진핵 세포 발현을 위해 디자인 된 카르복시 말단에 GFP 태그 컨스 부호화 TMEM184A는 혈관 세포에서 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별을 확인하기위한 분석에 사용 하였다.
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이 논문에서
요약
초록
새로운 단백질 선호도 기반 격리 및 생물 정보학 분석을 통해 확인하면, 그들은 종종 크게지지 않은 있습니다. 예측 된 시퀀스 내의 특정 펩타이드에 대한 항체는 일부 현지화 실험을 할 수 있습니다. 그러나, 다른 항체와의 상호 작용에 종종 배제 할 수 없다. 이러한 상황은 단백질 서열 분석에 의존 세트를 개발하기위한 기회를 제공했다. 특히, 단백질의 C 말단에 GFP 코딩 서열에 연결된 유전자 서열을 함유하는 작 제물을 수득하고 이러한 목적으로 사용 하였다. 실험 지역화 리간드 친 화성을 특징, 기능 및 이득은 원래 설계 헤파린 수용체 1과 TMEM184A의 식별을 확인하기 위해 수행되었다. 또한, 막 구조는 토폴로지 질문 상세한 단백질 - 리간드 상호 작용을 어드레싱 연구에 사용될 수있다. 본 보고서는 아칸소를 제공합니다쉽게 다른 새로운 단백질을 위해 적용 할 수있는 혈관 세포에서 발현되는 GFP-TMEM184A 구조를 기반으로 실험 프로토콜의 플랜지.
서론
새로운 기능에 대한 후보 단백질의 식별은 종종 부분 서열 결정 하였다 선호도 기반 격리 프로토콜에 따라 달라집니다. 새로 확인 된 단백질의 최근 사례는 횡단 단백질 184A (TMEM184A), 헤파린 친 화성 상호 작용 1 일 이후에 확인 된 헤파린 수용체 및 TgPH1, 포스의 PI (3,5) P (2) (2)를 결합하는 플렉스 트린 상동 도메인 단백질을 포함한다. 다른 신규 한 단백질의 식별은, 등 비타 의한 것과 펩티드의 직접적인 서열 분석을 포함한다. 누가 미리지지 않은 유전자에서 3 단백질 제품을 식별하는 트랜스 펩티드를 사용했다. 이와 유사하게, 신규 한 단백질 서열의 확인은 새로운 4TM 단백질 (4)의 식별 앞서있어서 단백질 패밀리의 검색 생물 정보학을 이용하여 달성 될 수있다. 아쿠아 포린 가족 유전자 서열의 검사 등이있다그래서 새로운 기능 5 새로운 회원의 식별을 얻었다. 식별 한 후, 단백질의 기능 분석은 종종 예컨대 아쿠아 포린 마찬가지로 단백질 기능에 대한 구체적인 분석을 이용하여 조사 할 수있는 다음 ....
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프로토콜
GFP 단백질 구조 1. 디자인
- 구입 또는 설계 및 제작 문제의 단백질에 기초 GFP 태깅 구조.
참고 : 구입 한 구조를 들어, 표준 벡터 일부 또는 다음과 같은 제안을 모두 포함하는 상업 실험실에서 사용할 수 있습니다 : 그것은 막 단백질 인신 매매에 방해가 덜하기 때문에 막 단백질의 경우, GFP의 C 말단 위치를 선택합니다. 관심의 유전자와 해당 단백질의 C 말단이 콤팩트 단백질 도메인으로 접혀 믿을만한 이유가있는 경우 GFP 사이의 확장을 고려한다. 일반적으로 진핵 세포 발현을위한 구조를 선택하지만, 박테리아 시스템에서 생산을 구성 할 수 있습니다. GFP의이 단백질 활성을 방해 할 수있는 몇 가지 실험 GFP 원하는 경우 제거 될 수있는 (예 TEV 단백질 분해 효소에 대한 같은) 절단 부위를 포함한다. 이러한 현지화 또는 선호도에 대한 추가 태그로 다른 삽입 추가고유 상호 작용 (예을 His6). 이는 본원에 기재된 분석에 필요하지했지만, GFP 전에 GFP의 제거가 필요한 경우, 다른 분석을 용이하게하거나, 유전자를 직접 인접 유용하다.
혈관 세포 2. GFP-TMEM184A 식
- 배양 내피 또는 이전에 1,....
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결과
이론적으로, 어떤 DNA의 형질 전환은 친 유성 형질 전환 시약으로 수행 할 수있는 세포로 구성,하지만, 이전 보고서는 GFP의보다 효과적인 형질은 전기 (12)를 사용하여 내피 세포로 구성한다 나타냅니다. 여기서 제공되는 프로토콜은 통상적으로 사용되는 주 유래 내피 세포 및 평활근 세포의 80 % 이상에서 발현은 GFP-구성하였습니다. 고용 구조의 디자인은 빠른 속도로이 구조를 제공 할 수있는 상업적으로 사용할 수있는 시스템을 사용했다. 주요 용도는 최적의 진핵 세포 단백질 발현 및 주요 고려 사항이었다 계속 구조물 생산과 함께 위치 문제, 멤브레인에 따라서 정확한 전달에 집중했다. 포함 할 수 있습니다 기타 고려 사항 : 접힌 영역의 일부인 C 말단, 둘다 특별한 능력이있다 구내의 가능성과 다르게 지역화 된 단백질 또는 단백질에 대한 GFP의 다른 위치NG가 GFP (프로테아제 절단 부위를 추가) 및 2 친 화성 부위를 제.......
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토론
여기에보고 된 프로토콜은 혈관 세포 1 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별 확증 증거를 제공하도록 설계되었다. 최저 기술은 정기적으로 신규 단백질의 식별을 확인하기 위해 하나의기구로 사용된다. 그러나, 최저 후 일부 기능적 손실 후보 단백질 실제로 정확한 수용체 충분한 증거 (또는 다른 기능성 단백질)은 일반적 아니다. 이는 후보 단백질이 실제로 기능을 발휘한다는 증거를 갖는 것이 중요하다. GFP 태그 새로운 유전자에 대한 구조를 채용하는 기능 실험의 이득을 가능하게하고 GFP 선호도에 따라 태그 단백질의 분리를 용이하게한다. 이 프로토콜에서 사용되는 전기가 (셀의 80 % 이상이 구조를 나타냄) 구조체의 매우 높은 형질 전환 효율을 용이. 일렉트로 사용할 여부를 원하지 않는 경우에는, 다른 형질 전환 메커니즘이 사용될 수있다. 신규 단백질의 기능을 확인하는 GFP 태깅 구조를 선택하는 여러 가지 이점이있다. 우선, GFP는 형질 전환 유전자 발현에 대한 리포터로서 작용하며, .......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
Lowe-Krentz 실험실의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 LLK에 HL54269 연구 보조금의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| GFP-TMEM184A 구조 | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (PFA, methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific | PI28908 | 사용 Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin 플레이트(Avidin 코팅된 검은색 96웰 플레이트) | Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific | PI15510 | 유통 기한이 있는 |
| Fisher Scientific 064432를 통해 구매한 Corning Life Sciences Plastic | |||
| line | ATCC | CRL 1444 | MEM medium1 |
| BAOEC 소 대동맥 내피 세포 | Applications, Inc. | B304-05 | 배양액은 초기에 권장되는대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환 할 수 있습니다1,7 |
| BAOSMC 소 대동맥 평활근 세포 | Cell Applications, Inc. | B354-05 | 배양액은 초기에 권장하는 대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다1 |
| RAOEC 쥐 대동맥 내피 세포 | Cell Applications, Inc. | R304-05a | HeBS를 통해 배양을 계속하기 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech | ||
| pH는 | |||
| N-말단 | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | TMEM184A N-말단 영역에 대한 항체TMEM184A 알려져 있습니다. |
| C-말단에 대한 TMEM184A 항체 | ProSci Inc, Poway, CA 에서 획득 | Figure 1 | |
| GFP 항체 | Pro Sci Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Figure 5 |
| Secondary antibodies, TRITC 또는 Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (당나귀 안티 마우스, TRITC) 715 165 150 (당나귀 안티 마우스, Cy3) | 비특이적 염색을 최소화하기 위해 교차 반응성이 최소화됩니다. |
| CHAPS | C5849 | 에서 구매 | 특정 카탈로그 번호는 중단되었음을 유의하십시오. 공급업체는 교체에 관한 정보를 제공합니다. |
| 라이브 이미징 35mm 접시 | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20mm - C | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Figure 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens < | strong>Figure 5 |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | Zeiss LSM 880, 63X 오일 이멀젼 렌즈 포함 | <강한>Figure 2C |
| Electroporation 장비의 | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation 큐벳 | EC2L | 에서 구할 | 에서도 구할 수 있습니다 |
| 플레이트 리더 | 표면이 아닌 우물 중앙에서 판독합니다. | ||
| 염색 강도를 측정하기 위한 컴퓨터 프로그램 | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ 온라인에서 사용할 수 있는 프로그램 및 정보 | 적절한 프로그램을 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html 참조하십시오 |
| 세포 배양 트립신 용액 | Sigma | T4174 | 10x 용액으로 구매 |
참고문헌
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , ....
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