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방법 논문

유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편

15.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55058

⸱

2016년 12월 12일

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

이 논문에서

요약

연속 크라이 섹션은 단일 마우스 골격근에서 인접 영역을 이용한 유전자 발현 측정 학적 어플리케이션 및 RNA의 농축을 가능하게 수집된다. 직접 애플리케이션에서 비교 풀링 저온부 및 측정 30mg을 - 고품질 RNA를 (20)로부터 얻어진다.

초록

이 방법으로, 연속 저온부는 하나의 마우스 골격 근육에서 인접 영역을 사용하여 유전자 발현을위한 조직 조직학 및 RNA의 농축 모두 현미경 응용 프로그램을 사용하기 위해 수집됩니다. 전형적으로, 그것은, 버퍼 볼륨이 효율적으로 연마 애플리케이션 너무 낮을 수 있기 때문에 아직 충분한 기계적 중단없이 작은 골격근 샘플의 적절한 균질화를 달성하는 도전 버퍼 시약 근육 제한 침투 치밀한 조직 구조는 궁극적으로 저 RNA 수율을 야기. 여기에보고 된 프로토콜에 따라 30 ㎛의 섹션을 수집하고 버퍼 침투 노출 표면적을 증가 저온 절편 이후 니들 균질화가 근육을 방해 기계적하게 풀링. 이 기술의 주요 제한은 저온 유지가 필요하다고하고, 이는 상대적으로 낮은 스루풋이다. 그러나, 고품질의 RNA를 풀링 m 작은 샘플로부터 얻을 수있다uscle 저온부는 여러 가지 골격 근육과 다른 조직이 방법은 액세스 할 수 있도록. 또한,이 기술은 유사한 가능 분석 (예, 조직 병리학 및 유전자 발현) 측정치가 직접 실험 불확실성을 감소시키고위한 작은 조직 소스 필요 복제 성 동물 실험을 감소시키는 애플리케이션에서 비교 될 수 있도록 하나의 골격근의 인접 영역에서 여러 응용 프로그램.

서론

이 기술의 목적은 하나의 작은 골격근 조직 소스로부터 액세스 같은 조직 학적 및 유전자 발현과 같은 다른 양상, 여러 실험을 분석하는 것이다. 현미경 애플리케이션 신중 동결 동안 얼음 결정 생성물의 형성을 제한하도록 제어 되어야만 보존 방법을 시료에 가장 민감하다. 따라서, 분석법 개발을 경골근에 기초한다 (TA) 근 부분적으로 면역 형광 현미경 유전자 발현 양 분석을위한 원료로서 -140 ° C 액체 질소 냉각 -2- 메틸 부탄 욕에서 수지 매립 덮여 냉동.

다양한 기술적 접근법 동일한 원료를 사용할 필요가 좌우 근육 상이한 조건 실험 하나는 제어를 나타내는 근육 주사 기반 실험을 위해 특히 중요하다. 예를 들어, 근육의 재생 과정에서, 하나의 MUscle는 반대측 근육 차량 주입 제어 한 역할을하면서 광범위한 조직 손상을 유발하는 독소를 주사한다. 마찬가지로, 근육 질환에 대한 유전자 치료 연구는 일반적으로 반대쪽이 빈 벡터, 벡터 또는 비 관련 차량 제어와 비교되는 근육 내 주사에 의한 유전자 치료 벡터의 유효성 시작한다. 따라서, 다른 어플리케이션에 각각 TA 근육을 소싱 할 수 없다.

이러한 문제점을 해결하기위한 일반적인 전략은 : ⅰ) ⅱ) 추가 마우스를 사용하거나, ⅲ) 각각의 애플리케이션에 대한 근육의 일부를 잘라, 어플리케이션마다 다른 근육 그룹을 사용. 그러나, 근육 그룹간에 상당한 차이가 어려운 개별 애플리케이션으로부터 데이터를 비교할 수 있도록, 추가 동물 비용을 증가시키고, 다른 대안이있을 경우 제대로 정렬된다. 다른 응용 프로그램을 소스로 절개 한 후 근육을 나누는 것은 최선의 선택의 난입니다n은 많은 경우. 단, 근육의 조각들은 균질화 2-5 액체 질소 또는 기계적 연마 기술에 따라 분쇄를 사용하기에는 너무 작다. 근육 세포 외 매트릭스 단백질과 수축 포장 높은 조직 구조이기 때문에, 불충분 한 기계적 균질화 이후 DNA, RNA 또는 단백질의 낮은 수율로 이끈다. 여기에 자세한 방법은 여러 응용 프로그램에서 사용하기위한 하나의 소스 근육에서 조직의 소량을 허용하고, 냉동 절편 바늘 분쇄의 포함은 더 나은 RNA 수율 기계적 균질화을 향상시킨다.

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프로토콜

모든 동물의 절차는 동물 사용 프로토콜 A2013 07-016 (비들)에서 조지아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다.

미 정착 골격근 1. 냉동 보존

  1. 예비
    1. 약 (작은 사각형 면도날과 (약 1cm X 1cm)에 코르크를 잘라 소스 마우스와 근육을 식별하고, 매우 얕은 컷을 만들기 위해 2 메틸 부탄에 내성이 좋은 팁 마커 코르크에 쓰기 상면 전역 1mm). 조직을 배향에 사용할 컷에 플라스틱 커버 슬립을 삽입합니다. 모든 조직이 동결 보존 될 수 있도록 코르크가 준비 될 때까지 반복합니다.
    2. 액체 질소, 2- 메틸 부탄, 삽입 수지, 저온 온도계, 코르크, 해부 도구 및 연구 마우스를 얻습니다.
      주의 : 액체 질소가 가열되면 폭발 할 수 있습니다 압축 된 가스이다. NI 액체 처리 할 때 실험실 코트, 저온 장갑 및 안면 보호구를 착용트로겐; 피부 접촉 또는 눈 화상이나 동상의 원인이 될 수 있습니다. 2- 메틸 부탄은 가연성, 독성, 건강과 환경에 위험이 있습니다. , 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 보호 안경)을 착용 흄 후드에서 주식 컨테이너를 열고, 밀폐 할 수있는 별도의 용기에 (일반적으로 200 ~ 400 ml)에 동결에 필요한 작은 금액을 전송하고 흡입을 방지 .
    3. 마취하에 안락사의 승인 된 방법으로 쥐를 안락사. 간단히, 이소 플루 란 기화기에서 산소 2.5 %의 이소 플루 란과 흡입 챔버에 마우스를 삽입, 마우스 후 20 초는 페달 반사를 확인하기 위해 이동 멈출 때까지 기다립니다. 페달 반사가 음수 인 경우, 자궁 경부 전위 (6)에 의해 연구 마우스를 안락사.
      참고 : 안락사의 방법은 기관 윤리위원회의 승인을 필요로합니다.
    4. 피부 말단 사지 위에 놓인를 제거하고 잘 포인트 disse와 발목 위의 말단 앞쪽에 힘줄을 잘라ction 위. 미세 집게로 말초 힘줄을 잡고 근육을 풀어 측면의 밴드를 절단하면서 부드럽게 당겨 무릎을 향해. 무릎에서 수직 근육을 당겨 TA 근육 7을 절제하는 최종 컷을합니다.
      주 : TA 근육은 예를 들어 여기에 사용되지만, 사용자의 실험 목적에 적합한 경우, 임의의 마우스 골격근이나 심장이 프로토콜에서 TA로 대체 될 수있다. 유일한 제한은 조직이 그 깊이에 걸쳐 급속 냉동 보존을 달성하기 위해 충분히 작아야한다는 것이다; 1cm × 1 cm의 최대 조직의 크기를 권장합니다.
    5. 반대 다리에 반복 수집 할 다른 조직을 해부하다. 동결 전에 조직 분해를 제한하기 위해 가능한 한 빨리 절개를 수행한다.
    6. 동양의 미리 라벨링 코르크에 가로 섹션에 대한 각각의 근육. 코르크 및 근육 내선의 상단을 터치 말단 건과 코르크에 근육을 수직 스탠드멀리 끝나는 coverslip에 의해 수직으로 개최했다.
    7. 바람직하게는 소스 동물의 euthanization 경과 5 분 만 확실히 이상 15 분의 시간 내에, 절개 후 가능한 한 빨리 조직 학적 분석을 위해 모든 조직을 Cryopreserve.
  2. 냉동 보존
    1. 해부의 종료 전에 동결 목욕 다섯 분을 냉각 시작합니다. 약 3 cm의 깊이로 열린 금속 비커에 2 메틸 부탄을 따르십시오. 2-4 cm의 깊이로 절연 용기에 액체 질소를 부어. 액체 질소에 2- 메틸 부탄의 비커를 설정; 질소는 비등하기 시작합니다. 2 메틸 부탄 비커에 질소 튀는을 피하십시오.
      주의 : 흄 후드 또는 환기가 잘되는 곳에서 목욕을 동결 준비합니다.
    2. 온도를 모니터링 및 냉각도 보장하기 위해 포크로 자주 저어 2 메틸 부탄에 저온 온도계를 삽입합니다. 교반을 계속하고 시원한까지 2 나thylbutane는 필요에 따라 외부 조에 새로운 액체 질소를 추가 -140 ° C에 도달한다.
      참고 : -140 ° C가 가로 무늬 근육에 얼음 결정 아티팩트를 최소화하기 위해 최적의 온도가; 다른 조직은 다른 온도에서 가장 cryopreserve있다 (예를 들면, 뇌, -90 ° C).
    3. 이 코르크을 충족하고 즉시 -140 ° C에서 2 메틸 부탄에 코르크를 드롭 근육의 50 % - 만 하부 (35)에 삽입 수지를 적용합니다. 급속 동결 배치 당 최대 8 개의 조직에 대해 반복합니다. 조직을 응고 -2- 메틸 부탄에 동결되지 않도록 비커의 바닥을 긁어, 30 초 동안 교반한다.
    4. 포크를 사용, 2 메틸 부탄에서 각 조직 코르크를 끌어 숟가락 또는 큰 집게를 슬롯. 신속하게 커버 슬립을 제거 비커에 초과 2 메틸 부탄을 가볍게 두 드리, 다음 외부 질소 욕조에 조직 코르크를 놓습니다. 비커에 남아있는 모든 코르크에 대해 반복합니다.
    5. 액체 질소 나에 드라이 아이스에 전송 샘플저장을 위해 -80 ° C 냉장고.
    6. 어떤 조직을 냉동 보존을 위해 남아있는 경우, 반복 1.2.4에 1.2.3 단계를 반복합니다. -140 ° C에 필요하고 다시 차가운 외부 화장실에 비커 또는 액체 질소에 추가로 2 메틸 부탄을 추가합니다. 유해 폐기물 등의 사용이 메틸 부탄 폐기하십시오.

2. 조직학 및 RNA 응용 프로그램에 대한 저온부를 수집

  1. 예비.
    1. 분석 균형에 DNase의 /의 RNase없는 멸균 튜브를 미리 무게. 그런 다음, 사전 냉각하기 위해 저온 유지 챔버로 이동합니다. 모든 풀링을 동결 절단 (Cryosections) 샘플을 수집하는 튜브가 준비가 될 때까지 반복합니다.
    2. 골격 근육 절편의 경우, 저온 유지 챔버 온도가 내부 온도에 의해 -21 -22 ° C가 있는지 확인합니다. 챔버 내로 절단 조직과 어떤 콘테이너를 전송하고 상기 용기 (들)이 개방 전에 최소 15 분 동안 저온 유지 온도로 평형을 허용한다.
    3. 새로운 일회용 저온 유지 장치 블레이드를 삽입. 대안으로,의 RNase의 오염 제거 용액 스프레이, 기존의 블레이드를 제거 DDH 2 O 씻어하고 냉각하는 저온 유지 장치에 다시 삽입합니다. 70 % 에탄올로 깨끗한 조직 스프레이 조심스럽게 블레이드와 블레이드 클램핑 플랫폼을 닦으십시오.
      1. 의 RNase의 오염 제거 용액 깨끗한 조직 스프레이 및 저온 유지 브러쉬를 닦습니다. , DDH 2 O와 조직 스프레이 다시 브러쉬를 닦아 깨끗한 표면에 저온 유지 장치 실에서 그들을 설정합니다.
        주의 : 저온 유지 장치 블레이드를 사용하지 않을 때는 칼 가드에 포함되어야한다. 또한 RNA 분해 효소 염액은 독성 냉 저온 유지 챔버에서 침전물을 형성하도록 고정된다. 따라서, 취급에주의하고 저온 유지 장치 실에서의 사용을 피하십시오.
    4. 그라 이오 스탯 챔버 내에서 한 푼도 크기 드롭 따뜻한 시편 척에 수지를 매립 (약 300 μl를) 배치, 아래로 수지의 상단을 눌러에 조직 코르크를 설정 한 다음 FR에 척을 설정레일 또는 가능한 경우 빠른 동결 요소에를 eezing.
    5. 매립 수지 응고 (흰색) 한 후, 조직의 하위 35 %의 주위에, 코르크의 상단에 추가 매립 수지를 추가하고 더 나은 조직을 안정화하는 빠르고 동결에 대한 매립 수지에 열 추출기를 누릅니다. 수지가 완전히 경화 할 수 있도록 절편 전에 5 분을 기다립니다.
    6. 시편 클램프가 가장 후퇴 위치 블레이드에서 가장 멀리에 있는지 확인합니다. 시편 클램프로 조직 표본 척을 삽입합니다.
  2. 동결 절단 (Cryosections) 준비.
    1. 블레이드 캐리어 홀더를 풀고 10 ° (또는 사용되는 블레이드 캐리어에 적합한 각도)에 블레이드의 여유 각을 설정하고 다시 조입니다. 브레이크를 해제하고 블레이드쪽으로 근육을 낮추기 위해 핸드 휠을 돌립니다. 조직과 블레이드 사이의 가장 가까운 거리를 추정하고 멀리 블레이드에서 조직을 이동하고 핸드 휠 브레이크를 작동시킵니다.
    2. 높이 조정 LEVE를 풀고티슈의 단부는 블레이드 더 이상 약 2 mm 인 경우, R은 각각 앞뒤로 블레이드 캐리어 이동 또는 블레이드가 조직에 충돌하는 경우. 조 및 블레이드에서 거리를 확인하기 위해 다시 조직을 낮 춥니 다. 블레이드의 시각적 평가에 의한 조직의 단부로부터 1 내지 2 mm가 될 때까지 조정을 반복한다.
    3. 블레이드 향해 조직을 내리고 횡단면에 대한 조직의 각도를 평가합니다. 핸드 휠 잠금 및 표본 클램프 레버를 놓습니다. 시편 클램프가 왼쪽 또는 오른쪽으로 조직의 수평 방향이 블레이드에 수직이 될 때까지 밀어 넣습니다.
    4. 그 조직 절편은 근육의 장축에 수직 한 것 때문에 "Y"방향을 조정 다운 시료가 밀거나 클램프. 시편 클램프 레버를 조입니다.
    5. 그냥 블레이드에 닿을 때까지 시편을 사전에 코스 및 미세 앞으로 피드를 사용합니다. 특정 조직 깊이에서 섹션을 추구하는 경우 (제로 섹션 두께의 합을 재설정조직의 맨 위).
    6. 30 μm의에서 섹션 두께 트림 기능에 저온 유지 장치를 설정합니다. 잘라 내기 및 조직 모음의 미리 선택된 깊이에 도달 할 때까지 섹션을 폐기 (예를 들어, 위에서 400 μm의).
  3. RNA 추출을위한 저온부를 수집합니다.
    1. 수집 섹션의 관을 열고 블레이드 캐리어 근처에 배치합니다. 이 블레이드에서 절단 각 섹션을 선택하고 튜브로 동결 절단 (Cryosections)를 전송하기 위해 사전 냉각, 깨끗한 브러쉬를 사용합니다. 풀링 된 부분이 30 mg의 무게 또는 원하는 조직의 깊이에 도달 할 때까지 반복합니다.
      참고 : - 40 mg의 성인 마우스 경골근의 경우, 약 400 μm의 4,000의 조직 깊이에서 수집은 일반적으로 25을 산출한다. 섹션 스틱과 금속 표면에 응집하는 경향이 금속 집게를 사용하는 것은 권장되지 않습니다 포집 관에 섹션을 전송합니다.
    2. 수지를 포함하는 근육을 동결 절단 (Cryosections)을 둘러싸는 경우, 핸드 브레이크를 잠그고에 면도날을 사용하여근육의 상단 주위에만 얇은 층이있을 때까지 수지의 작은 조각을 면도. 블레이드와 항상 절단 수지가 떨어져 근육에서 각도.
      NOTE 실질적 하류 RNA 제제를 손상하지 않는 수지를 포함하는 박막. 두꺼운 포함 수지가 존재하는 경우, 포집 관에 동결 절단 (Cryosections)를 이동하기 전에 떨어져 근육에서 그것을 애타게 브러쉬를 사용합니다.
    3. 또한, 포집 관에 대량의 블레이드 캐리어 및 전송에 풀 섹션.
      주 : 그러나,이 방법은 느린 경향이 있고, 절 스틱 이후 단계에서 바늘 균질화 효율을 감소시킬 수있는, 서로 응집 가능성이 높다.
    4. 신속하게 분석 균형과 기록 튜브 무게로 풀링을 동결 절단 (Cryosections) 튜브를 배치합니다. 즉시 -20 ° C에 가까운 부분의 온도를 유지하도록 냉각 저온 유지 챔버로 튜브를 반환한다. 풀링 된 부분의 중량을 계산한다.
      참고 : RNA 분리가 광고에서 발생하는 경우ifferent 일, -80 ° C에서 사용할 때까지 풀링을 동결 절단 (Cryosections) 튜브를 저장합니다.
  4. 조직학에 대한 저온부를 수집합니다.
    1. 미세 절편 및 사용 화살표가 7 μm의 (또는 다른 적절한 섹션 두께, 일반적으로 6 μm의 10)에 저온 유지 장치 섹션의 두께를 설정하는 부분 두께 버튼을 누릅니다.
      주 : 얇은 부분 (6 ~ 10 ㎛) 조직 절편의 깊이 침투 할 수있는 염색 시약을 보장하기 학적 용도에 사용한다. 얇은 부분은 저온 절편 중에 깊이에서 채취 할 수 있지만 조직 깊이 증가 수지를 매립하여 조직 학적 염색을 방해하지 않기 때문에보다 깊은 부분이 바람직하다.
    2. 잘라 내기 및 일관성, 심지어 조직 표면을 얻기 위해 4 ~ 7 절을 폐기합니다. 조직의 깊이를 기록합니다.
    3. 단면을 잘라내어이를 블레이드 담체의 표면 상에 배향. 신속하고 부드럽게 따뜻한 (실온) 현미경 슬라이드를 터치하여 섹션을 선택블레이드 캐리어의 섹션. 실온에 슬라이드를 돌려줍니다. 원하는 슬라이드 수를 얻을 때까지 계속합니다. 최종 조직 깊이를 기록합니다.
      참고 : 각 조직에 대한 두 번째 (중복) 섹션을 수집하는 것이 좋습니다.
    4. 전체 절편으로, 핸드 휠 브레이크를 후면 대부분의 위치로 표본을 반환하고, 조직 척을 제거합니다. 시편 척에 조직 코르크를 들고 삽입 수지를 용융하기 위해 저온 유지 장치 열 요소를 사용합니다. 조직 코르크를 제거 티슈로 건조 및 저장으로 돌아갑니다.
    5. 나머지 각 조직에 대한 단계 2.1.2에서 반복합니다. 마지막으로 조직을 설치 한 후 슬라이드를 20 분 동안 건조하도록 허용합니다. 필요한 때까지, 슬라이드 상자에 -80 ° C에서 조직 학적 또는 면역 염색 또는 동결에 대한 슬라이드를 사용합니다.

풀링 저온부 3. RNA 분리

  1. RNA 추출
    1. 얼음에 풀 저온부의 이동 튜브 (들). 즉시 추가50 mg의 동결 절단 (Cryosections)의 중량 당 약 1 ml의 시약, 통상적으로 튜브 당 600 μL의 비율로 유기 RNA 추출 시약.
      주의 : RNA 분리 시약은 독성, 부식성, 자극적이다. 안전 취급에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
    2. 18 게이지 바늘로 1 mL를 주사기를 사용하여 RNA를 추출 액체를 위로 당기고 모든 조직이 용액에 현탁 될 때까지, 튜브 벽을 헹군다. 바늘 균질화하는 동안 공기 방울을 최소화하려고합니다.
    3. 튜브 벽에 부착하는 덩어리 진 저온부와 조각 매쉬와 분산 바늘의 끝 부분을 사용합니다. 씹다 다섯 스트로크 바늘을 통해 아래 샘플을 전달하여 균질화 한 다음 얼음에 샘플을 반환합니다. 덩어리 전부를 중단하고 바늘을 쉽게 통과 할 샘플을 필요로 모두 3 ~ 5 번 또는 여러 번 단계를 반복한다.
    4. 18 게이지 바늘을 제거하고 22 게이지 바늘로 교체합니다. 조심스럽게 TR다섯 스트로크 샘플을 iturate 한 다음 얼음에 샘플을 반환합니다. 매우 미세하게 분산 된 조직 파쇄을 달성하기 위해 분쇄를 서너 번 반복.
      참고 : 조직 입자가 샘플을 그릴 때 바늘을 차단하기 시작하면, 주사기에서 모든 샘플을 추방하고 다시 더 균질화를위한 18 게이지 바늘로 전환합니다. 25 또는 26 게이지 바늘로 추가 분쇄 공정을 최대 수율로 수득하기 위해 추가 될 수있다. 샘플 유출의 우려가 있으므로 그러나 바늘이 막힐 수있다.
    5. 얼음 상온에 샘플을 이동합니다. 분자 복합체를 방해하기 위해 5 분 동안 품어.
    6. 흄 후드에서, 튜브 당 사용 RNA 분리 시약 1 ㎖ 당 1- 브로 모 -3- 클로로 펜탄 (BCP) (단계 3.1.1) 0.1 ㎖, 통상 60 μL를 추가한다. (하지 소용돌이을) 15 초 동안 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어. 2 ~ 3 분 동안 실온에서 샘플을 인큐베이션. 그런 다음, 12,000 XG에 15 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기.
      주의: BCP는 가연성 및 독성. 흄 후드 취급와 장갑, 실험실 코트 및 보호 안경을 착용하십시오.
    7. 조심스럽게 상 수상 (무색)를 포함하는 RNA를 수집하고 깨끗한 튜브로 전송할 수 있습니다. 70 % (DEPC 물) 에탄올과 혼합하는 소용돌이의 동일한 볼륨을 추가합니다. 최대 10 분 동안 실온에서 인큐베이션.
      참고 : 중간 계면 낮은 페놀 BCP 단계는 제조업체의 지침에 또는 적절한 폐기 페놀 BCP 유해 폐기물 용기에 수집 따르면, 각각의 게놈 DNA 및 단백질에 대한 처리 할 수 ​​있습니다.
  2. RNA 정화.
    1. 8 작은 변화와 바인딩 샘플, 세척 및 용출에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. 예를 들면 :
    2. 단계 3.2.4를위한 따뜻한 사전 37 ° C 형 목욕이나 인큐베이터에 DNase의 /의 RNase가없는 물을 나누어 놓습니다.
    3. 정제 컬럼 위 3.1.8에서 RNA 샘플을 추가하고 15 초 동안 샘플을 원심 분리실온에서 12,000 XG에. 동일한 열하고 다시 원심 분리기에 다시 통해 흐름을 따르십시오. RNA 바인딩 극대화, 다음을 통해 최종 흐름을 폐기하는 하나의 추가 시간을 반복합니다.
    4. 제조업체의 지침 8 항에 세척 단계를 수행합니다. 12,000 XG에 15 초 동안 열을 세척 버퍼 700 μL (아무 에탄올), 스핀을 적용을 통해 흐름을 폐기하십시오.
    5. 12,000 XG에 15 초 동안 컬럼 (에탄올) 세척 완충액 500 μL, 스핀을 추가를 통해 흐름을 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.
    6. 막을 건조 12,000 XG에서 1 분 동안 빈 컬럼 스핀.
    7. 깨끗한 RNA 분해 효소, DNase의 무료 관에 스핀 컬럼을 전송합니다. 열 멤브레인의 중심 (3.2.1)에서 미리 예열 DNase의 /의 RNA 분해 효소가없는 물을 40 μl를 추가합니다. 실온에서 2 분 동안 배양 한 후 12,000 x g에서 2 분간 원심 분리.
      참고 : 40 μL 용출 볼륨은 원래의 밀리그램 당 약 1.3 μL입니다풀 저온부 30 mg을위한 조직. 다른 시작 조직 무게에 대한 적절한 용출 볼륨을 조절하지만, 32 μL 이하로 감소하지 않습니다. 원 조직의 밀리그램 당 약 0.7 μL를 사용하여 두 번째 용출은, 총 RNA 수율을 증가시키기 위해 첨가 될 수있다.
    8. 분광 광도계, 전기 및 / 또는 bioanalyzer하여 농도 및 순도에 대한 RNA (컬럼 용출)을 분석. 이러한 정량적 PCR 4 역전사 같은 다운 스트림 애플리케이션에 필요할 때까지 -80 ° C에서 RNA를 저장합니다.
      참고 : DNase를 처리 다운 스트림 응용 프로그램에서 RNA를 사용하기 전에 권장합니다. 이 처리는 다음 칼럼 용출이 특정한 지점에서의 세척 단계 전에 일부 RNA 정제 컬럼에서 수행 또는 하류 어플리케이션의 첫 단계로 RNA의 분취 액에있을 수있다. RNA를 몇 년 동안 안정해야한다.

면역 형광 Stainin 4. 조직 학적 분석근육 저온부의 g

  1. 간단한 면역 프로토콜입니다.
    1. 각 슬라이드에 섹션의 그룹을 서클에 소수성 펜을 사용합니다. 조심스럽게 조직을 만지지 않도록 조심하면서, 동그라미 영역에 (큰 표면적을 500 μL까지 작은 면적 약 80 μl를) PBS를 놓습니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
      참고 : 냉동 슬라이드를 사용하는 경우, -80 ° C의 냉동고에서 슬라이드를 제거하고 20 ~ 30 분 해동 건조 후 위와 같이 진행 상온에서 부화. 두 개 이상의 슬라이드가 필요하다 : 하나의 실험 슬라이드 일차 및 이차 항체 배양 할; 일차 항체에 대한 하나의 제어 슬라이드는 "차 전용"제어를 제외됩니다.
    2. PBS를 부어 슬라이드 팁. 원 지역 PBS (차단 솔루션)에 5 % 당나귀 혈청을 추가; 근육 부분이 건조하지 않도록주의해야합니다. 습도 챔버 내에서 몇 시간까지 30 분 동안 실온에서 인큐베이션 (또는).
    3. 근육 재생을 분석하는 일차 항체 솔루션을 준비합니다. eMHC 항체 (1시 40분)와 ColVI 항체 (1,000 일)와 솔루션을 차단 섞는다. 각각 소형, 중형, 또는 대형 슬라이드 영역에 대한 300 ㎕를 500 μl를 약 150 μl를 준비합니다. 소용돌이 5 초 후 어떤 침전물을 펠렛 15,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리.
    4. 실험 슬라이드를 들어, 솔루션을 차단 부어 다음 4.1.3에서 일차 항체 솔루션을 추가 할 슬라이드를 팁. 보조 제어 슬라이드, 솔루션을 차단 부어하고 신선한 차단 솔루션 (아무 항체)를 추가 할 슬라이드를 팁. 4 ° C에서 하룻밤 습도 챔버에서 슬라이드를 품어.
      주 : 슬라이드에 항체 용액을 피펫 팅 할 때, 항상 관의 바닥에서 임의의 침전물을 방해하지 않는 차 항체 용액 튜브의 상부로부터 액체를 당긴다.
    5. 팁 솔루션을 부어 슬라이드. 씻어 각 슬라이드의 동그라미 영역에 PBS의 적하 추가 팁 부어오프 후 더 PBS를 추가하고 3 ~ 5 분 동안 품어. 세 세척의 총 반복합니다.
      주 : 세척 시간은 매우 유연하고 원하는 경우 20 분까지 연장 할 수 있습니다. 일반적으로, 용액 수가 변경 시간보다 더 중요하다.
    6. DAPI 핵 10,000 희석 : 마우스의 IgG1 (eMHC)와 토끼의 IgG (ColVI) 1을 검출하는 빨간색과 녹색 형광 결합 된 이차 항체의 500 희석 : 1을 사용 (보조 제어 슬라이드를 포함하여) 모든 슬라이드에 대한 이차 항체 솔루션을 준비 얼룩.
      1. 예를 들어, DAPI의 1:10 희석을 만들기 위해 DDH 2 O 9 μL와 DAPI의 1 μl를 섞는다. 그런 다음, 500 μl의 최종 볼륨, 솔루션을 차단 447.5 μL 1:10 DAPI의 1.0 μl를 1.0 + 항 - 마우스의 IgG1 붉은 ㎕의 항 - 토끼 IgG의 녹색 + 0.5 μl를 추가합니다. 소용돌이는 침전물을 펠렛 15,000 XG에서 2 분 동안 혼합하고 원심 분리한다.
        참고 : 이상적으로, 모든 보조 항체는 동일한 호스트 종에서해야한다.
    7. 마지막 PBS 세척을 부어 슬라이드 팁. 모든 조직을 포함하는 이차 항체 솔루션을 추가합니다. 빛으로부터 보호하고, 실온에서 30 분 동안 배양 슬라이드 커버.
      참고 : 모든 이차 항체가 이중 라벨 실험에서 다른 종과 최소한의 교차 반응성을 가지고 확인해야합니다.
    8. 4.1.5에 설명 된대로 슬라이드를 씻으십시오. 마지막 세척 후, PBS를 붓고 조직에 슬라이드를 설정하는 슬라이드 팁. 하나의 측면을 따라 수성 장착 미디어의 3 ~ 4 방울을 추가합니다.
    9. 단지 실장 매체의 외주에 유리 커버 슬립의 가장자리를 설정한다. 집게 사용, 천천히, 다음, 조직을 향해 커버 슬립을 낮추는 커버 슬립을 해제하고 부드럽게 위치로를 누릅니다. 마지막으로, 부드럽게 안정을 위해 커버 슬립의 각 모서리를 누르십시오.
    10. 사용까지 4 ° C에서 빛과 가게에서 슬라이드를 보호합니다.
      주 : 장기 저장을 위해, 일의 가장자리 매니큐어의 박층을 적용전자 coverslip에 건조에서 슬라이드를 방지합니다.
  2. 조직 학적 평가.
    1. 이미지 적절한 필터와 함께 epifluorescent 또는 공 초점 현미경을 사용하여 슬라이드 eMHC (빨간색)를 검출하는 단계; ColVI (녹색); 그리고 일반적으로 20 배 목표 1,5를 사용하여, 핵 (파란색) DAPI 염색.
    2. 실험 슬라이드에서 형광 신호가 eMHC 및 ColVI 검출 4의 특이성을 보여주기 위해 이차 제어 슬라이드 다르다는 것을 확인합니다.
      참고 : eMHC 긍정적 인 재생 섬유가 근육 부상 후 가변 근이영양증 생쥐에 약 2 ~ 7 일에서 볼 수 있어야합니다. 콜라겐 VI 근육 섬유 혈관 및 신경 주변 세포 외 기질 및 수술 주변과 epimysium의 더 큰 결합 조직 번들로 존재한다. DAPI 핵 얼룩은 근육 섬유의 재생을 나타내는 주변 핵 대 중앙 핵와 섬유, 그리고 난의 존재를 식별하는 데 유용합니다세포를 nfiltrating. 괴사 또는 부상 섬유로 인해 손상된 근육 세포막을 통해 섬유를 관통 내생의 IgG의 검출에 마우스 IgG 이차 항체로 약하게 염색 할 수 있습니다.
    3. 재생을 정량화하기 위해, 화상 전체에 걸쳐 각각의 형광 필터를 중첩 현미경 사진을 촬영. 전체 섹션 1.5의지도를 재구성하는 사진을 정렬 한 후 각 위치에 대한 eMHC, ColVI 및 DAPI 이미지를 병합합니다.
    4. 분석 소프트웨어를 사용하여, 포지티브 eMHC 섬유의 수가 최근 재생 (100 * (# eMHC + 섬유 / # 총 섬유))를 계산하는 전체 섬유의 개수를 카운트. 또한, (100 * (# CN + 섬유 / # 총 섬유)) -1,5- 긴 기간 동안 재생을 측정하기 위해 총 섬유의 중앙에서 핵 섬유의 개수를 카운트.

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결과

근육을 동결 절단 (Cryosections)의 RNA는 품질이 높고, 대부분의 응용 프로그램에 충분한 수율을 제공합니다

여섯 골격근 RNA 제제의 분석은 8 대조군 마우스로부터 풀링 경골근 (TA) 근 19.4 41 mg의 사용 표 1에 나타낸다. 모두 좌측 (L) 및 우측 (R) TA 근육이 방법을 이용하여 근육 손상을 일으킬 삼일 식염수 또는 10 μM의 cardiotoxin 25 μL의 길이 근육 주사 후 채취 근육 재생 실험에서 제조 된 이전에 1을보고 하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 근육 동결 절단 (Cryosections)의 RNA에 대해 A260 / 280 비를 대표 샘플이 전형적으로 가깝거나 더 높다. "순수한"RNA는 2.2 / 2.0 및 A260...

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토론

과잉 수지가 풀 저온부의 수집 속도가 느려집니다 및 RNA 분리에 수지 오염을 포함 증가시킬 수 있기 때문에이 방법으로 최상의 결과를 얻으려면, 조직 냉동 보존하는 동안 근육의 낮은 세 번째 또는 절반으로 제한 수지를 포함 유지. 또한, 바늘 균질화 동안 세심한주의 수율을 최대화하고, 바늘 막힘 가능성을 최소화하는 것이 중요하다. 프로토콜은 니들이 차단 방해물을 제거하기 위해 높은 압력이 필요로 될 경우의 샘플 손상을 방지하기 위하여 루어 코리아 주사기를 사용하여 변형 될 수있다. 25 또는 26 게이지 바늘과 바늘 추가적인 균질화 단계는 상기 RNA 수율을 향상 할 수있는 미세 조직 현탁액을 생성하기 위해 첨가 될 수있다. 클로로포름은 BCP 대체 할 수 있지만 BCP 덜 독성 및 RNA (12)의 유기 추출 동안 수성 단계에서 게놈 DNA 오염의 낮은 수준의 결과로,이 권장되지 않습니다. 증가균질화 덜 효율적입니다으로 풀링 저온부 μm의 30의 단면 두께는 사용하지 않는 것이 좋습니다.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre, Junna Luan이 기술 지원을 제공했습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 지원을 받았습니다(수상 번호 AR065077). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
코르크VWR Scientific23420-708날카로운 칼날로 작은 사각형으로 자릅니다.
플라스틱 커버슬립Fisher Scientific12-547얼어붙는 동안 근육의 방향을 잡는 데 사용됩니다.
저온 온도계VWR Scientific89370-158
2-메틸부탄시그마M32631-4L주의: 위험한 화학 물질. 가연성 캐비닛에 보관하십시오.
임베딩 레진: "cryomatrix"Thermo Fisher Scientific6769006다른 임베딩 레진으로 cryomatrix를 대체할 수 있습니다.
저온 유지 장치Thermo Fisher Scientificmicrom HM550(일회용 블레이드 캐리어 포함작동하는 모든 저온 유지 장치가 프로토콜에 충분해야 합니다.
일회용 저온 유지 장치 블레이드Thermo Fisher Scientific3052835사용할 저온 유지 장치에 적합한 블레이드 또는 나이프를 사용하십시오.
RNAse 오염 제거 솔루션: "RNase Zap"ThermoFisher ScientificAM9780
분석 저울Mettler ToledoXS64
페인트 브러시Daler Rowney214900920냉동 절편을 처리하는 데 사용합니다. 간단한 미술 용품이 있는 상점에서 찾을 수 있습니다.
면도날VWR Scientific55411-050
현미경 슬라이드VWR Scientific48311600
RNA 유기 추출 시약: TRIzolThermo Fisher Scientific15596026주의: TRIzol은 유해 화학 물질입니다. 참고: 골격근에서 RNA를 추출하는 데는 유기 추출 시약만 권장됩니다.
18 게이지 바늘VWR ScientificBD305185
22 게이지 바늘VWR ScientificBD305155
26 게이지 바늘VWR ScientificBD305115선택 사항입니다. RNA 추출 프로토콜에서 3차 시료 분쇄에 사용할 수 있습니다.
1 ml 주사기VWR ScientificBD309659매우 높은 가치의 샘플의 경우 Luer-Lok 주사기를 권장합니다 (><예 : < / i>, VWR BD309628).
1-브로모-3-클로로펜탄(BCP)시그마B9673
DEPC 물에 70% 에탄올: 200 프루프 알코올Decon Laboratories, Inc.+M18027161M35ml 200프루프 알코올 + 15ml DEPC 물을 섞습니다.
DEPC 물 중 70% 에탄올: DEPC 처리된 물Thermo Fisher ScientificAM992235ml 200프루프 알코올 + 15ml DEPC 물을 혼합합니다.
RNA 정제 키트: PureLink RNA minikitThermo Fisher Scientific12183018ARNA 준비의 마지막 단계.
DNase/Rnase-free 물 Gibco10977DEPC 처리수도 사용할 수 있습니다.
분광광도계: Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222정제된 RNA를 처리하여 다운스트림 적용 전에 DNA 오염을 제거합니다.
성 펜Thermo Fisher Scientific8899
Dulbecco의 PBS,Gibco14190PBS, 면역형광 프로토콜용.
당나귀 세럼Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121제조사의 지시에 따라 일반 당나귀 세럼 재고를 재수화하고, 면역형광을 위해 분취액을 5%로 희석하십시오.  일반 염소 혈청도 사용할 수 있습니다.
eMHC 항체University of Iowa Developmental Studies Hybridoma BankF1.652
Collagen VI 항체Fitzgerald Industries#70R-CR009x
당나귀 안티 토끼 AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
염소 안티 마우스 IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4',6- 디아미디노-2-페닐린돌)Thermo Fisher ScientificD1306
수성 장착 매체: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FM페이드 방지 특성이 있는 형광 애플리케이션용으로 설계된 장착 매체만 사용하십시오.
유리 커버슬립VWR Scientific16004-314면역형광 프로토콜 끝에 슬라이드 장착에 사용
이미지 분석 소프트웨어: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express 또는 고급 제품프리웨어 ImageJ도 수동 카운팅에 사용할 수 있습니다. 세분화 준수 기능이 있는 고급 소프트웨어는 프로세스의 부분 자동화를 허용할 수 있습니다. 예: , ImageProPremier.
섹션 이미지 병합 및 매핑: PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659가 중단되었습니다. 심독소에 대한 다른 옵션은 EMD Millipore #217503; 미국 사용자 정의 화학 공사 # BIO0000618; 또는 Ge 스크립트 # RP17303; 그러나 이것들은 검증되지 않았습니다.
역전사 키트: Superscript III First-strand synthesis systemThermo Fisher Scientific18080051검증된 고품질 역전사 시약을 사용할 수 있습니다.
표준 PCR: GoTaq Flexi 중합효소 시스템PromegaM8298검증된 고품질 Taq 중합효소 시스템을 사용할 수 있습니다. DNA 염기서열분석이 PCR의 모든 애플리케이션 다운스트림에 사용되는 경우, 대신 고충실도 PCR 시스템을 사용해야 합니다.
SYBR greenThermo Fisher ScientificS7585전용 qPCR 마스터 믹스를 사용하지 않을 때 qPCR에 사용합니다. SuperROX(Applied Biosystems 기기용) 및 GoTaq Flexi 중합효소 및 완충액과 함께 사용할 수 있습니다.
ROX: SuperROX, 15 mMBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX는 PCR 반응에서 더 안정적이므로 ROX(카르복시-X-로다민)보다 qPCR 수동 참조 염료로 사용하는 것이 바람직합니다. Applied Biosystems 기기를 사용한 qPCR의 경우
Real-time PCRApplied Biosystems7900HT
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