방법 논문

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

DOI:

10.3791/55053

⸱

2017년 2월 17일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Lehigh University, 2Department of Natural Science, DeSales University

이 논문에서

요약

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진핵 세포 발현을 위해 디자인 된 카르복시 말단에 GFP 태그 컨스 부호화 TMEM184A는 혈관 세포에서 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별을 확인하기위한 분석에 사용 하였다.

초록

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새로운 단백질 선호도 기반 격리 및 생물 정보학 분석을 통해 확인하면, 그들은 종종 크게지지 않은 있습니다. 예측 된 시퀀스 내의 특정 펩타이드에 대한 항체는 일부 현지화 실험을 할 수 있습니다. 그러나, 다른 항체와의 상호 작용에 종종 배제 할 수 없다. 이러한 상황은 단백질 서열 분석에 의존 세트를 개발하기위한 기회를 제공했다. 특히, 단백질의 C 말단에 GFP 코딩 서열에 연결된 유전자 서열을 함유하는 작 제물을 수득하고 이러한 목적으로 사용 하였다. 실험 지역화 리간드 친 화성을 특징, 기능 및 이득은 원래 설계 헤파린 수용체 1과 TMEM184A의 식별을 확인하기 위해 수행되었다. 또한, 막 구조는 토폴로지 질문 상세한 단백질 - 리간드 상호 작용을 어드레싱 연구에 사용될 수있다. 본 보고서는 아칸소를 제공합니다쉽게 다른 새로운 단백질을 위해 적용 할 수있는 혈관 세포에서 발현되는 GFP-TMEM184A 구조를 기반으로 실험 프로토콜의 플랜지.

서론

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새로운 기능에 대한 후보 단백질의 식별은 종종 부분 서열 결정 하였다 선호도 기반 격리 프로토콜에 따라 달라집니다. 새로 확인 된 단백질의 최근 사례는 횡단 단백질 184A (TMEM184A), 헤파린 친 화성 상호 작용 1 일 이후에 확인 된 헤파린 수용체 및 TgPH1, 포스의 PI (3,5) P (2) (2)를 결합하는 플렉스 트린 상동 도메인 단백질을 포함한다. 다른 신규 한 단백질의 식별은, 등 비타 의한 것과 펩티드의 직접적인 서열 분석을 포함한다. 누가 미리지지 않은 유전자에서 3 단백질 제품을 식별하는 트랜스 펩티드를 사용했다. 이와 유사하게, 신규 한 단백질 서열의 확인은 새로운 4TM 단백질 (4)의 식별 앞서있어서 단백질 패밀리의 검색 생물 정보학을 이용하여 달성 될 수있다. 아쿠아 포린 가족 유전자 서열의 검사 등이있다그래서 새로운 기능 5 새로운 회원의 식별을 얻었다. 식별 한 후, 단백질의 기능 분석은 종종 예컨대 아쿠아 포린 마찬가지로 단백질 기능에 대한 구체적인 분석을 이용하여 조사 할 수있는 다음 단계는 전형적이다.

가능하면, 새로 확인 된 단백질의 기능은 특정 효소 또는 유사한 생체 외 기능 분석으로 관찰 할 수있다. 새로운 단백질의 많은 기능은 체외 분석에서 만 그대로 세포 또는 유기체에서 발생하는 복잡한 상호 작용에 의존하기 때문에 항상 적용되지 않습니다. 그러나, 생체 내 분석은 그들이 유전자 서열에 의존하는 방식으로 설계되어야한다. 세포 배양 및 / 또는 간단한 모델 생물에서 최저 단백질 / 기능 식별 6 뒷받침하는 근거를 제공 할 수 있습니다. 전술 한 바와 같이 식별 된 신규 단백질,이 기능을 확인하기 위해 단순히 단백질 노크 종종 불충분D 유전자 서열에 의존 생체 기능 분석의 디자인은 신규 한 단백질의 특성에 중요해진다.

최저의 식별과 일치하는 결과를 얻었다 후 헤파린 수용체로서 TMEM184A 최근 식별은 친 화성 크로마토 그래피와 MALDI MS 1을 사용하는 (즉, 혈관 평활근 및 내피 세포에서 염증 반응에서 확산 변조), 7은 분석의 컬렉션을 개발할 수있는 기회를 제공 . 최근의 검토 헤파린은 다양한 성장 인자, 이들의 수용체, 세포 외 매트릭스 성분, 세포 부착 수용체와 다른 단백질 8 구체적으로 작용 함을 확인 하였다. 혈관계, 헤파린 및 헤파 란 설페이트 프로테오글리칸에 수백 9 단백질과 상호 작용 (헤파린 유사한 구조 헤파 란 황산 사슬 함유). 기능적으로 그쪽을 확인하려면t TMEM184A는 헤파린 흡수 및 결합에 관여하고, TMEM184A의 유전자 구조를 이용 기술이 개발되었다. 본 보고서는 GFP-TMEM184A에 기초 분석법 모음 헤파린 수용체 TMEM184A 등의 신원 확인에 사용하기 위해 구성 포함한다.

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프로토콜

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GFP 단백질 구조 1. 디자인

  1. 구입 또는 설계 및 제작 문제의 단백질에 기초 GFP 태깅 구조.
    참고 : 구입 한 구조를 들어, 표준 벡터 일부 또는 다음과 같은 제안을 모두 포함하는 상업 실험실에서 사용할 수 있습니다 : 그것은 막 단백질 인신 매매에 방해가 덜하기 때문에 막 단백질의 경우, GFP의 C 말단 위치를 선택합니다. 관심의 유전자와 해당 단백질의 C 말단이 콤팩트 단백질 도메인으로 접혀 믿을만한 이유가있는 경우 GFP 사이의 확장을 고려한다. 일반적으로 진핵 세포 발현을위한 구조를 선택하지만, 박테리아 시스템에서 생산을 구성 할 수 있습니다. GFP의이 단백질 활성을 방해 할 수있는 몇 가지 실험 GFP 원하는 경우 제거 될 수있는 (예 TEV 단백질 분해 효소에 대한 같은) 절단 부위를 포함한다. 이러한 현지화 또는 선호도에 대한 추가 태그로 다른 삽입 추가고유 상호 작용 (예을 His6). 이는 본원에 기재된 분석에 필요하지했지만, GFP 전에 GFP의 제거가 필요한 경우, 다른 분석을 용이하게하거나, 유전자를 직접 인접 유용하다.

혈관 세포 2. GFP-TMEM184A 식

  1. 배양 내피 또는 이전에 1, 6, 7보고 된 0.2 % 젤라틴 코팅 된 조직 배양 접시에서 혈관 평활근 세포.
  2. 5 ㎖ 세포 배양 트립신 용액을 추가 (/ w 0.5 % V)을 세정 100mm, 이상 세포의 합류 접시. 셀이 단지 상기 플레이트로부터 방출 될 때까지 37 ℃에서 인큐베이션하고, 멸균 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다.
  3. 트립신의 활성을 제한하는 셀 / 트립신 용액에, 루틴 배양에 사용 된 트립신 억제제 (예를 들어, 일반 배양액의 동일 부피)을 추가한다. approxim에서 5 분 동안 세포 펠렛ately 600 XG (또는 적절한 속도와 시간은 표준 조직 배양을위한 세포 펠렛). 뜨는을 대기음.
  4. 시각 세포의 양을 제한 HeBS (헤 페스 - 완충 염) 전기 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛 또는 현탁액이다. 얼음에 세포 현탁액을 놓고 얼음에 나머지 단계를 수행한다.
    참고 : 펠렛 전에 재 부유에 HeBS로 한 번에 세척 할 수 있습니다.
  5. 20 μg의 / ㎖ DNA의 최종 농도를 달성하기 위해 세포에 GFP 태깅 TMEM184A 플라스미드 충분한 볼륨. GFP 구조에 대한 동일한 프로토콜을 사용합니다.
  6. 일렉트로 큐벳에 HeBS의 셀 솔루션의 약 0.4 mL를 넣습니다. 사용하기 전에 큐벳을 사전 진정.
  7. 다음 조건을 사용하여 세포를 Electroporate : 지수 형 감쇠 500 μF, ∞ 옴, 170 V.을
    주 : 특정 세포 유형에 대한 전압을 최적화한다. 내피 세포와 평활근의 cel와 예비 연구L 타입이 주목 최적의 전압 값, 예를 들어 열을 결정하기 위해 GFP-vinculin 구조로 이루어졌다.
    1. 전기를 최적화하기 위해, (일부 표준 셀 유형에 대한 조건을 포함) 장비 제조업체의 권고로 시작합니다. 원하는 구조 또는 제어 형광 단백질 원하는 구조의 크기와 형광 특성과 유사한 구성 사용한다.
      참고 : 작은 핵산 큰 구조보다 더 쉽게 세포를 입력 표시되므로 단지 형광 단백질과 구조는 하나보다 더 많이 표현하기 쉽습니다.
    2. 세포 생존 능력, 형광 구조체 24, 48 시간 후 발현 된 세포의 비율, 그리고 식의 강도를 결정하기 위해 형광 현미경을 사용한다.
      참고 : 생존이 낮 으면 약간의 전압 및 / 또는 시간을 줄이십시오. 문화 표면에서 세포의 방출과 반환 사이의 최단 시간 목표문화에 세포의 생존을 향상시킬 수 있습니다. 생존 높고 발현이 낮은 경우 시간 또는 제 2 펄스 약간 증가 구조체 흡수를 향상시킬 수있다. 최적의 조건과 표현은 세포 유형에 따라 다를 것입니다. 구조물을 발현하는 세포의 비율이 높지만, 강도는 강도를 향상시킬 수의 DNA 농도를 증가시키고, 단백질 반감기뿐만 아니라 발현에 따라 달라질 최적 강도 시간 동안 형질 감염된 세포를 모니터링 낮은 경우. 염색 강도 항 GFP 항체로 GFP의 면역 형광 염색에 의해 필요한 경우, 일부 분석을 위해 확대 될 수있다
  8. 전기 한 후, 영상 또는 조직 배양 접시로 된 커버와 함께 여섯 30mm 조직 문화 우물에 세포를 시드. 문화 표준 세포 배양 방법을 사용하여 세포.
  9. 선택 사항 : 모든 HeBS의 전기 버퍼를 제거하기 위해 24 시간 후 배지를 교체합니다.

GFP-TMEM 3. 시각화184A 현지화

  1. 최소 24 시간 동안 배양 한 후 PBS 부드러운 흔들림로 세포를 씻어. GFP의 퇴색을 방지하기 위해 밝은 빛에 노출을 제한합니다.
  2. 부드러운 흔들림 함께 RT에서 15 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. 세포를 Permeabilize 하시려면 수있는 메탄올 함유 시약을 사용하지 마십시오. 이 리간드의 상호 작용을 평가하기 위해 필요하지 않은 메탄올로 고정이 사용될 수있다.
    주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 주의, 흄 후드에서 사용하고 올바르게 폐기하십시오.
  3. 위와 같이 PBS로 씻어. 항체 기반의 얼룩은 아래 3.6를 참조하십시오.
  4. 마운트 Mowiol 또는 다른 적절한 장착 매체를 이용하여 커버 슬립을 슬라이드.
  5. GFP의 여기 및 발광 스펙트럼에 대한 적절한 필터 세트와 공 촛점 또는 형광 현미경을 사용하여 이미지 슬라이드. 초점 현미경이 때문에, Z 평면에서의 샘플을 분리하는 기능이 바람직하다. 한때을위한 그레이 스케일 이미지를 저장TIF 형식으로 antitation 목적으로 (그림을위한 풀 컬러 이미지에 추가).
  6. 세포에 의해 발현 WT TMEM184A과의 비교를 위해, 예 TMEM184A 서열의 펩티드 (들)로 제조 된 일차 항체를 사용하여 면역 다른 세포를 제조 한. GFP-TEMEM184A 식별은 GFP에 대한 항체를 사용하여 달성 될 수있다. 동일 현미경 기술에 의해 두 세포 샘플을 평가합니다.

4. 로다 민 - 헤파린 GFP-TMEM184A 형질 세포와 바인딩 및 colocalization을

  1. 배지에 첨가 μg의 100 / ㎖의 헤파린 로다 세포를 GFP-TMEM184A가 발현 치료 및 셀 특정 시간, A7r5 세포 일반적 미만에서 10 분 동안 배양 할 수있다. 헹구고 3.1 및 3.2으로 수정합니다.
    참고 : 최적의 시간과 리간드의 농도는 세포 반응을 얻을 리간드와 이미지 강도의 형광 강도에 따라 달라집니다. 이 정광그것은 다른 분석법 (11)이 50 % 이상 반응을 초래하기 때문에 헤파린 이온을 채용 하였다. 이 농도 표준 형광 현미경 기술을 사용하여 시각이므로 그것을 증가시킬 필요가 없었다 수있다. 세포 낮은 형광 라벨이없는 헤파린 결과 로다 민 - 헤파린의 희석, 따라서 이미지와 양을 더 어렵다.
  2. 때문에 GFP - TMEM184A 형질 전환에 결합 로다 민 - 헤파린을 정량 형질 GFP-TMEM184A없이 동일한 세포를 준비합니다.
  3. 이미지 적절한 GFP (488 ㎚)와 로다 민 (543 ㎚) 여기 및 방출과 함께 공 초점 현미경을 사용하여 세포 (500 - GFP에 대한 530 nm의 로다 민보다 큰 560 ㎚) 값은 공동 현지화를 결정합니다. 통계를 얻기 위해 적어도 세 별도의 실험에서 최소한 50 세포의 이미지를 얻습니다. 실험에서 동일한 설정을 유지하고, 일 (아무 치료 예를 들어, 형질 세포)를 제어 샘플 (들)을 사용에서 여러 실험 분석을 위해 데이터를 표준화하는데 사용될 수있다.
  4. 결합 정량 각 셀 / 흡수를 결합 상대 로다 민을 결정하기 위해 컴퓨터 프로그램을 사용하여 이미지를 조사한다.
    주 :이 분석을위한 편리하고 처음에 그 형식으로 저장되지 않은 경우 많은 컴퓨터 프로그램에 스케일을 회색으로 변환 할 수있는 TIF 이미지를 사용한다. 이미지 J (프리웨어)를 본 분석에 사용하고 공간 및 화소 강도는 이미지의 사용자 정의 된 영역에 대해 측정 할 수 있도록 하였다.
    1. 형광 이미지 내에서 세포에 동그라미를 그리고 그 공간 내에서 강도를 결정하기 위해 측정 도구를 사용하는 자유형 도구를 사용합니다.
      주의 : 이러한 측정은 다양한 형상과 다른 셀들과 비교하는 방법을 제공하는 사용자 정의 영역 (전체 세포, 핵 등)의 총 농도를 계산하기 위해 필요한 정보를 제공한다. 배경의 영역에 걸쳐 강도가보고 될 수 있음을 의미하고, 그 용이분석을위한 배경 강도의 컬렉션입니다.
    2. 스프레드 시트로 내보내기 강도를 곱한 면적을 계산하고 지역의 같은 양의 배경을 뺄 수 있습니다. 통계적 유의성을 얻기 위해 충분한 세포 / 실험 형광 / 평균 셀.

로다 민 - 헤파린에 GFP-TMEM184A 5. 형광 공명 에너지 전달

  1. 형질 전환 된 세포를 준비하고 3.1 200 μg의 / ML의 로다 민 - 태그 리간드와 함께 품어. 형광 리간드와 배양 시간이 셀 타입 의존합니다. 만 PFA로 수정, 및 이미징에 대한 슬라이드를 탑재합니다.
  2. (-; FRET 685 내지 566) 첫째, 로다 민 방출에 대한 405 nm의 이미지를 흥분. 둘째, GFP (493의 이미지 - 530)에 대한 488에 흥분하고, 셋째, (- 685 566에서 이미지) 로다 민 561에 흥분. GFP-TMEM184A없이 또는 로다 민 - 헤파린없이 컨트롤이 중요하다.

로다 민 - Hepari 6. 라이브 셀 이미징n은 통풍 관

  1. 라이브 세포 이미징을 위해 설계된 각각의 요리에 GFP-TMEM184A에게 형질 감염된 세포 종자 및 프로토콜 3에서와 같이 취급합니다.
    주 : 필요한 세포의 수는 원하는 세포 유형 및 밀도에 의존한다. 세포를 카운트하지 않는, 세포 현탁액에있는 시간의 양을 최소화한다. 여섯 35mm 라이브 영상 접시로 100mm 합류 접시에서 종자 세포는 48 시간 후에 세포를 근처 합류 얻었다.
  2. 48 시간 후, 페놀 레드없는 배지로 배지를 교체한다.
  3. 온도를 유지하고 현미경을 집중 온난화 단계와 공 초점 현미경으로 세포의 접시를 전송합니다.
  4. 피펫 100 μg의 / ML의 로다 민 - 헤파린 접시에 가볍게 섞는다.
  5. 즉시 라이브 영상을 녹화 시작합니다. 헤파린의 어떠한 세포 흡수는 뷰 영역 내에서 발생하지 않으면, 적어도 하나의 녹색 소포는 로다 민 라벨을 함유하는 세포를 식별하기 위해 약간 접시를 움직인다.
    참고 : 이미징 여기 및 방출 특성이 있습니다헤파린 흡수 프로토콜 (섹션 5)에 대한 동일. 이미지 간의 시간은 약 16 S이었다. 실험과 현미경의 조건은 일반적으로 화상이 얻어 질 수있는 속도를 결정한다.

배양 된 세포에서 GFP-TMEM184A 및 GFP 7. 분리

  1. 배양액을 제거하고 PBS로 세척 한 후, 2 ㎖의 0.2 % (대조군 결합 분석 용) GFP-TMEM184A 또는 GFP를 발현하는 세포의 150mm 플레이트 프로테아제 억제제 (w / v)의 CHAPS 1X PBS 용액을 추가한다. , 접시에서 세포를 긁어 얼음에 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 세포 / CHAPS 솔루션을 배치하고 활용하여 잘 섞는다. GFP의 태그 아래의 결합 분석을 위해 표백되어 있는지 확인하기 위해 밝은 빛의 모든 단계를 완료합니다.
  2. 구체적으로 GFP-TMEM184A (또는 적절한 GFP 제어)를 결합하기 위해, 상기 용액을 2 μg의 / ㎖ 비 오티 닐화 항 GFP 항체를 추가로 요동 4 ℃에서 밤새 배양한다.
  3. 500 μL를 추가적어도 5 mL의 0.2 % CHAPS / PBS와 원심 분리기 약 3 ~ 5 분 동안 600 XG에 스트렙 타비 딘 - 아가 로스 비드. 뜨는을 제거합니다. 신선한 CHAPS / PBS 때마다 두 번 이상 반복합니다. 항체 및 세포 용액에 구슬을 추가하고 구슬이 GFP 또는 GFP-TMEM184A에 결합 된 바이오틴 방지 GFP 항체에 결합 할 수 있도록 락으로 4 ° C에서 밤새 품어.
  4. (7.3에서와 같이) 원심 분리하여 구슬을 펠렛과 결합되지 않은 물질을 제거. 씻어 적어도 5 mL의 0.2 % CHAPS / PBS가 / 프로테아제 억제제를 추가합니다. 반복 세척 및 원심 분리 적어도 효과적으로 어떤 언 바운드 단백질을 제거하는 배.
  5. 최종 세척을 제거한 후, 항체-GFP 바인딩 (무료 GFP-TMEM184A 또는 무료의 결과로 해리 3 분 동안 얼음에 (염산을 사용하여 2.0으로 산도) PBS 0.2 M 글리신 / 0.2 % CHAPS 1 mL의 구슬을 품어 GFP). 매 30 초를 눌러 부드럽게 섞는다.
  6. 원심 분리는 약 600 × g으로하고, 정제 된 (P)을 함유하는 상등액을 전송할5 ㎖의 1 M 중탄산 나트륨 (7 pH를 가지고)로 즉시 중화 하였다 새로운 15ml를 튜브에 rotein.
  7. 10,000 달톤의 분자량 컷 - 오프 원심 농축기를 사용하여 샘플을 집중 (공급 업체에서 권장하는 원심 분리 속도를 사용). 용적이 약 0.5 mL의 도달하면, 0.2 % CHAPS / PBS를 추가한다. 집중보다 0.2 % CHAPS를 계속 추가 / PBS 0.2 %의 CHAPS의 최소 10 권 (시간 시작 샘플 볼륨) / PBS가 추가 될 때까지.
  8. 절연 GFP 또는 GFP 표지 된 단백질의 양의 추정치를 결정하기 위해, 280 nm에서 흡광도 판독을 획득하고 동일한 완충액에 소 혈청 알부민 또는 다른 조절 단백질로부터 제조 된 표준 곡선과 비교.
    주 : 흡광 계수의 차이에 의해,이 농도를 추정하지만, 샘플을 낭비하지 않고 추가 분석을 용이하게하기 위해 대략 단백질 농도를 제공 할 수있다. 정확한 단백질 농도를 억제 할 수있다샘플과 동일한 완충액에 표준 단백질을 제조하는 특정하게 마이크로 - 로우리 단백질 검정을 사용하여 채굴. 단리 된 단백질의 추가의 분석은 예상 분자량과 비교 (GFP 항체의 검출을 이용한) 분리 된 단백질을 웨스턴 블로 팅에 의해 달성 될 수있다. 대안 적으로, TMEM184A 항체의 사용은 예측 구조 크기의 밴드 초래해야하지만, 이합체 (또는 고차 올리고머) 샘플에 존재하는 경우 또한 WT TMEM184A 대역에서 발생할 수도있다. 순도의 추정치는 출발 물질의 분취 량에서 전체 단백질 대 샘플로부터 단리 된 총 단백질에 대한 오 염색함으로써 얻을 수있다.

8. 체외 헤파린 결합 분석

  1. 진탕 200 μL 0.2 % CHAPS로 5 분 / PBS 세 번 세척하여 검은 아비딘 코팅 된 96 웰 플레이트를 준비합니다. 동일한 세정 절차를 이용한 동일한 무도장 블랙 96- 웰 플레이트를 준비한다. 준비합니다(세중에서) 실험 샘플 레이아웃은 분석 기간 동안 수행합니다. GFP의 표백을 확인하기 위해 헤파린없이 표준 헤파린 농도, 버퍼 컨트롤 및 GFP 샘플을 우물 우물을 포함합니다.
    주 : 최적화 단리 또는 리간드의 상호 작용 버퍼가 해당 단백질 다른 경우, 최적의 버퍼 시스템 플레이트 제제 및 세정 모두를 수행.
  2. GFP가 원하는 바인딩 아비딘 - 코팅 된 플레이트의 모든 웰에 60 pmol의 / 잘 바이오틴 안티 GFP의 100 μL를 추가합니다. 항체의 양은 단지 웰 높은 친 아비딘을 포화시키기에 충분하다.
    1. 만 제어 목적에 사용되는 모든 우물 (아무 GFP 또는 GFP-TMEM184A이 원하는 바인딩)에 버퍼를 추가합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트 커버 웰을 밀봉. 진탕하면서, 실온에서 2 시간 동안 배양.
      참고 : 우물과 배양 시간에 추가 볼륨은 공급자의 추천을 기반으로합니다.
  3. 모든 우물을 세 번 씻으200 μL 0.2 % CHAPS / PBS로 5 분.
  4. 아비딘 - 코팅 된 플레이트에 우물을 적절한 떨고로 실온에서 1 시간 동안 배양 5 nmol의 / 잘 GFP-TMEM184A 또는 GFP의 100 μL를 추가합니다. 8.3로 다시 씻으십시오.
    참고 : 단백질이 농도는 모든 사이트가 초과 GFP 또는 GFP-TMEM184A 포화되었는지 확인하기 위해 선택되었다. 이는 동일한 양의 단백질이 각 웰에 결합하는 것이 중요하다. 단백질의 낮은 양 또한 플레이트 단백질의 여러 농도를 배양하고 결합되지 않은 단백질을 비교 분석 리간드 결합하고 남은 미 결합 단백질을 평가함으로써 검사 될 수있는 가능성을 사이트 포화 것이다.
  5. 형광 표지 된 헤파린의 다양한 농도를 준비, 즉, 10, 25, 50, 75, 100, 200 μg의 / ㎖, 0.2 % CHAPS에서 / PBS. 어둠 속에서이 모든 남은 작업을 수행하십시오.
    참고 : 이전 농도를 준비에, 다른 리간드에 대한 특정 농도가 PROTEI에 대한 결정되어야한다문제의 n 개의 대상입니다. 가장 낮은 농도는 플레이트 리더 검출해야한다. 따라서, 먼저 사용 된 완충 시스템에서 정확하게 검출 할 수있는 범위를 결정하는 것이 중요하다. 이어서 결합 측정을 얻기 위해 필요한 범위를 결정한다. 10 μg의 / mL의 아래 플루 오레 신 - 헤파린의 농도는 지속적으로 사용 된 버퍼 조건에서 플레이트 리더에 등록하지 않았습니다. 마찬가지로 로다 헤파린 다른 분석에서 예에서 사용 된 반면, 상기 버퍼 상태에서, 플레이트 리더에서 가시화 될 수 있으며, 바인딩에 필요한 농도에서, 표준 형광 측정은 형광으로 재현 한 차이가 없었다.
  6. 모두 아비딘 코팅 및 비 코팅 된 플레이트에 아비딘 - 코팅 된 플레이트와 농도의 표준 우물에 적절한 테스트 우물에 형광 헤파린 100 μL를 추가합니다. 진탕 RT에서 10 분 동안 품어. 어둠 속에서 판을 유지 (또는 호일 포함).
  7. 판 것이란를 사용하여데르 플레이트와 아비딘 - 코팅 된 플레이트의 초기 형광 (총) 고정화 GFP-TMEM184A와 웰에서 발광 또는 GFP 양의 대조군 웰에 헤파린의 초기 형광 방출을 기록한다. 필요한 경우, 최저 및 최고 농도와 형광 헤파린의 검출을 보장하기 위해 장비 이득을 조정한다.
    주 : 플레이트 리더 위에서 우물을 읽고 그 조정의 경우 우물에 최적의 위치에 읽고 특정합니다. 당해 연구를위한 최적의 위치는 웰 아래 약 75 %였다. 플레이트 리더와 함께 사용할 정보 검은 플레이트에 결합 된 시료의 분석을 읽기 위해 문제의 플레이트 리더에 고유 제안을 제공해야한다.
  8. 고정 GFP-TMEM184A 또는 GFP와 우물에서 언 바운드 형광 헤파린을 제거하고 비 코팅 검은 접시에 해당하는 우물에 배치합니다. 바로 형광 방출을 읽어보십시오.
  9. 신선한 0.2 % CHAPS를 100 μL를 추가 / PBS 다시 INTO 웰 이로부터 형광 헤파린을 제거하고, 형광 발광을 판독 하였다.
  10. 8.9 배 - 반복 8.8 단계를 반복합니다.
    참고 : 코팅 된 플레이트에서이 수치는 GFP 또는 GFP-TMEM184A 우물에 남아있는 형광 헤파린을 나타냅니다. 상당한 형광을 상기 제 3 결합되지 않은 샘플에서 발견되면, 추가적인 세척이 발생한다. 형광 각 세척으로 제거 할 계속되면, 리간드의 결합 선호도가 낮은 수 있습니다 및 조건을 다시 평가되어야한다. 마지막 독서는 결합 된 헤파린 독서를 구성한다.
  11. 각 세척에 대한 번호를 획득 무도장 판에서 제거, 언 바운드, 샘플에서 녹음 형광 방출. 이들은 "언 바운드"수치입니다.
  12. 각 웰에 첨가 헤파린의 정확한 수준을 확인하기 위해 8.7에서 얻어진 총 헤파린 발광 값을 사용한다. 값에서 평균 배경 판독 값을 뺍니다.
    참고 : 웰스 어떤 형광 헤파린없이 때문에 항체, GFP 및 버퍼에 대한 배경 역할을합니다. 결과 평균즉 배경은 배경의 값을 얻기 위해 반복한다. 바운드 및 언 바운드 측정 값에서 빼기 평균 배경 측정 값은 실제 값을 얻을 수 있습니다.
  13. 총 형광 헤파린 헤파린의 양 대 발광의 비율을 결정하기 위해 추가 대 발광의 플롯을 이용한다.
    참고 : 항체 단독으로, 또는 항체 및 항원 형광의 일부 담금질의 결과. 따라서, 총 헤파린 8.7에 명시된 바와 같이, 헤파린 첨가 전체에 기초하여 결정 하였다.
  14. GFP의-TMEM184A 케이스와 GFP 경우 모두에서 삼중 대한 추가 헤파린 대 보정 헤파린 결합 플롯.
  15. 특정 농도에 대한 모든 세척에서 언 바운드 측정 값을 추가하여 무료 리간드를 결정합니다.

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결과

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이론적으로, 어떤 DNA의 형질 전환은 친 유성 형질 전환 시약으로 수행 할 수있는 세포로 구성,하지만, 이전 보고서는 GFP의보다 효과적인 형질은 전기 (12)를 사용하여 내피 세포로 구성한다 나타냅니다. 여기서 제공되는 프로토콜은 통상적으로 사용되는 주 유래 내피 세포 및 평활근 세포의 80 % 이상에서 발현은 GFP-구성하였습니다. 고용 구조의 디자인은 빠른 속도로이 구조를 제공 할 수있는 상업적으로 사용할 수있는 시스템을 사용했다. 주요 용도는 최적의 진핵 세포 단백질 발현 및 주요 고려 사항이었다 계속 구조물 생산과 함께 위치 문제, 멤브레인에 따라서 정확한 전달에 집중했다. 포함 할 수 있습니다 기타 고려 사항 : 접힌 영역의 일부인 C 말단, 둘다 특별한 능력이있다 구내의 가능성과 다르게 지역화 된 단백질 또는 단백질에 대한 GFP의 다른 위치NG가 GFP (프로테아제 절단 부위를 추가) 및 2 친 화성 부위를 제...

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토론

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여기에보고 된 프로토콜은 혈관 세포 1 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별 확증 증거를 제공하도록 설계되었다. 최저 기술은 정기적으로 신규 단백질의 식별을 확인하기 위해 하나의기구로 사용된다. 그러나, 최저 후 일부 기능적 손실 후보 단백질 실제로 정확한 수용체 충분한 증거 (또는 다른 기능성 단백질)은 일반적 아니다. 이는 후보 단백질이 실제로 기능을 발휘한다는 증거를 갖는 것이 중요하다. GFP 태그 새로운 유전자에 대한 구조를 채용하는 기능 실험의 이득을 가능하게하고 GFP 선호도에 따라 태그 단백질의 분리를 용이하게한다. 이 프로토콜에서 사용되는 전기가 (셀의 80 % 이상이 구조를 나타냄) 구조체의 매우 높은 형질 전환 효율을 용이. 일렉트로 사용할 여부를 원하지 않는 경우에는, 다른 형질 전환 메커니즘이 사용될 수있다. 신규 단백질의 기능을 확인하는 GFP 태깅 구조를 선택하는 여러 가지 이점이있다. 우선, GFP는 형질 전환 유전자 발현에 대한 리포터로서 작용하며, ...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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Lowe-Krentz 실험실의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 LLK에 HL54269 연구 보조금의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GFP-TMEM184A 구조OriGeneRG213192
Rhodamine-HeparinCreative PEGWorksHP-204Light Sensitive
Fluorescein-HeparinCreative PEGWorksHP-201Light Sensitive
MowiolEMD Millipore475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free)Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher ScientificPI28908사용 Fume Hood
Reacti-bind neutravidin 플레이트(Avidin 코팅된 검은색 96웰 플레이트)Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher ScientificPI15510유통 기한이 있는
Fisher Scientific 064432를 통해 구매한 Corning Life Sciences Plastic
lineATCCCRL 1444MEM medium1
BAOEC 소 대동맥 내피 세포Applications, Inc.B304-05배양액은 초기에 권장되는대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환 할 수 있습니다1,7
BAOSMC 소 대동맥 평활근 세포Cell Applications, Inc.B354-05배양액은 초기에 권장하는 대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다1
RAOEC 쥐 대동맥 내피 세포Cell Applications, Inc.R304-05aHeBS를 통해 배양을 계속하기 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다7
Biotinylated anti-GFPThermo Sci Pierce Biotech
pH는
N-말단Santa Cruz Biotechnologysc292006TMEM184A N-말단 영역에 대한 항체TMEM184A 알려져 있습니다.
C-말단에 대한 TMEM184A 항체ProSci Inc, Poway, CA 에서 획득Figure 1
GFP 항체Pro Sci Santa Cruz Biotechnologysc9996Figure 5
Secondary antibodies, TRITC 또는 Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA711 025 152 (당나귀 안티 마우스, TRITC)
715 165 150 (당나귀 안티 마우스, Cy3)		비특이적 염색을 최소화하기 위해 교차 반응성이 최소화됩니다.
CHAPSC5849에서 구매특정 카탈로그 번호는 중단되었음을 유의하십시오.  공급업체는 교체에 관한 정보를 제공합니다.
라이브 이미징 35mm 접시MatTek (Ashland MA)P35G-1.0 – 20mm - C
컨포칼 현미경ZeissLSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lensFigure 1, 2 and 3
Confocal MicroscopeNikonC2+ confocal with a 60X oil-immersion lens <strong>Figure 5
컨포칼 현미경ZeissZeiss LSM 880, 63X 오일 이멀젼 렌즈 포함<강한>Figure 2C
Electroporation 장비의Bio-RadGene Pulser X-Cell System
Electroporation 큐벳EC2L에서 구할에서도 구할 수 있습니다
플레이트 리더표면이 아닌 우물 중앙에서 판독합니다.
염색 강도를 측정하기 위한 컴퓨터 프로그램Image Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
온라인에서 사용할 수 있는 프로그램 및 정보		적절한 프로그램을 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html 참조하십시오   
세포 배양 트립신 용액SigmaT417410x 용액으로 구매
통해 통해 검은색 96웰 플레이트에 주의 Fisher A7r5 혈관 평활근 세포에서 에 사용 로 교환 가능 Cell 배양액은 처음에 권장되는 바와 같이 Fisher Scientific MA5-15256-BTIN Streptavidin-coated beads Sigma S1638 는 Bio-Rad에서 사용할 수 있습니다.에 대한 항체 6.8 ;에 사용되는 Sigma 이 이미지에 사용 MidSci 수 있습니다. 장비 공급업체인 Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro.를

참고문헌

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  12. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
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GFP TMEM184A

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