방법 논문

소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

DOI:

10.3791/55049

⸱

2017년 1월 5일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Urology, Morgagni-Pierantoni Hospital

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

소변 샘플의 cell-free 상등액 분획에서 DNA 무결성을 분석하는 방법을 제안합니다. 이 방법은 비뇨기과 악성 종양의 조기 발견에 적합하며 방광암의 조기 진단에 정확한 것으로 입증되었습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혈장 또는 혈청 무 세포 DNA 순환 존재 널리 많은 종류의 암에 대한 생체의 적합한 소스 것으로 도시되었지만, 몇 가지 연구는 소변 무 세포 (UCF) DNA의 잠재적 인 사용에 초점을 맞추고있다. 더 이상 DNA, 전립선이나 방광 암과 건강한 사람과 환자를 구별 할 수있는 조기 진단 마커로 평가 하였다 UCF의 DNA 무결성의 잠재적 역할은 정상 세포 사멸 세포가 매우 조각난 DNA를 생성 가설하고 암 세포에서 눌렀다 시작.

C-MYC, BCAS1, HER2 및 AR하십시오 UCF DNA 무결성 분석은 250 염기쌍 이상 네 서열 네 정량적 실시간 PCR들에 기초하여 제안되었다. 종종 방광 및 전립선 암에서 증가 된 DNA의 카피 수를 서열 분석을 위해 선택되었지만, 상기 방법은가요 성이며, 이들 유전자는 INTE 다른 유전자로 치환 될 수있는휴식. 바이오 마커의 소스로 UCF DNA의 잠재적 인 유틸리티는 이미 이렇게 UCF DNA 특성에 대한 자세한 연구를위한 방법을 포장, 비뇨 기계 악성 종양에 대한 입증되었다. UCF DNA 무결성 검사는 비 침습적 신속하고 수행하기 쉬운 분석을 수행하는 데 필요한 소변 몇 밀리리터 있다는 장점을 갖는다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

무 세포 사멸은 DNA 또는 괴사 메커니즘 혈액 세포 사망으로 인해 소변으로 검출 할 수있다. 혈액의 무 세포 DNA 널리 각종 질병의 진단 및 예후 목적으로, 특히 암 1 연구되고있다. 그러나, 이하 소변 무 세포 (UCF) DNA의 역할에 대한 알려져있다. UCF DNA는 사구체 여과 시스템을 통해, 또는이 둘의 체액 (예 urothelial 세포 또는 전립선 세포)와 접촉 직접 제공 세포로부터 혈액 통과 기인 할 수있다. 바이오 마커의 근원으로 UCF의 DNA의 사용은 주로 요로 3,4- 세포로부터 나오는 DNA UCF의 높은 백분율 신장, 방광, 전립선 암의 조기 진단을 위해 연구되어왔다.

약간은 UCF DNA와 분리하고 특성화하기위한 최선의 방법에 대한 알려져있다. 상기 평가 종양 세포는 정상 세포보다 긴 DNA 단편을 방출한다는 가설을 감안무 세포 DNA의 무결성의 혈행 5 DNA의 출처를 규명하기위한 시도로 검토되고있다. 일부 연구는 혈중 무 세포 DNA 무결성 암 (6)의 여러 유형에 대한 좋은 진단 테스트를 나타내고, 동일한 가설 소변 7-9과 관련하여 제안 된 것으로 설명했다.

이 논문은 방광과 전립선 암 검출에 잠재적 인 응용 프로그램 UCF DNA 무결성 분석을위한 새로운 방법을 설명합니다. 특히, UCF DNA의 무결성 이상 250 bp의 전립선과 방광 암을 포함한 고형 종양에서 증가 DNA의 복제 수있는 것으로 알려져 4 지역에서 시험되었다 프래그먼트 : C-MYC (8q24.21을), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2)와 AR (Xq12) 10-14. 특정 암 유전자가 아닌 임의의 순서는 암 환자의 무 세포 분획을 발견 할 확률을 증가하도록 선택되었다. 의 주요 장점 중 하나이 방법은 유연하고 다른 영역은 또한 종양의 종류 및 특성에 기초하여 선택 될 수 있다는 것이다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.

주 :이 프로토콜에서, 우리는 UCF 무결성 DNA 분석을 수행 소변 샘플에서 DNA를 격리. 된 LNCaP 및 MRC 세포 라인 표준을 구성하는 데 사용 하였다. 이러한 특정 종양 유전자에 대한 DNA 추출 (제어 유전자 분광 실시간 PCR, STOX1) DNA 정량 및 실시간 PCR 등의 기술 (도 1)를 수행 하였다.

1. 소변 수집 및 처리

  1. 깨끗하고, 건조, 플라스틱 컵에 클린 캐치 첫 아침 소변 샘플을 얻습니다. 뇨 샘플의 적어도 50 ㎖ 수집.
  2. 3 시간의 최대 4 ° C에서 소변을 유지하고 같은 온도에서 실험실로 보내.
  3. 두 50 ML 원뿔 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 실험실 및 전송에 도착 두 번 즉시 반전하여 각 샘플을 섞는다.
  4. 튜브를 원심 분리기4 ℃에서 상온에서 10 분 동안 850에서 XG.
  5. 조심스럽게 세포 펠렛 위에 뜨는 적어도 2ml를두고 두 5 ㎖의 튜브에 소변 상등액의 상부 10 mL로 옮긴다.
    주 : 상등액의 상부 전송이 세포 또는 세포 파편에 의한 오염의 위험을 감소시킨다. 상부 및 하부 사이의 명확한 묘사는 없다.
  6. 펠렛을 취소하고 즉시 사용할 때까지 -80 ° C에서 뜨는을 동결.

소변 뜨는 및 세포주 2. DNA 분리

주 : 세포주에서 DNA를 분리 (예를 들어, 된 LNCaP 방광 암 전립선 암 또는 MRC에 대한) 상용 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라. 다음 뇨 상등액으로부터 DNA의 분리 변형 상용 프로토콜을 사용하여 수행한다 :

  1. 실온에서 소변 상청 한 분취 량을 해동.
  2. 소용돌이 및 소변 샘플을 혼합하고 맑은 5 ㎖의 튜브에 소변 상등액 1㎖를 옮긴다. -80 ° C에서 잔류 소변을 고정.
  3. 직접 샘플에 테 k의 100 μL를 추가합니다.
  4. 샘플에 AL 버퍼 1 ㎖를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다.
  5. 튜브를 닫고 15 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품어.
  6. 배양하는 동안, 각 샘플에 대해 하나의 컬럼을 준비하고 제조업체의 지침에 따라 세척 버퍼 AW1과 AW2를 (100 % 에탄올 표시된 금액을 추가) 준비합니다.
  7. 다시 실온으로 샘플을 가져와 무수 에탄올 1 mL를 넣어. 피펫에 의해 완전히 섞는다.
  8. 열 단계 2.7에서 얻어진 혼합물 650 μL를 추가하고 1 분 동안 6,000 XG에 그것을 원심 분리기.
  9. 플로우를 통해이 들어있는 튜브를 버리고 새로운, 깨끗한 수집 튜브에 열을 배치합니다. 샘플 혼합물의 모두 (5 회) 사용 때까지 반복 2.8 및 2.9 단계를 반복합니다.
  10. 추가 500# 181; 컬럼의 테두리를 적시하지 않고 버퍼 AW1의 L. 1 분 동안 6,000 XG에 그것을 원심 분리기.
  11. 플로우 스루를 포함하는 튜브를 버리고 새로운 깨끗한 포집 관으로 대체.
  12. 컬럼의 테두리를 적시하지 않고 버퍼 AW2 500 μL를 추가합니다. 3 분 동안 최대 속도 (20,000 XG)에서 그것을 원심 분리기.
  13. 플로우 스루를 포함하는 튜브를 버리고 새로운 깨끗한 포집 관으로 대체.
  14. 단계를 반복 2.12 잔류 세척 버퍼를 제거합니다.
  15. 깨끗한 1.5 ML의 튜브에 열을 놓습니다. 용출 버퍼 AE의 50 μL를 추가하고 버퍼 적시 그 열을 보장하기 위해 7 분을 기다립니다.
  16. 1 분 동안 8,000 XG에 그것을 원심 분리기.
  17. 미니 열에 단계 2.15에서 용리액을 피펫과 DNA의 최대 회복을 보장하기 위해 1 분 동안 최대 속도로 원심 분리.

3. DNA 정량 및 희석

  1. 분광 광도계를 사용하여, 로봇의 DNA의 정량 분석을 수행H 세포주 소변 상등액 샘플. 제조업체의 지침에 따라, 벤치 탑 분석기에 샘플 2 μL를 사용합니다.
  2. 1 NG / μL의 농도를 수득하고, DNA의 무결성을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 DNA를 저장할 UCF DNA 샘플을 희석한다.
    주 : DNA 양이 실시간 PCR (적어도 100 NG)로 진행하는데 충분하지 않은 경우, 새로운 DNA 분리 과정을 수행한다.
  3. 상이한 농도 여섯 기준을 얻었다 세포주 시료로부터 DNA를 희석 : 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, 2 NG / μL, 100 μL의 부피 (ST1, ST5, ST4, ST3, ST2 각 및 ST6). DNA의 무결성을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 세포주 DNA 기준을 저장한다.

4. DNA 무결성 테스트 - PCR

  1. 프라이머 (농도 분석의 유형에 따라 달라짐), 녹색 수퍼 믹스 셀 라인 DNA 표준 및 얼음 UCF 희석 DNA 샘플을 해동.
  2. 판 f를 스트립 튜브를 준비합니다또는 72 웰 로터 디스크. 나누어 각 표준 시료 희석하고 네거티브 컨트롤의 RNase가없는 물 10 μL 중복 10 μL.
  3. 각 프라이머 1 μL를 혼합하여 준비 (농도는 표 1에 나타내었다) 녹색 수퍼 믹스 12.5 μL, 각 시료의 RNA 분해 효소가없는 물을 6.5 μL. 2 복제, 2 복제에 대한 부정적인 제어,이 여분의 샘플 샘플이 복제에 대한 6 표준 번호 : 믹스를 준비 할 때, 다음과 같은 샘플의 번호를 사용합니다.
  4. 각 웰에 혼합 나누어 15 μL. 피펫 또는 튜브를 회전하지 마십시오.
  5. 표 1의 조건으로 PCR 프로토콜을 시작한다.
    참고 : 29 × 2 샘플 + 6 × 2 표준 + 음성 대조군 × 2 = 72 (UCF DNA의 값) : UCF DNA 값 29 DNA 샘플을 72 웰 로터 디스크를 이용하여 각각의 실시간 실험을 위해 처리 하였다.
    참고 : UCF DNA 무결성 분석을위한 프로토콜도 할 수있다(다른 장치를 사용할 때, ROX 염료가 추가 될 필요가 있음) 다른 PCR 실시간 장비를 사용하여 수행 하였다.

5. DNA 무결성 테스트 - 데이터 분석 및 해석

주 : 앞서 7-9 (도 2)에 기술 된 바와 같이 각 샘플에 대한 UCF DNA 값은 각각의 PCR 유전자 평가를위한 표준 곡선 구조를 사용하여 표준 곡선 보간을 이용한 실시간 장비 검출 시스템 소프트웨어에 의해 수득 하였다.

  1. 복제 평가; 샘플은 차이가 복제 ≥1 코네티컷은 폐기되어야하며, 두 번째 실험에서 다시는-평가했다.
  2. 각 샘플에 대해 중간 코네티컷을 계산하고 36 ≤ CT 촬영 값으로 샘플을 고려합니다.
  3. 융점 분석을 사용하여 PCR 산물의 특이성을 평가한다.
  4. 표준 곡선으로 보간하여 각 앰플 리콘의 농도를 평가; 각 앰플 리콘에 대한 농도 값 (NG / μL)을 얻었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 샘플은 1.51 내지 138 NG / μL의 범위를 보여주는 분석을 위해 총 무료 DNA 농도는 분광 광도법에 의해 정량화 하였다. 다섯 제어 샘플 데이터의 재현성에 사용 하였다 : 두 개의 독립된 실시간 실험 C-MYC, HER2, BCAS1, AR 및 STOX1 수행 하였다. 변동 (CV)의 계수는 두 개의 독립적 인 실험 간 재현성의 좋은 정도 (표 2)와 각 유전자 (표 2)에 대해 계산 하였다.

125 bp의 STOX1 서열을 PCR 억제제들의 존재를 배제하기 위해 분석 하였다. 샘플이 STOX1의 증폭 하였다 경우 UCF DNA 무결성 검사를 수행 하였다. ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UCF DNA 무결성 분석은 소변에서 DNA의 무결성을 평가하기위한 새로운 비 침습적 방법이다. 이는 최근 블래 9 전립선 암 7,8의 조기 진단을 위해 제안되었다. 장점과 UCF DNA 무결성 검사의 단점의 숫자는 함께 앞으로의 전망과 함께, 여기에 설명되어 있습니다.

접근법의 주된 장점은 저렴하고 비 침습적 방법 및 분자 생물학 기술의 기본 지식을 필요로하는 생체의 잠재적 공급원으로 소변을 연구하기위한 간단한 프로토콜을 제공하는 것이다. 시험은 수행하는 신속하고, 2 작업 일 후에 사용할 수있는 결과, (도. 1)는 쉽게 의사의 도움없이 해석 될 수있다. DNA 만 분리 공정 및이 실시간 PCR들의 구성되는 방식은 또한 좋은 비용 편익 비를 갖는다. 정밀도면에서는 UCF의 DNA 무결성 검출에서 높은 감도 (73 ​​%)와 특이도 (84 %)을 갖증상이있는 환자

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 편집에 도움을 준 Gráinne Tierney와 Silvia Bellissimo에게 감사를 표합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
QIAamp DNA 미니 키트
 		Qiagen51304
iQ SYBR  그린 슈퍼믹스, 100 x 50 &마이크로; L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)Biorad1708880
IDT 맞춤형 DNA 올리고 아이디티 HPLC 정제, 100nMole DNA oligo
NanoDrop 1000 분광 광도계Thermo Scientific을 정량화하는 데 다른 분광 광도계 방법도 사용할 수
또 다른 Real Time PCR 기기도 사용할 수 있습니다
인큐베이터
-80 ° C 냉동고
-20 ° C 냉동고
10 μ L 피펫
20 μ L 피펫
200 μ L 피펫
1,000 μ L 피펫
피펫 팁(10; 20; 200; 1,000)
1.5 mL 튜브
50 mL 튜브
15 mL 튜브
Rotor-Disc 72 RotorCorbett9018899
스트립 튜브 및 캡, 0.1 mL (250)Qiagen981103
수집 튜브(2mL)Qiagen19201
Buffer AL(264mL)Qiagen19075
Proteinase K(10mL)Qiagen19133
다른 분광 광도계 DNA Rotor-Gene 6000 Corbett 있습니다 마이크로 원심분리기 50 mL 튜브용 원심분리기 1개

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
  2. Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
  3. Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
  4. Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
  5. Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
  6. Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
  7. Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120(2015).
  8. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).
  9. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
  10. Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
  11. Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
  12. Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
  13. Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
  14. Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632(2011).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

DNAPCRDNA

관련 논문