제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

요약

우리 화학 요소 존재 원래의 인간 세포에 그들의 생체 외에서 정량화의 검출을 위한 절차를 설명합니다. 메서드는 모든 셀 종류에 적합 하 고는 금속 산화물 나노 입자 노출 체 외에서 다음 단일 셀에 정량적 화학 분석에 특히 유용.

초록

화학 원소 영상 기반 마이크로 분석 기법 지역화 및 세포 수준에서 화학 성분의 정량화를 활성화 합니다. 그들은 생활 시스템의 특성에 대 한 새로운 가능성을 제공 하 고 특히 탐지, 지역화 및 생물 표본 및 환경 모두에서 금속 산화물 나노 입자의 존재를 측정에 적합. 사실, 이러한 기술을 모든 (i) (1에서 최대 건조 질량의 10 µg.g^-1 ), (ii) 마이크로미터 범위 공간 해상도, 및 (iii) 여러 요소 검색 관련 요구 사항을 충족. 이러한 특성을 감안할 때, microbeam 화학 원소 영상 수 있습니다 강력 하 게 보완 일상적인 이미징 기술을 같은 광학 및 형광 현미경 검사 법. 이 프로토콜에는 경작된 한 세포 (U2OS) 이산화 티타늄 나노 입자에 노출에 핵 현미경 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 셀 성장 해야 한다 고 핵 현미경 분석 단계와 광학 현미경에 사용 되는 특별히 설계 된 샘플 홀더에서 직접 노출. 샘플의 식이 동결 극저온 고정 세포 조직과 화학 원소 분포를 유지합니다. 샘플에 동시 핵 현미경 분석 (스캐닝 전송 이온 현미경, 러더퍼드 backscattering 분석 및 입자 유도 된 x 선 방출) 세포 밀도의 지역 분포에 대 한 정보를 제공 합니다. 화학 요소 뿐만 아니라 나노 입자의 휴대 전화 콘텐츠. 생물학, 특히 Nanotoxicology 및 나노 입자와 생물 학적 샘플 사이의 상호 작용의 우리의 이해를 심화 해야 합니다는 Nanomedicine 신흥 컨텍스트 내에서 이러한 분석 도구에 대 한 필요성이 있다. 특히, 핵 현미경 분석 이라는 것을 나노 입자를 필요로 하지 않습니다, 나노 나타났는데 그들의 표면 상태에 상관 없이 세포 인구에서 개별 셀 수준까지 가늠할 수 있습니다.

서론

세포질 항상성 이해 컨트롤, 동화 작용, 및 다른 성분 (이온, 금속, 세 무기 화합물)의 세포내 지역화에 의해 결정 됩니다. 이러한 구성 요소 추적의 형태로 자주 하지만 그럼에도 불구 하 고 시스템 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 정상 및 병리학/스트레스 상황에서 세포 생화학의 연구 세포 대사 메커니즘에 대 한 전반적인 이해 향한 키 단계입니다. 따라서, 세포내 화학 나타났는데, 구조적 조직 및 그들의 관련된 대사 기능 조사를 사용 하는 이미징 및 분석 기술의 개발이 필요한 됩니다. 아주 몇 가지 방법이 제자리에 정량의 한 조각이 주어진된 샘플의 전반적인 화학 본질에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 벌크 형태로 샘플을 분석 하는 방법 외에도 현장에서 분석 고려 생물 학적 샘플 자신의 완전에 질량과 구조 정보, 그로 인하여 그들의 구성 화학 물질 (미 량 원소와 이온) 보존을 잃지 않고, 단백질입니다. 또한, 지속적으로 개발 하는 nanosciences, 향상 된 이미징 및 세포 규모 환경 모니터링에 대 한 분석 방법 됩니다 관찰 하 고 계량 나노 개체 동작 및 상호 작용 하는 데 필요한. ¹

나노 (NPs) 전시 범위 1와 100 nm에 최소한 하나의 얼굴 차원으로 정의 되었습니다. ² 그들의 특정 물리 화학적 특성 때문에 NPs는 광범위 하 게 업계에서 사용. NPs는 nanomedicine 및 바이오 응용 프로그램에서 채택 된다. ^{3 , 4} NPs의 수많은 물리 화학적 특성에도 불구 하 고 인간의 건강 및 환경에 불리 한 영향의 몇 가지 위험을 생성할 수 있습니다 그들은. 이러한 위험 다양 한 농도 수준에서 장기간 및 반복 노출에 의해 유도 될 수 있다 그리고 이것은 아직 명확 하 게 설립 되지. ^{5 , 6 , 7 , 8} 특히, 셀과 연결 된 세포질 응답 내부 NPs의 운명은, 날짜, 완전히 설명. 이것은 탐지를 허용 하는 방법의 부족 및 정량화는 단일 셀에 내 면된 NPs의 일부입니다. ⁹

나노 입자의 셀룰러 복용량 microscopies, 질량 분석 (MS), 추정 하는 데 사용 하는 고전 분석 도구 유도 결합 플라즈마 (ICP-MS) MS^10,11 및 액체 크로마토그래피 석사 (LC-석사), 하지만 그들은 단지 제공 거시적인 규모에서 유용한 정보입니다. 그들 중 누구도 subcellular NPs 콘텐츠 분류 방법의 사용 없이 NPs 배급의 정확한 평가 제공할 수 있습니다. 복용량 응답의 체계적인 평가 불가능 따라서 이러한 방법으로, 반대로 핵 현미경 분석^12,13, 싱크 로트 론 x-선 형광 현미경^{14 같은 원자 분광학에 기반으로 하는 방법} , 그리고 2 차 이온 질량 분석 (SIMS). ^{15 , 16} 그들은 형광 현미경을 사용 하 여 만든 관측을 보완, NPs 형광 분자와 함께 표시 될 수 없습니다 및 따라서 그들의 네이티브 국가에서 공부 하는 경우에 특히 이러한 방법은 특히 흥미 있다. 어느 정도까지, NPs는 fluorophores, 함께 융합 하는 경우에 (i) 정량화 남아 어려운 NP 당 태그 수준 알려져 있기 때문에 (ii) NP 표면 화학 수정 세포의 분포를 수정할 수 있습니다.

이 문서에서는, 우리가 이미징 형태학 및 주, 부, 생물학 견본의 원소 구성에 핵 현미경 기술의 조합에 따라 방법에 집중 하 고 농도 추적.

원자력 현미경 분석 특히 생물학 조직에 화학 성분의 측정에 적합을 증명 한다. 빔 측면 해상도 (0.3 ~ 1 μ m) 및 화학 원소 검출에서 감도 (1 ~ 10 µg.g^-1 건조 질량)는 세포 수준에서 연구 하는 데 적합 하다. 원자력 현미경 기법 샘플에 존재 원자와 상호 작용 하는 (일반적으로 MeV 에너지에서 실행 되는) 이온 빔 후 방출 입자 검출 (광자, 전자, 이온)를 기반으로 합니다. 셀에 발생 하는 상호 작용은 주로: 1) 여기/이온화 원자 원자를 기본 상태로; 반환 후 광자의 방출 다음의 그리고 2) 그들의 에너지와 방향을 선도 하는 들어오는 입자의 확산. 상호 작용에 관련 된 원자의 방출된 입자 에너지 allowsthe 식별 측정. 요소의 매핑을 수행 하 이온 microbeam는 반복 검색 샘플 표면에 종종 100 µ m² 여러 셀을 포함 하 여 약 100의 지역. 내보낸된 입자 감지 하 고 그들의 에너지는 각 광속 위치에 대 한 기록. 빔 위치에 따라 입자의 정렬, 데이터 처리의 목표는 이러한 입자의 방출에 대 한 책임 구조를 따라서 식별. 여기, 우리는 정확 하 게 형광 현미경 검사 법 및 핵 현미경 분석 검색으로 생활 NP 상호 작용의 결과 조사 하기 위하여 세포질과 세포 하위 스케일에서 exogenous NPs를 계량에 따라 접근을 설명 시스템입니다. 우리는 특히 제자리에 정량화 subcellular 수준에서 이산화 티타늄 나노 (티 오₂ NPs)의 관점에서이 방법으로 제공 하는 기회에 집중 한다.

프로토콜

1. 샘플 홀더 준비

1. 샘플 홀더 설계 및 준비
   1. 1 m m 두께 픽 프레임에 5mm x 5mm 스퀘어 드릴 여 샘플 홀더를 제조 한다.
   2. 에탄올 70% (v/v)로 헹 궈 서 깨끗 하 고 살 균 판에 사용할 준비가 될 때까지 계속.
      참고입니다. 세포 배양 및 세포 처리에 대 한 적절 한 샘플 홀더는 필요 합니다. 그것은 세포 배양, 체 외에서 관찰 광학 현미경 검사 법, 그리고 핵 현미경 분석 및 이미징에 대 한 설계 될 필요가 있다. 이 홀더는 슬쩍 프레임¹³의 이루어집니다.
2. 샘플 홀더 준비
   1. 클로 프롬의 100 ml에서 Formvar 분말의 1 mg를 용 해 하 여 Formvar 솔루션을 준비 합니다.
   2. 아니 배 선물을 금속 프레임에 폴 리카 보 네이트 호 일을 스트레칭.
   3. 멸 균 팁을 사용 하 여 샘플 홀더 구멍 주위 Formvar 솔루션을 확산.
   4. 섬세 하 게 샘플 홀더 뻗어 폴 리 카보 네이트 호 일 (5mm x 5mm 스퀘어)에 접착제를 내려 놔.
   5. 각 복제에 대 한 하나의 샘플 홀더를 준비 하려면 이전 시퀀스를 반복 합니다.
      참고입니다. 폴 리카 보 네이트 (PC) 영화는 생체, 충분히 두껍고 다른 프로토콜 및 분석 제약.
      주의-클로 프롬은 독성이 있습니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.
3. 샘플 홀더 살 균
   1. 인큐베이터/교 반기를 사용 하 여 에탄올 70% (v/v), 180 rpm 및 +37 ° C 동요의 50 mL와 원뿔 플라스 크에 탑재 된 샘플 홀더를 놓습니다.
   2. 홀더를 살 균 증류수에 여러 번 헹 구 십시오.
   3. 공기 메 마른 조건에서 그들을 건조 하 고 각 면에 30 분 동안 자외선 (Biosafety 벤치, 클래스 II에서에서 살 균 램프)에 그들을 노출.
   4. 사용할 준비가 될 때까지 무 균 12-잘 접시 (우물 당 1 개 견본 홀더)에서 샘플을 유지.
      참고: 여러 샘플 홀더 살 균과 건조 12-잘 접시 몇 일 동안 parafilm으로 밀봉 상 온에서 저장할 수 있습니다.

2. 적절 한 샘플 홀더 셀의 성장.

주의: 프로토콜은 biosafety 층 류 벤치 (종류 II) 오염 미생물 제외 하에 실시 해야 합니다. 장갑과 항생제 (예: 페니실린, 스)를 처리 합니다. (셀 라인, 유전자 변형 인간 세포 파생) 생물 학적 자료를 처리할 때 유용한 정보를 존중 합니다.

중요: 사용 세포 선 그들은 하지와 Mycoplasma감염을 확인 하 여야 한다.

1. 매트릭스-roGFP ^17,,1819 transfection 메서드를 사용 하 여 프로토콜 제조 업체에 의해 설립에 따라 베어링 플라스 미드와 U2OS 셀 라인 transfect.
2. 플라스 미드-휴대용 transfection를 확인 하는 바이오 센서 및 손실을 방지 하기 위해 플라스 미드를 선택 하 고 적절 한 문화 매체에 transfected 세포를 유지.
3. 형광 현미경 검사 법은 transfection 발생 했습니다 보장 형광의 표현과 관으로 미토 콘 드 리아 네트워크¹⁹의 표시를 확인 하 고 여 transfected 세포를 시각화.
   일시 중지 포인트: 셀 몇 년 동안 액체 질소에 동결 될 수 있습니다.
4. 적절 한 매체에서 세포를 배양 하 여 transfected 세포 인구를 사용 하 여 하위 confluent 세포 인구를 얻기 위하여. 37 ° C, 5% (v/v) CO₂ 포화 물 분위기에서에서 세포 성장.
5. 씨와 같은 그들은 80% 합류에 정착의 하루는 농도에 세포. 일반적으로, µ L 당 500 세포의 농도 사용 될 수 있습니다. 0.25% Trypsin EDTA의 400 µ L를 사용 하 여 셀 (v/v)을 수확 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 유지 문화 매체의 1 mL와 트립 신 작업을 중지 합니다. 230 x g와 + 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 세포를 작은, 다음 상쾌한, 제거 하 고 신선한 문화 매체의 원하는 볼륨 추가.
   참고. 프로토콜은 모든 세포 종류에 적용 하 고 시드 셀 수와 시간을 두 배로 하는 셀에 셀 크기에 따라 달라 집니다.
   주의: 트립 신, 항생제, 및 혈 청 반복된 freeze-thaw 주기를 겪고 하지 마십시오. 살 균 보관. Aliquots로 재고 솔루션을 분할 하 고 −20 ° c.에서 그들을 멈추게합니다 만료 날짜까지에 aliquots를 저장 합니다. 신중 하 게는 트립 신을 완전히 제거 하려면 셀 펠 릿을 씻어. 잔여 trypsin의 지연 하 고 도금 효율 감소.
6. 셀을 계산 하 고 µ L 당 500 세포와 세포 현 탁 액을 얻기 위하여 37 ° C에서 유지 하는 신선한 완전 한 문화 매체와 희석을 수행 합니다.
   참고: 세포 현 탁 액의 농도 40 µ L 드롭 접시 위해서는 세포 유형의 기능으로 적용할 수 있다.
7. 폴 리 카보 네이트 호 일의 중심에 40 µ L 드롭 접시 신중 하 게 포화 물 분위기에서 +37 ° C에서 2 h, 5% (v/v) CO₂ 에 대 한 샘플을 놓습니다.
   중요 한: 샘플 인큐베이터에 배치 되 면 최대한 빠른 셀 첨부 파일 하나를 어떤 기계적인 운동을 제한 합니다. 셀 형식에 따라 최적의 platting 효율성을 위한 2 시간 이상 세포를 품 어 해야 할 수 있습니다. 체크 방울 증발 하지 않도록 포화 인큐베이터 분위기는 잘.
8. 세포는 광학 현미경을 사용 하 여 폴 리카 보 네이트 호 일에 잘 연결 되는지 확인 합니다. 부드럽게 신선한 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 24 시간 동안 계속.

3. 나노 준비 및 노출

참고: 형광 염료 수정 티 오₂ NPs 했다 설계, 합성, 그리고 화학적 tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)로 변경. ^{20 , 21} 이 표면 개 질 나노 입자 감지, 추적 및 지역화에 제자리에 및 cellulo에 생활 및 고정 세포 또는 다세포 생물을 수 있습니다. ^{12 , 13 , 18}

주의: 나노 소재 및 나노 치료와 함께 처리 되어야 합니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 공기에서 보급을 방지 하기 위해, 나노 솔루션 (초순)에 유지 됩니다.

1. ^{티 오}₂ 초순에 NPs의 1 mg.mL^{− 1} 의 현 탁 액을 준비 합니다. 티 오₂ NPs RT에서 강렬한 1 분 쥡니다 펄스를 사용 하 여 분산 (750 W, 20 kHz, 진폭: 30%)는 초음파 발생기와 전용된 원뿔 현미경을 사용 하 여.
2. 4 µg.cm⁻² (최종 농도)의 노출 중단을 얻기 위해 티 오₂ NPs에서 문화 매체에서 원하는 농도 희석. 적절 한 양의 셀에 중간 포함 NPs와 매체를 장착 하 고 티 오₂ NPs의 추가 없이 마찬가지로 컨트롤 셀 티 오₂ NPs 준비의 균질 배급에 대 한 부드럽게 혼합.
3. 37 ° C, 5% (v/v) CO₂ 와 포화 물 분위기에서 24 h에 대 한 세포 인구를 품 어.

4. paraformaldehyde 기정 그리고 형광 현미경

1. 인산 염 버퍼 (PBS, pH 7.4)에 버퍼 paraformaldehyde 솔루션 (PFA, 4 %w / v)의 새로운 솔루션을 준비 합니다.
   1. 100 ml PBS의 PFA 가루 4g을 디졸브. 증기 두건에서 자석 및 자석 교 반기를 사용 하 여 교 반 하면서 65 ° C에 솔루션을 열. 해결 될 때까지 한 번에 1 M NaOH 한 방울을 추가 하 여 pH를 증가. 실내 온도에 해결책을 냉각 하 고 pH 7.4에 조정. 즉시 갓된 솔루션을 사용 하 여 또는 + 4 ° C에서 유지 하 고 빛 으로부터 보호.
      참고: 그러나 더 나은 품질의 고정 및 고정된 샘플의 장기 보존을 보장 하는 PFA의 임기 응 변의 준비 미리 만든된 PFA 솔루션을 사용할 수 있습니다.
      주의: PFA는 독성; 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.
2. 일단, 보육 시간 경과, 포함 된 티 오₂ NPs 린스 한번 신선한 문화 매체와 함께 한 번 PBS (2 mL)는 세포 인구 세포 배양 매체를 제거 합니다. PBS를 제거, 신속 하 게 신선 하 고 차가운 PFA (4 %w / v, + 4 ° C)의 약 수와 린스.
   1. PFA (2 mL, 4 %w / v, + 4 ° C)를 추가 합니다. 실 온에서 15 분을 품 어.
   2. 제거는 PFA, 동요에서 PBS (2 mL, 3 시간, 5 분)와 셀 린스.
      일시 중지 포인트: 이러한 화학적 샘플 고정 형광 이미징 (단계 5로 이동) 후 "급락-동결" 절차에 사용할 수 있습니다 또는 형광 이미징 (4.3 단계로 이동)에 사용.
3. Hoechst³³³⁴² PBS에서 10 분 셀 잠복기와 핵을 얼룩. 500의 최종 농도에 사용 되는 Hoescht³³³⁴² nM. 부 화 후 솔루션을 제거 하 고 PBS로 씻어.
   주의: Hoechst³³³⁴² 셀 permeant 이며 독성이 있을 수 있습니다. 직접 접촉을 방지 하 고 장갑을 준비 하는 동안 Hoechst³³³⁴²를 사용 하 여 사용.
   중요: Hoechst³³³⁴² 솔루션 얼룩은 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지.
4. 프로세스 현장 및 형광 현미경 검사 법 (그림 1)를 사용 하 여 단일 셀 이미징에 대 한 샘플 고정.

5. "식이 어" 고정 및 탈수

1. 액체 질소에 냉각 하 여 알루미늄 전송 접시를 준비 합니다. 저장소 상자에 접시 액체 질소로 채워진 고 차가운 질소 증기에 액체 위에 접시 표면 유지.
   참고: 어떤 금속 격판덮개의 전송 접시를 만들 수 있습니다 (여기서, 우리가 알루미늄을 사용)는 액체 질소 온도, 냉각 수 고 그 동결 건조 시료 챔버를 입력할 수 있습니다.
   중요 한: 상자 지켜져야 한다 폐쇄 가능한 한 많이 찬 격판덮개 표면에 수증기 공 술 서를 방지 하기 위하여. 샘플 준비 하는 동안에 저장 된 액체 질소에 의해 포함 되지 않습니다 한다.
2. 세포 배양에 한 번 헹 구 고 두 번 더, 짧게, 살 균과 초순 물의 얻을 제거 나머지 extracellular 소금의 흔적.
   중요 한: 미디어는 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지를 확인 합니다. 사용 되기 전에 37 ° C에서 모든 미디어를 열. 린스는 아주 짧은 (몇 초) 하며 샘플에 액체의 초과 제거 가능한 한 빨리.
3. 식이-동결 세포-150 ° c 액체 질소 냉장 2-methylbutane 30 s 및 장소 중에서 알루미늄에 그들 격판덮개 전송. 다른 모든 샘플의 준비 하는 동안 여기 샘플을 저장 합니다. 샘플 모든 cryofixed 때, 모든-에-한 번 전송 접시 동결 건조 기에 배치 하 여 전송 합니다.
   중요 한: 전반적인 cryofixation 프로세스 구조 수정 전송 상자에 임시로 저장 하는 샘플에 표시를 방지 하기 위해 20 분 이상 지속 하지.
4. 다음 시퀀스를 사용 하 여 샘플을 freeze-dry: 1) 낮은 압력과 낮은 온도에서 12 ~ 24 h (-99 ° C, 10^-3 mbar)에 대 한 기본 건조 수행 후 2) 판 온도를 증가 적어도 24 h에 대 한 보조 건조 단계 수행 + 40 ° C (+ 40 ° C, 10^-3 mbar) 압력 낮은 유지 하는 동안.
   주의: 액체 질소는 매우 추운 이며 접촉 시 심한 동상 또는 눈 손상 될 수 있습니다. 전송에 대 한 적응된 벤치 최고 컨테이너를 사용 하 고 (극저온 장갑, 눈과 얼굴 보호) 안전 장비를 착용.
   주의: 2 Methylbutane는 매우 가연성. 공기의 유해한 오염 + 20 ° c.에이 물질의 증발에 오히려 신속 하 게 도달 될 수 있다 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 사용 하 여 호흡과 눈 보호 및 보호 장갑. 항상 제대로 작동 화학 연기 후드를 사용 하 여. + 4 ° c.에 저장 될 수 있습니다.
   중요 한: "급락-동결" 세션 2-Methylbutane 온도 모니터링 하는 적절 한 온도계 (-150 ° C)를 사용 합니다. 2-methylbutane 액체 단계에서 유지 되어야 한다. 주변 분위기에 cryofixed 샘플을 전송 하는 것은 온도 증가 또는 샘플 표면에 집 광 수증기 세포 손상을 발생할 수 있습니다. 따라서, 전송 한다 합리적으로 가능한 한 빨리 (30 s)
   일시 중지 포인트: Cryofixation, 후 샘플 (먼지와 습기 로부터 보호) 살 균과 건조 조건에서 몇 일 동안 실내 온도에 저장 수 있습니다. 신중 하 게 좋은 집게와 샘플을 처리 하 고 parafilm으로 밀봉 살 균 12-잘 접시에 그들을 배치. 건조 시키는 건조 한 분위기를 사용할 수 있습니다.

6. 핵 현미경 분석

참고: 핵 현미경 분석 실시 되었다 보완 이온 빔 분석 기법 입자 유도 된 x 선 방출 (µ-를 사용 하 여 AIFIRA (응용 프로그램 Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en 지구의 아키텐)의 microbeam 라인에 PIXE) 및 스캐닝 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM). 시설 제공 빛 이온 빔 백만 전자 볼트 에너지 범위에 3.5 MV 입자 가속기를 기반으로 합니다. ^{22 , 23}

일시 중지 포인트: AIFIRA 제안 된 실험의 과학적 평가 후 국내 및 국제 팀에 대 한 액세스를 제공 하는 보르도의 대학에 의해 접대 하는 이온 빔 시설입니다.

1. 양면 테이프를 사용 하 여 apertured 접시에 슬쩍 시료 홀더를 탑재 합니다.
2. 수직 빔 방향에 수직인 평면에서 샘플을 지 원하는 접시를 놓습니다.
3. 분석 챔버를 닫고 분석 챔버를 진공.
4. 스캔 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM)
   참고: STIM 사용 됩니다 세포 질량, 에너지 손실의 변환 후 셀의 영역 밀도 지도 기록 에너지 손실은 이다 (µg.cm^-2에서 표현) 샘플 면 적당 밀도에 비례 하는 사실을 활용.
   1. 2 MeV의 헬륨 (그⁺) microbeam를 사용 하 여 약 300의 초점면에 크기와 프로브로 nm 직경에서 및 낮은 유창 (2000 ions.s^-1). 평면 실리콘 검출기 (PIPS 검출기, 25 m m², 5.4 MeV @ 11 keV 에너지 분해능), 전송 된 이온의 측정 에너지 빔 축에 샘플 뒤에 배치 합니다.
5. 입자 유도 x 선 방출 (µ-PIXE) 및 러더포드 Backscattering 분석 (µ-RBS).
   참고: µ Pixe 및 µ-RBS 분석 공간 배급 및 서브 마이크로미터 해상도와 화학 성분의 정량화를 제공합니다.
   1. 8 시간 4에서 STIM와 약 100 x 100 µ m²에 의해 발견 하는 관심의 동일한 셀에 1 µ m 및 스캔의 직경까지 집중 1.5 MeV 양성자 (H⁺) microbeam (50-150 pA)를 사용 합니다.
   2. 원자는 고해상도 Si(Li) 고체 검출기 (145 eV 에너지 분해능, @Mn-Kα)에 의해 (나 보다 더 무거운) 샘플에 들어오는 광속 축에서 45 °에 위치에서 방출 된 유도 x 선 광자를 수집 합니다. 검색 된 광자 에너지를 사용 하 여 미터 (요소 예: Z) 및 x 선 강도 요소 농도 결정의 성격을 파악.
   3. 실리콘 검출기-135 °에 다시 흩어져 양자를 동시에 수집 (부분적으로 고갈된 검출기, 25 m m², 11 케빈 5.4 MeV @ FWHM) 들어오는 입자의 총 수를 측정 하 고 x 선 강도 정상화를.
      중요 한: 원자 농도 정량화에 대 한 인증된 교정 표준 컬렉션 x 선 검출기 응답을 보정 하기 위해 사용 됩니다. 참고 자료는 6.3 µ m 두께 Mylar 포 일에 원자 박막의 모음. 20.2 0.6 (Li, K 선)에서 x 선 에너지 범위 방출 케빈 (Rh, K 선).

7. 데이터 분석

1. ImageJ를 위한 IBA J 플러그인을 사용 하 여 화학 원소 지도 재구성 합니다. ²⁴
   참고: ImageJ 위한 플러그인의 형태로 전용된 소프트웨어 원시 핵 현미경 분석 데이터를 처리 하도록 개발 되었습니다. 원시 데이터 연대기 순서로 빔 위치와 함께 기록 됩니다 세포와 상호 작용 입자 빔에서에서 발생 하는 이벤트의 목록에 해당 합니다.
   1. IBA J 플러그인을 사용 하 여 정렬 유형에 따라 이벤트: 이온 에너지 (STIM) 전송, backscattered 이온 에너지 (RBS) 또는 x 선 광자 에너지 (PIXE). 그런 다음 별도로 각 유형의 데이터를 처리 합니다.
   2. STIM 지도 밀도 계산
   3. 평균 x 선 광자 에너지 스펙트럼을 계산 하 고 요소 공간 분포를 검색 하려면 관심 있는 에너지 창 각 화학 원소에 대 한 정의.
   4. 관심 (ROI) (예: 개별 셀, 조밀한 구조, 집계, 등등.) 영역을 정의 하 고 해당 x 선 스펙트럼을 계산.
2. 입사 입자²⁵의 총 수를 계산 하려면 해당 RBS 스펙트럼을 분석 합니다.
3. ²⁶ Gupix 소프트웨어 사용 하 여 각 ROI에 대 한 요소 농도 결정 하는 x 선 스펙트럼에 맞게.
   참고: 방법에 대 한 탐지 (LOD)의 일반적인 제한 요소 (LOD는 Z와 감소)의 원자 번호에 따라 건조 질량 범위 1 ~ 10 µg.g^-1 에.

결과

세포 배양 및 붙일 레이블된 티 오의 형광 이미징 ₂ NPs

우리는 샘플 홀더를 복합 분석 뿐만 아니라 세포 배양, 세포 처리에 맞게 설계 되었습니다. 특히, 중요 한 홀더 음 핵 현미경 분석 및 이미징으로 일상적인 광학 현미경을 허용 했다. 이 샘플 홀더 픽 프레임에 2 µ m 두께 폴 리카 보 네이트 호 일을 기반으로 합니다. 셀은 폴 리카 보 네이트, 몇 일 동안 메 마른 문화 조건에 직접 성장 하 고 NPs 노출 등 다른 실험 설정에 대 한 사용.

Fluorophores (TRITC)와 화학 표면 수정 paraformaldehyde 형광 현...

토론

우리는 subcellular 수준에서 특히 다른 이미징 기술로 가능한 유용한 정보를 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이미징 능력, 더불어 핵 현미경 분석 또한 생물 학적 샘플의 구성에서 입력 하는 화학 성분의 정량화의 가능성을 제공 합니다. 현재 작업에서 우리 인간의 세포 인구를 공부 하 고 티 오₂ NPs에 노출 하는 단일 셀에 따라 관심의 선택한 영역의 분석으로 집중. 다른 기술을 조합 원소 화학 성분에 형태학 상 세포 이미징 및 정확한 정량적 데이터를 제공합니다.

성공적으로 적용 하려면 핵 현미경 분석, 존중 하는 잠재적인 함정을 피하기 위해 다음 사항을 필수입니다. 첫째, 열 대권 외의의 및 생화학의 무결성을 유지 하기 위해 셀 고정을 위한 극저온 프로토콜을 사용 하는 것이 필수적입니다. 둘째, 그것은 또한 아래 20 µ m 두께 얇은 샘플 분석을 수행 하는 필수입니다. 필요한 경우, cryofixed 샘플의 단면을 수행할 수 수 있습니다. 샘플은 절대...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강한>세포 배양
U2OS	ATCC, LGC 표준	ATCC HTB-96
중간 MCCOY 5A w/o L-글루타민	Dominique DUTSCHER	L0211-500
FBS 500 mL	Dominique DUTSCHER	500105U
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFisher Scientific	11548876
L-글루타민 200 mM, 100 mL	Invitrogen	25030024
Geneticin,  20 mL	ThermoFisher Scientific	10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL	ThermoFisher Scientific	11570626
Viromer Red	Lipocalyx	VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid	AddGene	#49437
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	취급 주의
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE	Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)	SIGMA-ALDRICH	T3163	Surface modification of NPs
Sample preparation
폴리카보네이트 호일	Goodfellow	CT301020
폴리에테르 에테르 케톤 지원 (PEEK)	Matechplast	A-239-4047
에탄올, ACS 절대	SIGMA-ALDRICH	02860-6x1L
클로르포름, 무수, 99%	SIGMA-ALDRICH	372978-1L	주의: 독성
Formvar 100 g	한천 과학	AGR1201	유해합니다. 10 µ의 농도에서 사용하십시오. 클로로포름
NaOH	시그마 알드리치	S5881-500G
<강한>샘플 고정
분말, 95% 파라포름알데히드	SIGMA-ALDRICH	158127-500G	주의 독성. PBS
PBS(pH 7.4, Ca2+ 및 Mg2+ 제외)	ThermoFisher Scientific	11503387
Prolong Gold Antifade Reagent	ThermoFisher Scientific	P36934
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	93443	유해한
<강한>시료 동결 고정
액체 질소	공기 액체 sante		유해한
메틸부탄 >=99%	SIGMA-ALDRICH&	nbsp; M32631-1L	주의 독성
알루미늄 전사판	집에서 만든
증류수 및 탈이온수	집에서 만든		Barnstead Smart2Pure
시스템 Parafilm	VWR	52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure	ThermoFisher를 사용하여 제작됨 과학	50129870
생물안전 벤치, 클래스 II	ThermoFisher Scientific	MSC-Advantage
TC20 자동 세포 카운터	Biorad	145-0102SP
세는 슬라이드 2 웰	Biorad	1450016
PIPS 검출기, 25 mm2, 12 keV 에너지 해상도 @5.5 MeV	캔버라	PD25-12-100AM
고해상도 Si(Li) 고체 검출기, 145-eV에너지 분해능, @Mn-Kα	Oxford Instruments
Everhart-Thornley 유형 2차 전자 검출기(SED)	Orsay Physics	1-SED
XRF 교정 표준 나트륨 또는 염소(NaCl	마이크로물질	34381
XRF 교정 표준) 마그네슘(MgF2	마이크로물질	34382
XRF 교정 표준 알루미늄(알루미늄 금속	마이크로물질	34383
XRF 캘리브레이션 표준 실리콘(SiO	마이크로물질	34384
XRF 교정 표준 황(CuSx	마이크로물질	34385
XRF 교정 표준 칼슘(CaF2	마이크로물질	34387
XRF 교정 표준) 티타늄(Ti 금속	마이크로물질	34388
XRF 교정 표준) 철 금속	마이크로물질	34389
Sonicator 750W	음향 재료	11743619
3MM 마이크로 프로브	Bioblock scientific	220-05
진공 내 동결 건조기	Elexience	EK3147
광학 현미경 Zeiss AxioObserver Z1	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	431006-9901
전동 스테이지 xy	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 대물	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420781-9910
Zeiss filterset 02	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	488002-9901
Zeiss filterset 38HE	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	489038-9901
Zeiss filterset 31	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	000000-1031-350
화학 흄 후드	Erlab	Captair SD321
입자 가속기	HVEE	singletron
Software
ImageJ 소프트웨어	미국 국립 보건원	ImageJ 1.51
SimNRA 소프트웨어	Max-Planck-Institut fü r Plasmaphysik, 독일	SIMNRA 6.06
Gupix 소프트웨어	Guelph university, 캐나다	GUPIXWIN 2.2.4