이 프로토콜은 혈청에서 파생 마우스 배아 줄기 세포의 수집 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)하는 방법을 제공한다 (소 태아 혈청, FBS) - 및 공급 장치 (마우스 배아 섬유 아세포, MEFs에) 셀에 대한 - 무료 조건 - 무료 방법. 이는 노화 및 노화 관련 질환의 치료에 적용될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
배아줄기세포(ESC)와 유도만능줄기세포(iPSC)가 다양한 세포 유형을 생성할 수 있는 능력은 재생 의학 분야에서 새로운 길을 열었습니다. 그러나 이러한 이점에도 불구하고 배아줄기세포세포와 iPSC의 종양형성 잠재력은 오랫동안 임상 적용의 장벽이 되어 왔습니다. 흥미롭게도, 배아줄기세포는 조직 재생을 촉진하고 세포 노화를 지연시킬 수 있는 몇 가지 용해성 인자를 생성하는 것으로 나타났으며, 이는 배아줄기세포와 iPSC도 무세포 중재 방법으로 활용될 수 있음을 시사합니다. 따라서 혈청 성분(소 태아 혈청, FBS) 및 공급세포(마우스 배아 섬유아세포, MEF)의 오염을 최소화하면서 마우스 배아 줄기 세포(mESC) 조절 배지(mESC-CM)를 수확하는 방법에 대한 요구가 높아지고 있습니다. 본 연구는 혈청 및 피더가 없는 조건에서 mESC-CM을 수집하고 노화 관련 다중 판독을 사용하여 mESC-CM을 특성화하기 위한 최적화된 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 혈청 및 피더 오염 없이 순수한 mESC 특이적 분비 인자를 수집하는 방법을 제공합니다.
서론
이 프로토콜의 목표는 무 혈청 및 공급 장치가없는 배양 조건에서 마우스를 배아 줄기 세포 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)를 수집하고 그 생물학적 기능을 특성화하는 것입니다.
일반적으로 배아 줄기 세포 (는 ESC가)에 의한 자기 갱신 1-3에 대한 자신의 다 능성 및 용량에 재생 의학 및 세포 치료에 대한 큰 잠재력을 가지고있다. 그러나 줄기 세포의 직접적인 이식에는 면역 거부 및 종양 형성 4,5- 등 여러 한계를 가지고있다. 따라서, 무 세포 방법은 재생 의료 노화 개입 -6,7- 대한 다른 치료 전략을 제공 할 수있다.
노화는 성장 체포, 변형 된 세포 생리학과 행동의 영구적 인 상태에 의해 특징 조직과 장기의 노화에 휴대 대응으로 볼 수 있습니다. 암을 포함한 널리 질환, 심혈관 질환, t의 주요 위험 인자는 노화2 형 당뇨병을 YPE 및 신경 퇴행 8. 노화의 명백한 특성 중 하나는 줄기 세포 노화 및 배기 (9)에 의해 발생 조직의 재생 가능성의 감소이다. 많은 중요한 연구들은 일관 노화를 지연시키고 수명을 연장 할 수있는 능력을 가지고 라파 9....
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프로토콜
주 : 무 혈청 피더없는 CM 컬렉션 프로토콜의 개략도는도 1에 도시되어있다.
1. 재료 (MEFs에의 준비, 중간, 플레이트 및 솔루션)
- 문화 MEFs에 중간의 500 ml의를 준비합니다. 10 % FBS (ESC 품질), 50 단위 / ㎖ 페니실린, 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM)을 보충합니다.
- 설립 루틴 프로토콜 (13) 다음 배아에서 MEFs에 격리와 MEF 매체를 유지한다.
- 문화에 mESCs를 배지 500 ml의를 준비합니다. DMEM은 15 % FBS와 2 mM L- 글루타민, 100 μM 비 필수 아미노산 (NEAA), 100 μM의 β 머 캅토 에탄올, 100 유닛 / ㎖ 백혈병 억제 인자 (LIF), 50 단위 / ㎖ 페니실린, 50로 보충 ㎎을 / ㎖ 스트렙토 마이신.
- 0.1 % 젤라틴 용액 5 ㎖의 10cm 세포 배양 접시를 도포하여 젤라틴 화 플레이트 (5 젤라틴 화 플레이트 / MESC 1 판)을 준비한다. 적어도 10 분 동안 인큐베이션 실온에서 첨가 하였다.
- mESCs의 무 혈청 조건을 감소 세럼 중간의 500 ml의를 준비합니다. 중탄산 나트륨 1.2 g (....
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결과
원래 mESCs는 FBS 및 기타 영양 보충제 (도 1A 및 2A)와 MESC 매체에서 MEF 공급 장치에 유지됩니다. CM은 피더 층, FBS, 기타 영양 보충제 (도 1B 및 2B)없이 감소 세럼 미디어에서 mESCs에서 수집 하였다. 이 배양 조건은 우리가 공급, FBS, 또는 다른 보조 식품의 요인에 의해 잠재적 인 오염없이 에어컨 매체 MESC 별을 수집 할 수 있습니다. 제어 매체 mESCs없이, 동일한 배양 조건 하에서 수집 하였다.
ⅰ) 정상 MESC의 배양 조건 (그림 2A) 및 ⅱ) 무 혈청 및 공급 장치가없는 배양 조건 (그림 2B) : mESCs는 서로 다른 .......
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토론
무 혈청 피더없는 MESC-CM의 성공적인 회수를 들어, 다음 방법이 고려되어야한다. 가장 중요한 요인은 MESC-CM의 컬렉션에 대한 초기 통로 mESCs를 사용합니다. 이전에는 초기 통로 MESC-CM 늦게 통과 mESCs에 비해 더 나은 안티 에이징 효과를 가지고 있음을 보였다. mESCs의 통과 수는 그들의 발달 잠재력 (16) 및 다 능성 (17)에 영향을 미치는 것으로보고되었다.
추가적인 연구가 항 노화 효과를 유도 MESC의 secretome의 특정 요소를 분석 할 필요가 있지만, 현재는 MESC-CM은 세포 수준에서 노화를 감소 충분하다고 결론 지을 수있다.
젊은 세포로 다시 노화 세포를 되돌릴 MESC 별 분비 요인의 식별은 미래 연구에 중요하다. 고품질은 항체 어레이 (15)를로 분비 분자에 대해 분석D secretome 분석은 매체 수집 프로세스 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 기초 과학 연구 프로그램 (2013R1A1A2060930) 및 의료 연구 센터 프로그램 (2015R1A5A2009124) 한국 연구 재단을 통해 (NRF), 과학, ICT의 교육부에 의해 투자 및 미래 계획에 의해 지원되었다. 이 연구는 또한 병원 아픈 어린이를위한 (HK) 성에서 시작해서 운영 그랜트에 의해 지원됩니다. 우리는 G4 MESC 라인을 제공하기 위해이 원고 박사 안드라스 나기 편집에서 우수한 도움 로라 Barwell 사라 JS 김에게 감사의 말씀을 전합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES 세포 품질 |
| 페니실린 및 스트렙토마이신 | Invitrogen | #15140 | 50 단위/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신 |
| L-글루타민 | 인비트로겐 | #25030 | 2 mM |
| 비필수 아미노산 (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 &마이크로; M |
| &베타;-메르캅토에탄올 | 시그마 | #M3148 | 100 &마이크로; M |
| 백혈병 억제 인자 | Millipore | #ESG1107 | 100 단위/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | 시그마 | #B4252 | 1 mg/ml |
| 파라포름알데히드(PFA) | 시그마 | P6148 | 3.70% |
| 디메틸포름아미드(DMF) | 시그마 | #D4551 | |
| 페리시아화칼 | 알드리치 | #455946 | 5mM |
| 페로시안화칼 | 알드리치 | #455989 | 5mM |
| NaCl | 시그마 | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| 미토마이신 C | 시그마 | #M4287 | 10 &마이크로; g/ml |
| 프로피듐 요오드화물 | 시그마 | #P4170 | 50 &마이크로; g/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV 역전사체-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR 마스터 믹스 | 응용 바이오시스템 | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| 병 상단 필터 | Corning | #430513 | 0.2 μ 중 |
참고문헌
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.
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재인쇄 및 허가
