -80 ° C에서 빛으로부터 보호 DMSO 저장 분취 액에 추가로 희석, 10 mm의 재고 솔루션을 준비합니다. ATRA는 빛, 열, 공기에 민감합니다.
      4. 라파 마이신 주식 솔루션을 준비 : 분취 액을 1 ㎎ / ㎖ (1.11 mM)을 DMSO에 저장을위한 -80 ° C에서1 년입니다.
      5. 나트륨 부티레이트 주식 솔루션을 준비 : 0.908 M (0.1 ㎎ / ㎖) 주식을 멸균 울트라 순수한 H 2 O 및 살균 필터. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
    3. 표 1에서와 같이 T 세포 배양 배지에 4X 농축 프리믹스 (웰 당 50 μL)을 준비한다.
    4. 이전 날, 항 CD3 항체와 코트 플레이트. 코트 원하는 PBS에서 / ㎖의 항 CD3 항체 5 μg의 65 μl를 96 U 웰 플레이트에서 웰의 수 / 웰. 호일로 접시를 싸서 4 ℃에서 하룻밤 배양한다.
      참고 : 96 웰 플레이트의 마진 우물을 사용하지 마십시오. 큰 우물이 사용될 수 있지만, U 자형 웰 실험 전반 면적당 동일한 세포 수의 사용을 용이하게한다. 이상의 셀이 필요한 경우, 배양 후 웰의 요구량을 풀. 보통, 팽창 4-6 일 후, 웰이 각각의 샘플은 유동 세포 계측법 분석 RNA 분석을 위해 충분하다.
      1. 도금의 날, 곧 도금하기 전에, 안티 제거우물에서 -CD3 솔루션입니다. 잘 200 μL / PBS로 우물을 입력합니다. PBS를 제거합니다. 200 μL / 잘 PBS로 세척을 반복합니다. 완전히 PBS를 제거하고 즉시 번호판을 사용합니다.
    5. 플레이트 (마진 우물을 사용하지 않는) 준비 :
      1. 각 웰 4X 항 CD28 / IL-2 프리믹스의 50 μL를 추가하는 경우 (모든 iTregs 위해), 50 ㎕의 4X TGF-β1의 프리믹스 50 μL T 세포 배양 ( "비자극"셀 제외한 T 세포 배양 배지를 추가) "자극 만"모의 제어를위한 매체, 50 μL는 ATRA, ATRA / 라파 마이신 또는 부티레이트 프리믹스 (해당되는 경우) 또는 중간 4 배
      2. 200 ㎕의 PBS로, 여백 우물을 포함, 모든 빈 우물을 입력합니다. 37 ° C / 5 % CO 2에서 사전 따뜻한 접시.
  2. 도금에 대한 나이브 T 세포를 준비
    1. 세포를 휴식 한 후, 15 ML 튜브로 전송 튜브에 미리 예열 T 세포 배양 매체와 풀과 플라스크 / 우물을 씻어. T 세포 배양 배지 15 ml의 튜브를 입력합니다.
    2. 실온에서 10 분 동안 450 × g으로 원심 분리 세포.
    3. 배지를 제거하고 2.2-2.6 × 106 / ㎖의 밀도로 신선한 미리 예열 T 세포 배양 배지에서 세포를 차지한다. 단계 1.2.2에서와 같이 세포를 계산하고 필요한 경우 밀도를 조정합니다.
    4. (2.1 참조), 50 ㎕의 세포 / 웰 (110,000-130,000 세포 / 웰) 준비를 자극 판에 셀을 추가합니다. 각각의 잘 이제 200 μL의 총 볼륨을 포함해야합니다.
    5. 빛 ATRA를 보호하기 위해 알루미늄 호일 접시를 감싸 라 원하는 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO 2에서 배양한다.
  3. TREG 유도 문화 모니터
    1. 광학 현미경 (40X 배율)에 의해 TREG 문화를 모니터링합니다. 약 2 일 내지 3, 증식하는 세포의 작은 클러스터 나중 시점에서 더 큰 클러스터에 합류하는 표시 될 것이다. 라파 마이신 함께 성장 문화는 일반적으로 덜 성장합니다. 또한도 3을 참조하십시오.
    2. 소정 시점에서, RNA 전자 용 샘플을 채취xtraction 또는 표현형 유동 세포 계측법 (아래 참조). 잘 세포 증식, 1 나중에 포인트를 각각 충분하다, 그렇지 않으면 유동 세포 계측법 1 × 10 5 -1 × 10 6 RNA에 대한 세포 각각 3 × 10 5 -1 × 10 6 세포를 가져 가라.
  4. Foxp3의 안정성 평가
    1. 이전 22,27 바와 같이 iTreg 표현형의 안정성을 평가하기 위해, T 세포 배양 배지로 두번 iTregs 세척하고, 또한 T 세포 배양 배지에서 배양 iTregs 하나없이 또는 2.1 및 2.2에 기술 된 바와 같이 항 CD3, 항 CD28의 restimulation와 . 사이토 카인을 추가, 같은 50 IU / ㎖의 IL-2, Foxp3의 안정성에 미치는 영향을 연구합니다.
    2. 소정 시점에서, (22,28)을 기술 된 바와 같이 (아래 참조) 표현형 유동 세포 계측법 및 TSDR 메틸화 분석 RNA 추출을 위해 샘플을 채취.

QRT-PCR에 의한 iTregs 3. 표현형 분석

  1. 의 제조견본
    1. 소정 시점에서, RNA 추출을 위해 샘플 당 1 × 105 1 × 106 개의 세포를 가라. 5 분 500 XG에서의 RNase가없는 1.5 ML 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다.
    2. 필요한 경우, 상층 액의 일부를 제거하고, 효소 면역 분석법 (ELISA) 또는 유사한 분석을 위해 동결. 세포에서 완전히 뜨는 나머지 제거합니다. RNA 추출에 직접 진행 또는 최대 2 주 동안 -80 ° C에 -20 ° C에서 드라이 아이스와 저장소의 세포 펠렛을 동결.
    3. 표준 프로토콜에 따라 RNA를 추출하고 Foxp3를 (예 : RPL13A 등) 하우스 키핑 유전자 QRT-PCR을 수행합니다. 또한, 다른 TREG 서명 유전자의 발현을 측정 (예를 들어`TREG up' 유전자 IL2RA, CTLA4, IKZF4, 그리고`TREG down' 유전자 IFNG, SATB1).

유동 세포 계측법 4. 표현형 분석

참고 :이 프로토콜은 얼룩에 최적화되어 있습니다(3) -1 × 105 × 106 세포를 96U 웰 플레이트 형식으로 보내고. 웰 당 더 적은 세포가있는 경우 후술하는 바와 같이, 몇몇 풀 웰과 함께 시작한다.

  1. 셀 Restimulation (선택 사항)
    1. 세포 내 사이토 카인 염색에 대한 원하는 경우, 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)와 펄스 세포 / 단백질 수송 저해제의 존재 하에서 이오 노마 이신.
      주 :이 절차는 상술 iTreg 배양 Foxp3의 발현에 영향을주지 않지만, 다른 마커 변경할 수 - 예를 들어, CD4가 하향 조절된다.
    2. 원액을 Brefeldin 1 : T 세포 배양 배지에서 10 배 Brefeldin A / PMA / 이오 노마 이신 프리믹스 (물론 당 20 μl를) 준비 (100), 이오 노마 이신 (주 5 μg의 / μL) 1 : 1300, PMA (주 12.35 μg의 / μL, 사전 -dilute 1 : 1235) 1 : 사전 희석 주식 100.
    3. 1000 Brefeldin A, 0.5 μ 시간 : 4 시간 염색하기 전에, 하나의 최종 농도를 얻기 위해 잘 당 20 μl를 Brefeldin A / PMA / 이오 노마 이신 10 배 믹스를 추가M (375 NG / ㎖) 이오 노마 이신 10 NG / ㎖ PMA.
    4. 37 ° C / 5 % CO 2에서 4 시간 동안 인큐베이션
  2. 표면 얼룩
    참고 : 여기에 제안 된 패널은 제안이다 다른 패널의 관심 및 장비 설정의 항원에 따라 사용될 수있다.
    1. 얼음에 PBS 쿨. 얼음에 멋진 (0.5 % 인간 혈청 알부민, HSA와 PBS) FACS 버퍼를 준비합니다. BSA 또는 FBS는 HSA에 대한 대안으로 사용될 수있다.
    2. 염색 접시에 다시 판 세포 : 재현 탁은 피펫 세포와 잘 (나중에 염색 절차의 유출을 방지하기 위해) 각 주위에 잘 무료를 떠나, 새로운 96U 웰 플레이트에 세포를 전송합니다. 목적하는 세포 수보다 원래 웰에 존재하는 경우, 잘 염색으로 여러 웰을 부유 전에 상청액의 일부를 제거하고, 풀.
    3. 원심 플레이트를 실온에서 10 분 동안 400 XG.
    4. 뜨는을 제거합니다. 폐기물 상자에 뜨는을 부어 거꾸로 접시를 남겨아래로 즉시 (플레이트를 다시 켜지 않고) 흡수 종이에 한 번 판을 누릅니다. 그런 다음 즉시 판을 다시 켜십시오. 소용돌이 플레이트 액체 잔여 세포를 재현 탁한다.
    5. 및 재현 탁 : 25 μl의 표면 염색 프리믹스 (FACS 버퍼에 5 CD25-PE 1:20 CD4-를 PerCP 1)를 추가합니다.
      참고 : 또한 각각의 항원 양성 세포를 포함하는 샘플 사용 된 형광 색소 각각에 대해 하나의 염색을 포함한다; 그리고 흠없는 샘플을 포함한다. 이러한 기기 보정 설정에 필요합니다. 또한, 보상 구슬을 사용합니다.
    6. 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분을 품어.
    7. 4 ° C에서 10 분 동안 200 ㎕의 PBS, 원심 분리기 플레이트 (400) XG를 추가하고 단계 4.2.4에 설명 된대로 상층 액을 제거합니다. 소용돌이 판.
    8. 단계를 반복 4.2.7 두 번.
  3. 생존 염색
    참고 : 고정 / permeabilization 후 죽은 세포가 충분히 의해 배제 할 수 없기 때문에 생존의 얼룩은 필수적이다FSC / SSC 및 불특정 신호를 발생시킬 수 있습니다. 정착 생존 성 염료가 사용되어야한다.
    1. 를 Resuspend 130 μl의 생존 능력 얼룩 프리믹스의 셀 (고칠 가능성 염료 eFlour780 1 : PBS에서 1400) 및 멀티 채널 피펫 즉시 재현 탁 세포.
      참고 : 또한 몇 일 동안 배양 예를 들어 죽은 세포, 자극되지 T 세포를 포함하거나 제조업체의 지침 등에 의해 열을 적용하여 세포를 죽일 가능성 염료에 대한 단일 염색을 포함한다. 이들은 보상을 위해 필요합니다.
    2. 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분을 품어.
    3. 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기 판. 단계 4.2.4에서와 같이 상층 액을 제거합니다. 소용돌이 판.
    4. 200 ㎕의 FACS 완충액으로 채 웁니다. 단계를 반복 4.3.3.
    5. 200 ㎕의 PBS로 채 웁니다. 단계를 반복 4.3.3.
  4. Foxp3의 염색 버퍼 설정과 세포 내 염색
    1. 물론 각각에 대해 준비 : 150 ㎕를 수정 / 파마 버퍼 (희석 수정 / 파마 진한entrate 1 : 희석제 4) 850 ㎕의 1 배 permeabilization 버퍼 (울트라 순수한 H 2 O와 10 배 permeabilization 버퍼 1:10 희석).
    2. 텍싱 후,에 resuspend 세포 150 ㎕를 수정 / 파마 버퍼에 즉시는 피펫으로 재현 탁. 즉시 세포 덩어리의 고정을 방지하기 위해 재현 탁하는 것이 중요하다.
      주의 : 고정 버퍼는 파라 포름 알데히드를 포함하고 처리하고 적절하게 폐기해야합니다.
    3. 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분을 품어.
    4. 100 μL 차가운 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 850 XG에 원심 분리기.
      주 :이 단계 이후부터 원심 분리 속도는 세포의 손실을 피하기 위해 증가된다. 정착 후, 세포가 보이지 않게하고, 단계 4.2.4에 기술 된 바와 같이 원심 분리하고, 세포의 손실을 최소화하기 위해 완료 직후주의 상청액을 제거하기 위해주의해야한다.
    5. 단계 4.2.4에 설명 된대로 상층 액을 제거합니다. 소용돌이 판.
      참고 : 염색이 단계에서 일시 중지 될 수있다 ...에서이 경우, 200 ㎕의 PBS로 두 번 세포를 씻어; 다음 250 ㎕의 PBS에 걸릴 빛으로부터 보호, 4 ° C에 저장합니다. 세포는 몇 일 동안 저장 될 수있다, 다음 permeabilization를 진행합니다. 직접 permeabilization에 계속 그러나, 최적의 결과를 얻을 수 있습니다.
    6. 텍싱 후, 200 ㎕의 Permeabilization 버퍼를 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 850 XG에 원심 분리기. 단계 4.2.4에 설명 된대로 상층 액을 제거합니다. 소용돌이 판.
    7. 재현 탁 200 ㎕를 Permeabilization 버퍼를 추가합니다.
      참고 : 여기에, 샘플 세포 염색 및 이소 제어 샘플로 분할 할 수 있습니다 (각 샘플의 거리의 절반을). 세포 수를 제한하는 경우, 풀링 이소 샘플 (얻어 각 샘플 및 수영장 10-20 ㎕를 보라)을 제조 할 수있다. 또한, 샘플은 형광 - 마이너스 - 원 (FMO) 컨트롤을 촬영할 수 있습니다.
    8. 4 ℃에서 10 분 동안 850 XG에 원심 분리기. 단계 4.2.4에 설명 된대로 상층 액을 제거합니다. 소용돌이 판.
    9. 에 재현 탁 펠릿(미리 혼합) 44 μl를 Permeabilization 버퍼 플러스 1 ㎕를 정상 마우스 혈청 비특이적 결합을 차단합니다.
      참고 : 다음 단계에서 사용되는 항체가 쥐 이소 타입의 경우이 적용됩니다. 예컨대, 래트 유래의 기타 항체가 사용되는 경우 (예를 들면, 래트 혈청)를 차단하기위한 적절한 혈청을 포함한다.
    10. 어둠 속에서 15 분 동안 4 ° C에서 품어.
    11. 항체를 추가 :
      주 : 특정 로트에 대한 항체 농도를 질의한다. 각각의 형광 색소와 표면 항원에 대한 항체 (예를 들어, CD4)와 단계 4.2에서 수행하지 않는 경우, 또한 보상 양성 세포를 포함하는 샘플 사용 된 형광 색소 각각에 대해 하나의 염색을 포함한다.
      1. (하나의 염색, 염색 샘플, 이소 제어 샘플 및 FMO 컨트롤 제외) 샘플 15 μL 항체 프리믹스를 추가 샘플 당 프리믹스 : 0.7 μL (0.35 μg의) 안티 - 인터페론 감마 (IFN-γ) -FITC을 (restimulation 후 해당되는 경우 ),2.3 μL (0.115 μg의) CTLA-4 바이올렛 (421), 2 μL (0.05 μg의) 안티 Foxp3를-APC, 10 ㎕의 PBS 화려한.
      2. 4.4.11.1에 사용되는 항체와 같은 항체의 동일한 금액을 사용하여, 제어 샘플을 이소 15 μl의 이소 항체 프리믹스를 추가하려면 : 샘플 당 프리믹스 : 0.7 μL (0.35 μg의) 마우스의 IgG1 K의 이소 제어 FITC (해당하는 경우), 0.58 μL (0.115 μg의) 마우스의 IgG2a 아이소 타입 - BV421 0.5 μL (0.05 μg의) 쥐의 IgG1 아이소 타입 K 제어 APC 13.2 ㎕의 PBS.
      3. FMO 컨트롤의 경우, PBS로 한 항체를 각각 대체 4.4.11.1에서와 같이 항체를 추가합니다.
    12. 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
    13. 200 μL Permeabilization 버퍼를 추가합니다. 원심 분리기, 단계 4.4.8에서와 같이 뜨는와 소용돌이를 제거합니다. 한 번 반복합니다.
    14. (볼륨을 사용하는 기기에 따라) 및 흐름 cytometer에 이상적으로 즉시 획득 차가운 FACS 버퍼를 Resuspend 세포.

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결과

도 1은 실험 장치의 구조를 도시한다. 그림 2는 자기 절연 순진한 CD4 + T 세포와 nTregs에 대한 대표적인 순도 제어 염색을 보여줍니다.

F의 igure 3a는 게이팅 전략 세포 계측법 흐름을 보여주고 그림 3b는 대표 Foxp3를하고 CD25가 표시 iTreg 또는 제어 조건 하에서 문화의 날 (6)에 염색과 유동 세포 계측법을 보여줍니다. 시험 관내 자극시에, 대부분의 세포는 라파 마이신의 존재 하에서 감소 CD25을 상향 조절. 전용 iTreg 유도 인자의 첨가하에 Foxp3의 + 세포의 명확한 인구도 iTreg 조건 하에서 CD25 + 세포 내에서 농축되는 명백해진다....

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토론

기술 된 프로토콜은 인간의 CD4 + Foxp3의 + 인간의 순진한 CD4 + T 세포에서 iTregs의 강력한 유도 할 수 있습니다. 우리가 우수한 시험 관내 억제 기능 22 iTregs의 유도, TGF-β, ATRA 및 라파 마이신의 조합을 사용하여, 최근에 기술 된 새로운 프로토콜을 포함한다. 게시 된 다른 프로토콜들에 비해 다른 이점은 단독 -2- IL의 존재 하에서 활성화 된 대조군 세포와 함께 특정 iTreg 유발 요인 효과의 직접적인 비교를 가능하게 서로 다른 프로토콜에 의해 병렬로 다른 iTreg 집단의 유도가있다 . 기술 된 프로토콜은 낮은 기증자의 변화에 ​​Foxp3의 재현성 유도를 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 순진한 CD4 + T 세포는 자기 활성화 셀 정렬에 의해 분리하지만, 형광 활성화 셀 정렬도 가능합니다. 이 프로토콜 나이브 CD4 + T 세포의 예상 수율은 전형적으로 5-10 % 사이 하...

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공개 사항

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감사의 글

니나 나겔(Nina Nagel)은 비디오 촬영과 실험 준비 과정에서 기술적 도움을 준 것에 대해 감사의 뜻을 전했습니다. 세포 내 FOXP3 염색 프로토콜에 도움을 준 Eva-Maria Weiss와 nTreg 분리 프로토콜을 수립해 준 Elisabeth Suri-Payer와 Nina Oberle에게 감사드립니다. Matilda Eriksson과 Peri Noori는 실험실 관리 부문에서 인정을 받았습니다.

자금 지원: A.S.는 제7차 유럽 공동체 프레임워크 프로그램(European Community Framework Programme)의 마리 퀴리 인트라 유럽(Marie Curie Intra Europe) 펠로우십, Dr. Åke Olsson 재단 및 KI 연구 재단의 지원을 받았습니다. A.S.와 J.T.는 CERIC(Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease, J.T.)의 지원을 받았으며, Vetenskapsrådet Medicine and Health(Dnr 2011-3264)의 지원을 받았습니다. Torsten Söderberg 재단, FP7 STATegra, AFA 보험 및 스톡홀름 카운티 의회.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
올 트랜스 레티노산Sigma AldrichR2625-50MG   
anit-human Foxp3-APC 클론 236A/E7eBioscience17-4777-42
anti-human CD25 microbeadsMiltenyi Biotec130-092-983
anti-human CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified Biolegend302914
anti-human CD3 항체, LEAF Purified Biolegend317315
anti-human CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
anti-human CD45RO PE 클론 UCHL1BD Biosciences555493
anti-human CD4-PerCP 클론 SK3;mIgG1BD Biosciences345770
anti-human CD8-eFluor 450 (클론 OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
항-인간 CTLA-4 (CD152), 클론 BNI3, mIgG2ak, 브릴리언트 바이올렛 421BD Biosciences562743
안티-휴먼 IFN-g FITC 클론 4S. 나3; mIgG1keBioscience11-7319-81 
Brefeldin A 함유 용액 : GolgiPlugBD Biosciences555029
cDNA 합성 키트 : SuperScript VILO (역전사 효소) cDNA 합성 키트Invitrogen11754-250
밀도 원심 분리 매체 : Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99.7 %Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, 열 비활성화Invitrogen10082-147
고정 가능한 생존력 염료, eFluor 780   eBioscience65-0865-14 또는 65-0865-18 
Foxp3 염색 완충액 세트eBioscience00-5523-00주의: 파라포름알데히드가 포함되어 있습니다. 항체와 결합된 키트에서도 구입할 수 있습니다. 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 염색 세트 APC 클론: 236A/E7 세트
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine)Invitrogen35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit IIMiltenyi Biotec130-094-131
Human serum albumin 50 g/LBaxter1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LS-columnsMiltenyi Biotec130-042-401
마우스 IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
마우스 IgG1 K Isotype Control FITC 50 μ geBioscience11-4714-81 
마우스 IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, 클론 MOPC-173BD Biosciences563464
파스퇴르 피펫 플라스틱, 개별 포장Sarstedt86.1172.001   
PMA Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트시그마 알드리치P1585-1MG 
라파마이신EMD (Merck)553210-100UG
재조합 인간 IL-2, CFR & D202-IL-050/CF
재조합 인간 TGF-베타 1, CFRnD240-B-010/CF
RNA 분리 키트: RNAqueous-Micro KitAmbionAM1931   
RPMI 1640 미디엄 인비트로젠72400-054 
나트륨 부티레이트시그마 알드리치B5887-250MG 
T 세포 배양 배지: X-Vivo 15 배지, 겐타마이신+페놀Lonza04-418Q
TaqMan 유전자 발현 분석, FOXP3 (최상의 커버리지) Applied Biosystems4331182; 분석 ID: Hs01085834_m1주의: 파라포름알데히드
포함 TaqMan 유전자 발현 분석, RPL13A (최상의 적용 범위)Applied Biosystems4351370; 분석 ID: Hs04194366_g1   주의: 파라포름알데히드 함유
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스Applied Biosystems4369514
레드

참고문헌

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CD4 TTGF betaqRT PCRFOXP3Treg
TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화
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