머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

요약

신경주위 침습(PNI)은 두경부 편평세포암(HNSCC)의 흔한 특징으로, 생존율이 낮습니다. 그 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 반고체 기질에 국한된 쥐 등쪽 뿌리 신경절에서 생성된 신경돌기를 활용하여 HNSCC 세포주의 PNI와 관련된 경로를 조사할 수 있습니다.

초록

신경주위 침습(PNI)은 두경부 편평세포암(HNSCC)의 약 40%에서 발견됩니다. 수술, 방사선 및 화학요법을 통한 복합 치료에도 불구하고 국소 재발 및 원격 전이가 더 높은 비율로 발생하고 PNI가 없는 HNSCC에 비해 전체 생존율이 40% 감소합니다. HNSCC PNI와 관련된 경로에 대한 체외 연구는 일관되고 재현 가능한 분석법이 없기 때문에 역사적으로 어려웠습니다. 여기에 설명된 것은 HNSCC에서 PNI를 검사하기 위한 등뿌리 신경절(DRG) 분석의 적응입니다. 이 모델에서는 희생된 누드 마우스의 척추에서 DRG를 채취하여 반고체 매트릭스 내에 배치합니다. 그 후 며칠 동안 신경돌기가 생성되어 DRG의 세포체에서 방사형 패턴으로 자랍니다. 그런 다음 HNSCC 세포주는 기질 주위에 말초적으로 배치되고 신경돌기를 따라 DRG 쪽으로 우선적으로 침입합니다. 이 방법을 사용하면 매우 높은 분석 성공률과 재현성으로 여러 처리 조건을 신속하게 평가할 수 있습니다.

서론

>jove_content<두경부 편평세포암(HNSCC)은 미국에서 6번째로 흔한 암으로, 전국적으로 연간 10,000명, 전 세계적으로 연간 300,000명이 사망합니다¹. HNSCC의 전반적인 예후는 지난 수십 년 동안 50%로 변함이 없었습니다. 신경주위 침습(PNI)은 HNSCC 환자의 예후가 좋지 않다는 가장 두드러진 병리학적 특징 중 하나입니다. 불행히도 PNI는 HNSCC에서 자주 발생하며 HNSCC 환자의 최대 40%에서 발견될 수 있습니다^2,3.

PNI는 악성 세포가 신경을 따라 인접 조직으로 추적하는 과정으로, 국소 및 원거리 확산 속도를 높일 수 있습니다. 따라서 PNI 양성 HNSCC 종양은 국소 재발률 및 원격 전이율이 높아 PNI^4-8이 없는 HNSCC 환자에 비해 전체 생존율이 낮습니다.

PNI 환자의 치료는 일반적으로 수술, 방사선 및 화학 요법을 사용하여 극대화되지만 이러한 환자의 전체 생존율은 PNI^9-11이 없는 환자에 비해 여전히 최대 40% 감소합니다. 따라서, HNSCC에 대한 현재의 치료 방식은 PNI와 관련된 불리한 예후를 개선하는 데 효과적이지 않다는 것이 분명합니다. HNSCC에서 PNI에 대한 표적 요법을 개발하는 접근 방식은 이 과정을 조절하는 요인에 대한 이해가 부족하여 방해를 받았습니다. 이는 부분적으로는 HNSCC에서 PNI 연구를 위한 일관된 체외 모델이 부족하기 때문입니다.

최근 몇 년 동안 여러 그룹이 주로 췌장암과 전립선암에서 PNI를 연구하기 위해 시험관 내 모델을 활용하고 있습니다^12-19. 이 모델은 생쥐나 쥐에서 분리된 등쪽 뿌리 신경절에서 생성된 신경돌기를 대신경 침입을 위한 대리물로 사용합니다. 등쪽 뿌리 신경절은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포가 분비하는 가용화된 기저막 단백질 혼합물인 인자 고갈 반고체 기질에 고정되어 있습니다. 이 매트릭스는 신경돌기의 성장과 이러한 신경돌기를 따라 단일 암 세포를 추적할 수 있도록 합니다. 다음은 HNSCC에서 PNI를 검사하기 위해 이 모델을 적용

한 것입니다.

프로토콜

1. 문화 매체의 준비 및 요리 (10 분)

1. 100 μL를 96 웰 V 바닥 플레이트의 웰에 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 가진 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)로 추가한다.
2. 20 ° C의 냉동고에서 반고체 행렬의 약 100 μL의 사전 분주-병을 제거하고 얼음에 직접 배치합니다.
   참고 : 반고체 행렬은 후속 단계에 필요한 얼음에 액체 상태에 도달하는 데 약 30 분 걸리기 때문에이 전에 후근 신경절에 (DRG) 수확 작업을 수행합니다. 항상 얼음에 반고체 매트릭스를 유지하지 않으면 저품질 매트릭스 방울을 초래할 것이다.
3. 라벨 유리 바닥 영구 잉크 배양 플레이트, 플레이트의 저면의 네 모서리 각각에 고유 식별자를 생성. 판 표면의 온도를 얼음에 플레이트가 오른쪽을 놓습니다.
   참고 : 각 마우스 수익률 32-40 DRG, 소위 냉각 사전 파이 할 필요가 없습니다 (40)에 1에서 그들을 레이블냉장 팁 잠재적 매트릭스 방울을 배치하는 매트릭스 일관성의 차이를 도입하는 과정을 통해 따뜻한 같이, 팁 애완.

쥐 DRG 2. 해부 (45 분)

1. 이러한 CO ₂ 챔버 개흉술의 사용을 통해 특정 실험 프로토콜, 당 등의 무 흉선 누드 마우스를 안락사.
2. 해부 영역과 현미경을 설정합니다. 15 또는 50 ML 원뿔 튜브 폴리스티렌 용기의 살균, 깨끗하고 평평한 밑면을 사용합니다.
   주 : 또한 그들은 일회용 저렴 같이 해부 표면으로 사용하기 위해 적합하며, 핀 또는 바늘을 사용하는 척추 고정을 허용한다. 만 멸균 악기와 바늘을 사용합니다.
3. 천연 시각에서 직선 또는 곡선 섬세한 가위로 마우스의 꼬리 헤드의 루트에서 척주를 따라 세로 절개를 만든다.
4. SACR 아래에 가로 분할에 같은 가위를 사용하여알 척추. 모든 방법을 사용 가위 두개골베이스까지 척추 양쪽 해부. 이 시점에서, 경추가 가위 가능한 두개쪽으로까지 횡단되어 있는지 확인합니다.
5. 낮은 전력에서 운영 현미경 척추의 자궁 끝을 준수하십시오. 백색 척수 척추 주위 근육 및 연부 조직의 다양한 양으로 둘러싸인 뼈 링의 중앙에 명백하다.
6. 미세한 스프링 가위로 3 척추 기관 - 제 2의 지느러미 또는 우수한면을 분할합니다. 가위의 스프링 작용을 이용하여, 척추체 박리가 중심선에서 발생되도록 절단 초기 뼈를 연다. 성례의 척추쪽으로 조금씩 계속하고 추체의 복부 또는 열등한 측면에서 동일한 상처를 완료하여 척추를 이등분.
   참고 : 낮은 DRG 수율가 발생합니다 뼈 척추의 중간 선 절개를 확인하지 않으면.
7. 생에서의 포인트는, 척추는 두 부분으로 나누어 져 있습니다. 장소 및 멸균 접시에 아래로 향하게 척수로, 옆으로 하나의 헤미 - 척추를 놓습니다.
   참고 : 장소에서 척수를 떠나는 것은 DRGs는 척수에 깊은만큼, 건조에서 DRGs를 방지 할 수 있습니다.
8. 폴리스티렌 해부 플랫폼이 18 게이지 바늘과 다른 헤미 - 척추의 양쪽 끝을 고정합니다. 경부 끝부터 부드럽게 약 4 척추 수준에서 척수를 다시 박리 (척추가 좁아지고 있기 때문에 명백한 상기 DRG는 서로 근접하며, 리브 삽입있다).
9. DRG를 연결하는 감각 신경 (일반적으로 두)를 관찰한다. 신경이 DRG에 삽입 영역에서 부드럽게 미세 집게로 주변 근막을 파악. 해부 및 DRG을 확보하기 위해 미세한 스프링 가위로이 밴드와 다른 신경 조직을 잘라. 부드러운 철회는 뼈 척추 내 위치 밖으로 DRG을 가져올 것이다.
   참고 : 증가이 단계에서 현미경 전력은 유리하다. 크게 신경 돌기의 성장을 제한 할 DRG에 부상을 크러시. 이것은 결코 직접 DRG 파악하지 피할 아니라 주변의 밴드를 파악하는 것이다.
10. 주변 신경을 DRG를 해제하는 미세한 스프링 가위로합니다 (DRG는 일반적으로 해부보기로 깊은 기준으로 한 말초 신경을 가지고) 잘라.
    주 : 신경 말단과 DRG 지금이 시점에서 DRG에 가능한 한 가까운이 컷을 긴장에있는 동안 시작 이상적입니다 확인하는 가장 쉬운 방법입니다. 이 말단 지점이 절단되면, 근위 분기도 트리밍된다.
11. 미세한 스프링 가위로 어떤 길 잃은 신경 섬유 또는 근막 첨부 파일의 DRG를 낸다. 적절한 분리 한 후, 96 웰 V-바닥 판 내 상온 매체에 DRG를 배치했다.
    참고 : 접시는 흰색 DRGs 쉽게 하위 mm를 시각화 수 아래 어두운 배경을 배치. 만 EAC 한 DRG를 배치시간 잘; 이러한 방식으로, 그들은 쉽게 후속 단계에서 설명 될 수있다.
12. 한 헤미 - 척추 후 다른 아래로이 과정을 모든 방법을 반복합니다. 40-32 총 20 DRGs, - 각 팀은 16을 산출한다.
    주 :이보다 적은 DRGs가 있다면 척추 해부 상기 cephalad 및 / 또는 미부를 행할 필요가있다. DRGs 하나가 꼬리 쪽이 진행됨에 따라 점점 덜 잘 정의된다.

반고체 매트릭스 방울 3. 준비 (<판 당 1 분)

1. 얼음에서 하나의 유리 잘 바닥 플레이트를 제거하고 운영 현미경 아래에 얼음 블록에 놓습니다. 확인 매트릭스의 분취 항상 얼음에 유지합니다.
2. 또한 유리의 가장자리로부터 액적 자체 적어도 큰 거리를두고 2 μL 또는 10 μL의 micropipetter으로 유리 바닥 판의 4 개의 코너 부 각각에 행렬 1.5 μL 방울을 놓는다.
   1. 직접에 피펫의 팁을 놓고45도 각도로 유리합니다. 천천히 행렬을 피펫. 매트릭스가 접시에 종사 한 후 천천히 유리 바닥에서 멀리 이동합니다.
      참고 : 매트릭스와 유리 사이의 표면 장력이 완벽한 반구 때마다 작성해야합니다.
   2. 매트릭스로 공기 방울 부주의 주입 매트릭스 액적 훨씬 큰 직경을하고 제거하기 어렵 기 때문에 팁 비어 직전 피펫 멈춘다.
      참고 : 피펫 손을 안정시키기 위해 두 번째 손을 사용하여보다 정확한 위치를 용이하게한다.

반고체 매트릭스 방울로 DRG 4. 삽입 (<접시 당 2 분)

1. 잠시 실온 (~ 1 분)에서 매트릭스 물방울 접시를 남겨주세요. 이것은 약간 DRG의 정확한 배치가 쉬워, 매트릭스를 경화된다.
2. 국자 (파악하지)가 DRG 부드럽게 왼쪽 손에 폐쇄 미세 집게로. 다시, 작은 대하여 어두운 배경, 흰색DRG 시각화를 용이하게한다. 오른쪽 손에 21 게이지 바늘의 끝 부분에 DRG를 전송합니다. 이 전송은 집게에 잔류 미디어를 떠날 것이다.
3. 천천히 21 게이지 바늘 (도 1)를 사용하여 매트릭스 방울의 중앙으로 DRG를 삽입한다. 대부분은 DRG 용이 행렬로 분리되며, 그 바늘 중앙에 위치 될 수있다.
   1. DRG이 바늘로 찌르는 경우, 바늘의 오프 매트릭스 방울에 DRG를 밀어 미세 집게를 사용합니다. 실험실과 현미경 집게에서 심지 멀리 초과 용지는 닦습니다.
      참고 : 매트릭스 미디어를 소개하는 것은 분석의 직경, 볼륨과 일관성을 변경합니다. 색 또는 색 쓰기와 얼음 블록이 섬세한 프로세스의 시각화를 쉽게 배경 대조를 제공합니다.
4. 판은 네 DRGs있다 후에 DRG 행렬 방울의 중심에 있음을 보장하기 위해 최종 검사를 수행한다. 조정21 게이지 바늘로 필요에 따라.
5. 37 ° C 배양기에 완성 된 판을 전송합니다. 이 반고체 행렬을 공고히하고 위치에 DRG가 해결됩니다.
6. DRGs 모두에 대해이 과정을 반복합니다. 음성 대조군으로 DRG없이 빈 매트릭스 방울을 놓습니다.
7. 모든 접시를 완료하고 최소 3 분 동안 37 ° C 배양기에 노출 후 각각의 유리 바닥 판에 10 % FBS 매체와 DMEM의 4 ML을 추가합니다. 약간의 각도로 접시를 놓고 천천히 점진적으로 매트릭스 DRG 단위와 접촉하도록, 매체를 추가 할 수 있습니다.
   주 : 매체가 너무 빨리 또는 적극적으로 매트릭스 및 / 또는 DRG를 추가하면 빠질 될 수 있습니다.
8. 72 시간 - 48에 대해 37 ° C 배양기에서 분석을 저장합니다.
   참고 : 분석의 정기 검사 행렬 에지 (그림 2)으로 신경 돌기의 원주 가지를 표시합니다. 신경 돌기가 매트릭스 방식의 3/4보다 큰 경우에는, 그것을세포를 도금하는 것이 적절하다.

머리와 목 암 세포의 5. 준비

주 : 두경부 편평 세포 암종 세포 이외의 세포 라인이 실험 설계에 사용될 수있다.

1. 37 ° C 배양기에서 선호 플라스크 또는 배양 접시에 10 % FBS와 DMEM에서 편평 상피 세포 암 세포주를 유지한다. 모든 매체 문화 플라스크 또는 접시에서 실험, 흡입 세포를 준비하고 PBS로 두 번 세척합니다. 10 % FBS DMEM으로 다음 5 분 동안 0.025 % 트립신을 적당량 첨가하여 세포를 정지. 6 mL의 배양 접시에 세포 및 미디어 혼합물의 피펫 4 mL를.
   주 : 6 ㎖의 배양 플레이트가 더 이상 충분한 세포를 제공하는 경우에도 50 % 이하로 합류한다.
2. 염색 및 DRG 분석에 도금에 24 시간 이전에 다른 조건에 HNSCC 셀 라인을 노출. 재 투여 세포 environme 일관성을 유지하는 도금되면 조건NT를.
   참고 : 세포 배양 접시에 1 항체, 성장 인자, 사이토 카인, 또는 다른 분자를 추가 - 마우스의 해부 및 매트릭스에 DRG의 주입 다음 1 일.
3. (- 삼일 행렬에 DRG 수확 및 주입 후 2) 세포를 도금하기 전에 형광 세포 얼룩에게 1 시간을 추가합니다.
   참고 : 세포막을 통해 자유롭게 통과 여기에 사용되는 특정 얼룩; 그러나, 세포 내 티올 그룹과 반응 후, 얼룩은 세포 내에서 유지와 딸 세포에 전달된다. 염색 크게 분석법에서 시각화를 용이하게한다. 이 실험의 기간 3 일 - 형광이 2 존재하기 때문에 이러한 임시 얼룩은 이러한 분석에 이상적이다. 또한, 다양한 컬러의 사용을 허용하고 형광 단백질 형질 감염된 세포주를 생성하기위한 필요성을 제거한다.
   1. 무 혈청 DMEM 2 ㎖에 2 μL 10 mM의 스톡 세포 얼룩 혼합 색소 용액 10 μM 준비모든 세포의 상태에 따라. 세포에 첨가하기 전에 37 ℃로 가온이.
   2. 플레이트에 부착 HNSCC 세포를 떠나, 6 mL의 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 10 μM 세포 염색 / 무 혈청 DMEM의 용액을 인산 완충 식염수 (PBS) 2 ㎖를 첨가하고 2 분리 각 플레이트에 첨가
   3. 40 분 동안 37 ° C 배양기에 세포 얼룩 6 mL의 문화 판을 돌려줍니다.
   4. 40 분 후, 배지를 흡인. PBS의 2 mL를 넣고 다음을 대기음. 각각의 판에 0.025 % 트립신 1 ㎖를 추가하고 37 ° C 배양기에서 교체합니다.
   5. 3 후 10 % FBS와 DMEM 2 ML을 추가합니다 - 5 분, 15 ML 원뿔 튜브에 정지 세포를 전송합니다. 세포를 스핀 10 % FBS DMEM으로 1 ㎖에이를 재현 탁.
   6. 혈구 또는 자동 세포 계수기와 세포를 카운트하고 용액 당 300,000 세포의 최종 세포 농도를 만들기 위해 10 % FBS DMEM으로 추가.

6. 도금 머리와 N에크 암 세포

1. 인큐베이터에서 매트릭스 DRG 분석과 함께 유리 바닥 플레이트를 제거합니다.
   주 - 삼일 신경 돌기는 일반적으로이 후 발생 행렬의 가장자리 방향의 적어도 75 % 일 때 다시, 이들은 적합하다. 이 가장 적어도 10 배 목표를 사용하여 볼 수 있습니다.
2. 유리 바닥 판에서 매체를 기음. 완전히 잘 매트릭스 DRG 유닛을 제거하지 않고, 유리 내의 매체 대기음.
3. 200 μL 피펫을 사용하여 300,000 세포 / ㎖의 매체의 200 μL를 그립니다. 각 매트릭스 DRG 분석을 통해 세포의 두 방울을 놓습니다. 한 접시에 각 셀 상태의 네 개의 반복을 만들어 각 매트릭스 방울에 대해이 단계를 수행합니다.
   참고 : 행렬의 반구 형태는 세포 분석 (그림 3a,도 3b)의 주변을 따라 링에 정착 할 수 있습니다. 부드러운 트리거와 피펫을 찾는 것은 균일 한 배치가 훨씬 쉽게 떨어질 수 있습니다.
4. 유사 세포 수 및 디 확인4X 현미경 하에서 다양한 세포 조건 stribution.
5. 약 60 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 유리 바닥 판을 놓습니다. 주 : 세포 및 매체 (~ 150 μL)의 소량이 있지만 인큐베이터 시간을 몇 시간이 경과 할 때까지 상기 분석법은 건조하지 않는다.
6. 60 분 후, 부드럽게 유리 바닥 판의 측벽을 따라 10 % FBS와 DMEM 4 mL를 넣어.
   주 : 일정 시간 동안 상기 세포가 부분적으로 바닥 판 및 세포를 방해하지 않는 매체를 첨가하는 방법을 준수. 상이한 세포 유형은 유리 바닥 판에 부착하기 위해 다소 시간이 걸릴 수 있도록.
7. 이전의 농도 수준을 유지하기 위해 현재 어떤 약물 또는 외인성 성장 인자를 교체.
8. 그들은 현미경으로 조사하는 경우를 제외하고 37 ° C 배양기에 분석을 돌려줍니다. 현미경에 의한 촬상이 분석의 결과를 정량화. 간단히과 신경초 침윤의 가닥을 계산네 개의 사분면에서 4 배 현미경 이미지를 사용.
   참고 : 4X 목적 및 형광 기능이있는 현미경 사진 문서화 분석법을위한 적합합니다. 분석법의 크기는 신경초 침윤의 개별 영역을 포착 할 수있을만큼 자세히 설명하는 4X 목적, 분야 내에서 잘 맞습니다. 신경초 침윤 24 시간 이내에 분명하게하지만, 48 시간을 초과하면 분석의 무결성 종양 세포 매트릭스의 둘레를 따라 나누어 침입으로 약화하기 시작한다. 48 시간을 넘어도 시야 현미경을 사용하여 시각화를 가리는 DRG에서 섬유 아세포의 상당한 유출이 있습니다. 따라서,이 기간 동안 적어도 두 광 문서 4X 현미경에서의 결과하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 종양 세포 도금 후 24 및 48 시간에서). 이러한 3 차원 분석하고, 완전히 화상 전체 분석 어렵다는 염두. 대부분의 신경초 침윤 플레이트의 바닥, t에서 비행기에서 발생그 세포는 다소 플레이트의 바닥 위에 매트릭스에 포함된다. 이 평면은 수평으로 근접하기 때문에, 종양 세포와 신경 돌기의 대부분은 4X에서 단일 레벨의 이미지에서 캡처된다.

결과

DRG의 절개 및 매트릭스 액적 내에 배치 한 후, 분석의 외형은 완전한 원형이 DRG 아니라고 참고도 1과 유사해야 있지만, 매트릭스 내 액적 중심. 이것은 그림 2에 부분적으로 표시된 360도에서 신경 돌기의 생장, 수 있습니다. DRG의 특정 부분이 일반적으로 원심성과 구 심성 신경 가지 입력하고 각각 DRG를 종료 한 경우에 해당, 다른 사람보다 더 빠르고 더 많은 수의 신경 돌기를 보내주의하십시오. 우리는이에 대해 무작위로 4 그룹의 DRGs을 도금 한 후 무작위로 각 셀 상태로 주어진 판을 할당하여 DRGs 사이의 크기 차이를 차지하고있다.

전술 한 바와 같이 신경 돌기는 일반적에있는 행렬의 가장자리에 방해 적어도 ¾ 확장하면 우리는 HSNCC 세포주 판형일 3. 추가 셀이 행렬

토론

프로토콜 내에서 중요한 단계

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 정확한 해부 및 후근 신경절의 추출이다. 이 헤미 - 척추에 척추와 중간 선 - 세로 부문의 적절한 절개는 DRG 많은 수의 획득에 중요하다. 개별 DRGs의 해부 동안, 신경절은 직접 처리해서는 안, 오히려 주위의 근막은 미세 집게로 파악되어야한다. 이렇게하지 않으면 가능성이 신경 돌기 가지에 대한 실패의 주요 원인 인 DRG의 압박 손상 발생합니다. 그것은 오버 처리 DRG 및 분석에 더 신경 돌기의 성장을 얻을 수없는 위험에보다 해부하는 동안 주변의 신경 조직을 트림에서-훨씬 낫다.

수정 및 문제 해결

상술 한 바와 같이 실험 프로토콜을 충족 최적의 반영수년간 제조 절차 조정 다수의 확립 hodology. 프로토콜 섹션에 대응하는 단계의 바로 아...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F-12 50/50 L-글루타민 및 15mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
태아 소 혈청	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Phosphate 완충 식염수 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
감마 조사 35 mm 유리 바닥 문화 접시	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 운영 현미경	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	쏜우드, 뉴욕
Schott ACE I 광원	Schott	A20500	독일
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G 및 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Premium Fine Operating Standard Scissors	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Spring Scissors	Harvard 장치	60-3923	Holliston, MA
드레싱 집게	Harvard 장치	72-8949	Holliston, MA
Athymic nude mice (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME