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방법 논문

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

6.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55028

⸱

2017년 1월 8일

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

이 논문에서

요약

다배체 세포의 염색체 불안정성을 분석하기 위해서는 증식 배수체 세포가 필요하지만, 변형되지 않은 인간 세포에서 이러한 세포를 만드는 것은 쉽지 않습니다. 본 보고서는 정상적인 인간 섬유아세포로부터 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 확립하기 위한 비교적 간단한 절차를 설명합니다.

초록

배수체(대부분 사배체) 세포는 인간 조직의 종양 이전 병변에서 종종 관찰되며 이들의 염색체 불안정성은 이러한 조직의 발암에 책임이 있는 것으로 간주되어 왔습니다. 증식성 배수체 세포는 배수체 세포의 염색체 불안정성을 분석하는 데 필요하지만, 변형되지 않은 인간 세포에서 이러한 세포를 만드는 것은 다소 어렵습니다. 화학 작용제에 의한 사배체의 유도는 일반적으로 이배체와 사배체 집단의 혼합을 초래하며, 대부분의 연구에서는 이배체 세포에서 사배체를 분리하기 위해 희석을 제한하여 형광 활성화 세포 분류 또는 복제를 사용했습니다. 그러나 이러한 절차는 시간이 많이 걸리고 힘들다. 본 보고서는 이배체 세포에 의한 오염을 최소화하면서 정상적인 인간 섬유아세포로부터 증식성 사배체 세포를 유도하는 비교적 간단한 프로토콜을 설명합니다. 간단히 말해서, 프로토콜은 다음과 같은 단계로 구성됩니다: demecolcine(DC)에 의한 유사분열 상태에서 세포 정지, 털어낸 후 유사분열 세포 수집, 수집된 세포를 추가로 3일 동안 DC로 배양, 약물이 없는 배지에서 세포 배양(며칠 이내에 사배체 세포로 증식을 재개함). 세포 유형에 따라 shaking에 의한 유사분열 세포의 수집은 생략될 수 있습니다. 이 프로토콜은 정상적인 인간 섬유아세포에서 증식성 사배체 세포를 확립하는 간단하고 실현 가능한 방법을 제공합니다. 이 방법으로 확립된 사배체 세포는 염색체 불안정성과 배수체 인간 세포의 발암 가능성을 연구하는 데 유용한 모델이 될 수 있습니다.

서론

배수성은 포유 동물 종의 전문 조직에서뿐만 아니라, 암과 같은 퇴행성 질환의 병리 적 상태의 다양한뿐만 관찰되었다. 배수체 (주로 배체) 세포는 종종 경부 3,4의 바렛 식도 2 또는 편평 상피내 병변 인간 조직의 발암 병변 관찰하고, 그 조직을 5 이수성 악성 세포의 근원으로 간주되어왔다 6. 이 이수성 배체 세포로의 전환이 종양 형성의 초기 단계에서 중요한 이벤트가 될 수 있다고 제시되어 있지만,이 과정에 관여하는 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다. 이 비 형질 배수체 인간의 세포를 전파 할 수있는 더 체외 모델을 사용할 수 없었다 부분적으로 있기 때문이다.

일부 연구자들은 INH로 이핵 세포의 생성을 통해 비 형질 인간의 상피 세포에서 tetraploidy을 유도 한세포질 분열 7-9 ibiting. 그러나이 방법 불필요한 이배체 세포 -7,8- 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 제거해야 또는 희석 9를 제한하여 클로닝. 이러한 절차를 수행하기 쉬운 힘들고 없기 때문에 간단한 방법은 비 형질 배체 세포가이 분야의 연구를 위해 요구되는 설정합니다.

본 보고서에서, 우리는 비교적 간단한 절차에 의해 정상적인 인간 섬유 아세포 또는 텔로 머라 아제 - 불후의 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포를 확립하기위한 프로토콜을 설명합니다. 절차는 또한 DC로 처리 떨고에 의해 수집 된 유사 분열에서 이배체 세포 및 유사 분열 세포를 체포 스핀들 독 데메 콜신 (DC)를 사용합니다. 오랜 시간 동안 DC 처리 이배체 유사 분열 세포는 G1 배체 세포로 변환하고, 이들 세포는 약물의 제거 다음의 며칠 동안 성장 정지 후 같은 배체 세포 증식. 이 프로토콜은 제공염색체 불안정성 배수체 인간 종양 세포의 전위 사이의 관계를 연구하는 유용한 모델을 생성하는 효과적인 방법.

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프로토콜

1. 세포 배양

  1. tetraploidy을 유도하는 세포를 얻습니다. 최신으로이 기술은 인간 섬유 아세포 세포주 TIG-1, BJ, IMR-90 및 텔로 머라 - 불멸화 TIG-1 (TIG-HT)에 적용 할 수있는 것이 확인되었다.
  2. α 변형 혹은 10 % (v / v)의 5 %에서 배양함으로써 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) (V / 보충 공부 될 세포 유형에 적합한 임의의 다른 세포 배양액 최소 필수 배지에서 세포 성장 V) CO 37 ° C에서 2 분위기. 통로 세포는 subconfluent 밀도를 초과마다 3 사일 없습니다.
    주 : 인구 배증 레벨 (PDL)는 세포 성장 및 세포 연령 평가에서 계대마다 계산되어야한다. PDL은 접시 (N1) 및 다음 식 (X 초기 PDL이다)를 사용하여 다음 계대 (N2)에서 수확 한 세포 수로 접종 세포 수로부터 계산 될 수있다. PDL은 = X + (N1 로그 - N2 로그) / 2 로그

2. 유도 및 사령관이배체 섬유 아세포에서 배체 세포의 blishment

  1. 흔들림 오프없이 tetraploidy 유도한다.
    참고 : 일부 세포주 (예 : TIG-1)은 다음과 같이 데메 콜신 (DC)로 거의 완전히 배체 연속 처리에 의한 될 수 있습니다.
    1. 치료 전날에 하나 또는 두 개의 100mm 접시에 통로 세포는 tetraploidy 유도합니다. 일반적으로 배체 세포의 유도를 위해 접시 당 5 × 10 5 6 10 × 1 세포를 준비합니다.
    2. 4 일 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC를 포함하는 매체가 기하 급수적으로 증가 세포 치료.
    3. 마약없는 매체와 매체를 DC가 함유 교체하고 37 ° C에서 (v / v)의 CO 2 분위기 5 %에서 세포를 배양한다. 세포는 통상 1 주일 이내에 증식을 다시 시작합니다.
  2. 흔들림 오프로 tetraploidy 유도한다.
    주 : 대부분의 세포는 DC와 간단한 처리의 결과로서 이배체 및 사배체 집단의 혼합물이 상기 (2.1)에 설명된다. 는 P의 따라서 일부 수정rocedure (그림 1)을 다음과 같이 이배체 인구가 필요합니다 제거합니다.
    1. 여러 T75에 통로 세포는 tetraploidy을 유도하는 치료 전날 플라스크. 일반적 배체 세포를 유도하기위한 적어도 5 × 106 세포 (플라스크 당 1 × 106 세포)를 준비한다.
    2. 유사 분열에서 셀을 체포 18 시간 - 16 0.1 μg의 / ㎖의 DC를 포함하는 매체가 기하 급수적으로 증가 세포 치료. 유사 분열에서 세포를 저지하기 위해 필요한 시간은 표적 세포에 의존 할 수 있고, 가능한 한 많은 유사 분열 세포를 얻기 위해 예비 실험에 의해 결정되어야한다. 예를 들어, 느린 성장 세포는 빠르게 성장하는 세포보다 긴 시간 동안 DC로 처리해야합니다.
      주 : 셀이 너무 길면,이 단계에서의 치료를하는 경우, 그들은 유사 분열 슬립을 겪을 수 있으며 불가능 다음 단계에서 흔들림 차단하여 세포 분열을 수집하게 식기 표면에 부착.
    3. 어에서 흔들림 오프 법에 의해 DC-체포 유사 분열 세포를 수집ICH 느슨하게 부착 유사 분열 세포는 원심 분리 플라스크 중간 세척 부드러운 진탕 (300 XG, 5 분)에 의해 수집된다. 이 단계에서 적절한 방법으로 세포 수를 계산합니다.
    4. 60mm 배양 접시에 수집 유사 분열 세포를 다시 시드 및 추가 3 일간 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 세포를 치료. 세포의 10 % 미만이 처리를 견딜 수 있으므로, 접시 당 이상 1 × 10 6 세포 유사 분열을 시드.
    5. 마약없는 매체와 매체를 포함-DC를 교체하고 세포는 통상 1 주일 이내에 발생 확산을 재개 할 때까지 기다립니다.
  3. 마찬가지로 원래 이배체 세포 통로 세포.

DNA의 배수성 3. 시험

참고 :이 잘 설립 절차 및 기술 설명서는 자세한 절차 및 기술 도움말을 참조해야합니다.

  1. 수확 세포 (5 × 10 5 - 1 × 6) 솔루션 콘과 배양 세포에 의한37 ° C에서 10 분 동안 0.05 % 트립신 및 0.02 % EDTA를 이닝, 및 10 % FBS를 함유하는 배지에서 트립신을 중화.
  2. 매체에 원심 분리기 세포와 원심 분리 (300 XG, 5 분) 다음 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)에 재현 탁하여 그들을 씻는다.
  3. 다음 두 가지 방법 중 하나에 의해 DNA 분석을 위해 세포를 준비
    1. 고정되지 않은 셀 (10)을 분석하기위한 방법
      주 :이 방법은 세포주기 분석을 위해 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 수행 될 수있다. 세포가 절차에 고정 핵이 시간이 지남에 따라 손상되어 염색되지 않기 때문에이 방법으로 제조 된 샘플은 즉시 분석되어야한다.
      1. 250 MM의 자당을 함유하는 40 mM의 시트 레이트 버퍼와 세포를 씻으십시오. 이어서 실온에서 10 분 동안 250 mM의 자당을 함유하는 200 μL의 40 mM의 시트르산 완충액, 0.1 % (V / V)의 Nonidet P40, 30 μg의 / ㎖ 트립신 250 μL로 셀을 처리한다.
      2. 0.5 μg의 / ㎖의 트립신 INH의 200 μL를 추가실온에서 10 분 동안 ibitor 250 mM의 수크로오스를 포함하는 40 mM의 시트르산 완충액 0.1 μg의 / ㎖의 RNase A, 및 세포 배양한다.
      3. 0.4 mg을 200 μL를 추가 / 250 mM의 자당을 함유하는 40mm의 시트르산 완충액 ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI), 및 세포 핵을 염색을 실온에서 10 분 동안 세포를 배양한다.
    2. 고정 된 세포를 분석하기위한 방법
      1. 세포 현탁액을 혼합하고 실온에서 30 분 동안을 남기고 100 % EtOH로 적가 4㎖를 첨가, PBS 1 ㎖로 세포를 현탁하여 80 % 에탄올로 세포를 고정한다. 이 정착액의 셀은 여러 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
      2. PBS 5ml에 재현 탁하여이를 세포 씻어 원심 분리 (300 × g으로 5 분) 하였다. 0.5 ㎎ / ㎖의 RNase A의 세포를 취급를 50㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI) (0.5 ㎎ / ㎖의 RNase (A)의 475 μL 1 ㎎을 25 μL / ㎖ PI)을 실온에서 30 분 동안로 얼룩.
  4. t의 DNA 함량을 분석그는 488 nm의 적색 레이저 발광 채널 필터로 유동 세포 계측기를 사용하여 세포 (긴> 내지 610 단계). 표적 세포의 배수성을 평가하는 동시에 정품 이배체 세포로부터 제조 된 기준 샘플을 분석한다.
    1. 대안 적으로, 이배체 세포 대 비드의 형광 강도의 비율을 평가하기 위해 표준 형광 비드를 추가한다. 사이토 단일 배체 세포와 이배체 세포 (11)의 덩어리를 구별하는 흐름의 옵션 '펄스 폭 대 펄스 높이'를 사용합니다.

염색체 수와 핵형 분석 4. 시험

참고 :이 모든 잘 확립 된 절차이며, 기술 매뉴얼 또는 제조사의 프로토콜 세부 절차 및 기술 도움말을 참조해야합니다.

  1. 중기 세포를 체포하기 위해 4 시간 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 함께 기하 급수적으로 증가 세포 치료.
  2. 염색체 슬라이드를 준비합니다.
      트립신 처리하여 수확 세포 (적어도 5 × 10 5 세포)와 FBS를 포함하는 배지에서 일시 중지합니다.
    1. 배지에서 세포 원심 분리 (300 × g으로 5 분), 10 분 동안 37 ° C에서 저장성 용액 (0.075 M KCl을 5 mL)로 처리한다.
    2. 수정하고 Carnoy의 정착액 세포를 정지 (메탄올 : 아세트산 = 3 : 1).
    3. 세포 현탁액의 - (35 μL 25) 작은 볼륨을 드롭하여 유리 슬라이드에 세포를 확산. 이러한 뜨거운 증기에 노출되는 등의 추가 단계가 확산 염색체를 개선해야 할 수도 있습니다.
  3. 현장 하이브리드의 염색체 개수 또는 핵형 분석 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 얼룩 세포 (mFISH).
    1. 염색체 수가.
      1. 20 분 - 5 % 김사 솔루션 (또는 형광 현미경 0.5 ㎎ / ㎖의 RNase A를 포함하는 5 μg의 / ML의 PI) 15와 얼룩 세포.
      2. 디지털 적어도 50 중기 세포를 사진.
      3. 이미지 분석을 이용 softwa 셀당 염색체 수를 계산터치 및 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 염색체 중복 설명서를 분리 한 후 다시. 염색체 번호를 수동으로 득점 할 수 있지만, 컴퓨터 채점하는 것이 좋습니다.
    2. 핵형 분석
      참고 :이 분석은 숙련 된 기술자 또는 전문 회사가 수행해야합니다.
      1. 표준 G 밴딩 기술 (12)에 따라 얼룩 세포.
      2. 표준 karyograms (12)를 만들기 위해 염색체를 분석합니다.
    3. mFISH
      참고 :이 단계는 선택 사항이며 필요한 경우 수행해야합니다.
      1. 제조 업체의 프로토콜 (13)에 따라 인간의 염색체에 대한 여러 가지 빛깔의 물고기 프로브를 사용하여 얼룩 세포.
      2. 적절한 필터를 사용하여 형광 현미경 분석 mFISH (13)를위한 소프트웨어를 사용하여 염색체 분석.

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결과

우리의 경험에 의하면, TIG-1 세포 4 일 0.1 μg의 / mL의 DC (그림 2A)와 간단한 연속 처리에 의해 거의 완전히 배체 할 수있다. 대조적으로, 예 BJ 또는 IMR-90 및 TIG-HT 세포와 같은 다른 섬유 아세포 균주, 흔들림 오프 법에 의해 이배체 동일한 처리 다음 배체 집단, 및 유사 분열 세포의 분리 혼합물되었다이 과정에서 필요한 (- 치료 시작 후 18 시간 일반적으로 16) (도 2B, C) DC 치료. 3 일간 DC와 추가 처리 후, 세포 성장 체포를 시행하고 대형 전시, 며칠 동안 형태를 평평. 일반적으로 일주일 이내에, 작은 증식 세포는 큰 평평한 세포 사이 (그림 3) 나타났다. DC 처리 후 삼주 - 세포는 거의 완전히 배체 2가되었다. 설립 배체 세포 모달 염색체 번호 exce, 대부분의 경우 92이었다PT TIG-HT 세포로부터 설정된 ...

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토론

화학 약품에 의한 이배체 세포에서 tetraploidy의 유도에 큰 문제 중 하나 세포질 분열 억제제 또는 스핀들 억제제에 의해 세포가 종종 배체 및 배체 집단의 혼합물이 될 것입니다, 그리고 배체 세포는 이배체 세포로부터 분리해야합니다. 이배체 세포의 무료 배체 인구의 절연을위한 가장 일반적인 방법은 희석을 제한하여 FACS 또는 복제를 사용합니다. 그러나 이러한 과정은 힘들고 수행하기 쉽지 않다. 이 보고서에서 우리는 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 이배체 인구의 무료 증식 배체 세포를 확립 할 수있는 새로운 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 유사 분열에서 이배체 세포를 체포하기위한 스핀들 독 DC를 사용하고 접시 표면에 부착 이배체 간기 세포에서 떨이로 구분됩니다 유사 분열 세포를 체포했다. 수집 된 세포는 추가로 3 일간 DC로 처리되고, 유사 분열 이배체 세포는 아마도 DC B이 장기간 처리하여 G1 배체 세포로 변환Y 체크 포인트 적응 (또한 유사 분열 미끄러짐라고도 함). 이 세포는 약물 제거의 며칠 동안 성장...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 관심이 없음을 선언합니다.

감사의 글

마츠모토 선생님의 기술 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MEM-&알파;Sigma-AldrichM8042-500ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Demecolcine 용액 (10 μ g/mL in HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA 시약 키트BD Biosciences#340242유세포 분석에 의한 DNA ploidy 검사
인간 염색체 다색 FISH 프로브 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DImFISH 분석을 위한 특수 필터 세트 및 소프트웨어가 필요합니다.
mFISH가 있는 Isis 이미징 시스템  소프트웨어 MetaSystemsSpecialized 프로브 키트가 필요합니다.

참고문헌

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