마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

Summary

MicroScale Thermophoresis(MST)는 압타머-표적 상호 작용을 특성화하는 민감한 기술입니다. 이 원고는 압타머-소분자 상호작용을 특성화하기 위한 MST 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

결합 친화도, 화학량론 및 열역학과 같은 기본 결합 매개변수 측면에서 분자 상호 작용의 특성화는 기초 및 응용 과학에서 필수적인 단계입니다. MST(MicroScale Thermophoresis)는 이 중요한 정보를 얻기 위한 민감한 생물물리학적 방법입니다. 온도 구배를 통한 분자의 이동을 설명하는 thermophoresis라는 물리적 효과에 의존하는 이 기술은 용액의 결합 매개변수를 빠르고 정확하게 결정할 수 있도록 하고 완충액 조건(완충액에서 용해물/혈청까지)을 자유롭게 선택할 수 있도록 합니다. MST는 결합되지 않은 분자가 결합 파트너와 복합체에 있는 분자와 다른 열영동 움직임을 나타낸다는 사실을 사용합니다. 열영동 운동은 크기, 전하 및 수화 껍질의 변화로 인해 분자 상호 작용의 순간에 변경됩니다. 두 결합 파트너의 서로 다른 분자 비율의 운동 프로파일을 비교함으로써 결합 친화도(pM 대 mM)와 같은 정량적 정보를 결정할 수 있습니다. 압타머와 작은 화합물과 같은 작은 크기의 분자 간의 까다로운 상호 작용도 MST로 연구할 수 있습니다. DH25.42 DNA 압타머와 ATP 간의 잘 연구된 모델 상호 작용을 사용하여 이 원고는 압타머-소분자 상호 작용을 특성화하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 연구는 MST가 매우 민감하며 7.9kDa DNA 압타머의 결합 부위를 ATP의 아데닌에 매핑할 수 있음을 보여줍니다.

Introduction

분자 사이의 상호 작용은 자연의 기초가된다. 따라서, 기본 및 응용 연구의 많은 분야에서 과학자들은 서로 다른 종류의 분자 상호 작용의 기본 원리를 이해하려고합니다. 마이크로 열 영동 (MST)는 버퍼의 자유로운 선택으로, 용액에서 분자 상호 작용의 빠르고 정확한 비용 효율성 및 품질 제어 특성을 수행하는 과학자들 수 있습니다. 여러 결합 파트너 ^1-8으로 이벤트 유효성 검사, 경쟁 분석, 실험을 결합, 도서관 검사를 포함한 분석의 다른 종류를, 기술, 혼자 2016에서 MST를 사용하여 1,000 개 이상의 출판물이 이미 있습니다. 일반적으로, MST는 분자 상호 작용의 어떤 종류의 결합 친화 (mM의 PM), 화학 양론, 열역학, 같은 고전적인 바인딩 매개 변수에 대한 연구를 허용합니다. MST의 큰 장점은 상호 작용 파트너의 크기의 독립적 인 바인딩 이벤트를 공부할 수있는 기능입니다. 심지어 chal같은 작은 분자, 약물, 항생제, 또는 대사 산물로 같은의 작은 핵산 앱 타머 사이의 상호 작용 (NT를 15 ~ 30) 및 목표 정량화 할 수있다.

현재 최첨단 기술은 압 타머 - 대상의 상호 작용이 실험실 강렬하고 매우 복잡한 중 하나입니다 특성화 또는 앱 타머 - 작은 분자가 ^9,10의 상호 작용을 정량화하는 데 실패합니다. 플라즈몬 공명 (SPR)를 분석 ^{(11, 12)} 및 등온 적정 열량계 (ITC) ^{13 ~ 15,} 등용 매 용리 ¹⁶ 평형 Fi를 여과에 ^{17, 18으로} 진정으로 라벨없는 열량 접근 방식을 기반 표면에 라인 ^19, 겔을 프로빙 분석을 이동, stopped- FL 흐름 FL uorescence 분광법 ^{(20, 21),} 형광 이방성 (FA) ^{22, 23,} 단일 분자 FL uorescence 영상 ^{24, 25,} 및 바이오 층 간섭 (BLI) ^(26)는 압 타머 - 작은 분자와 부정확 또는 호환되지 않는 중 하나입니다 상호 작용. 기타 principa이러한 방법의 리터 문제는 낮은 민감도, 높은 샘플 소비, 고정, 표면에 대량 전송 제한 및 / 또는 버퍼 제한됩니다. 이러한 기술의 몇 응집 흡착 효과에 대한 통합 제어를 제공합니다.

MST 과학자 단백질 ^30-33로서 앱 타머 및 소분자 ^27-29 사이의 상호 작용뿐만 아니라 다른 대상을 연구하는 이러한 한계를 극복하기위한 강력한 도구를 나타낸다. 이 기술은 온도 구배를 통해 분자의 움직임에 의존한다. 라고하는이 감독 운동 "열 영동는"분자 ^{(34, 35)의} 크기, 비용 및 수화 쉘에 따라 달라집니다. 분자에 대한 리간드의 결합을 직접 변경 thermophoretic 이동성 결과 이들 파라미터 중 적어도 하나를 변경한다. 작은 크기와 리간드가 결합 된 상태로 결합되지 않은에서 크기 변화의 측면에서 상당한 영향을 미칠하지 않을 수 있습니다,하지만 그들은 닥터를 가질 수 있습니다 수화 쉘 및 / 또는 충전 amatic 효과. 결합 파트너와의 상호 작용 후 분자의 thermophoretic 운동의 변화는 기본 바인딩 매개 변수 ^{2,7,34,36,37의} 정량화 할 수 있습니다.

도 1a에 도시 된 바와 같이, MST 장치는 형광 검출과 같은 광학 장치를 이용하여 유리 모세관 내 샘플 상에 초점 적외선 레이저로 구성된다. 레이저 온도 구배 (2-6 ℃의 ΔT)을 설정하면서 tryptophans ⁶ 또는 형광 표지의 상호 작용 파트너의 ^3,8의 고유의 FL uorescence 통한 단백질의 thermophoretic 움직임 모니터링 할 수있다. 공간 ΔT에서 생성 된 온도 차이는 Soret 의해 정량화 될 수있다 고온의 영역에서 공핍 또는 분자의 축적에 이르게 COEF 효율적인 인터넷 (S _T)

g "/>

C _고온 가열 영역의 농도를 나타내고, C _{감기 초기} 저온 영역에서의 농도이다.

도 1b는 각자의 시간 척도에 의해 분리 될 수있는 여러 단계들로 구성된 MST 운동 프로파일 (시간 추적)에서 전형적인 MST 실험 결과에 도시 된 바와 같이. 초기 형광 정확한 시작 형광을 정의하고 또는 photoenhancement photobleaching에 대해 확인하기 위해 온도 구배의 부재에서 제 5 초 단위로 측정된다. 온도 점프 (T-점프)하는 형광 변화 thermophoretic 운동 전에 위상을 나타냅니다. 형광이 초기 감소는 양자 수율 uorophore 플로리다의 열 의존적 변화에 따라 달라집니다. 열 영동 상 인해 정상 분포까지 분자의 운동 thermophoretic 형광이 감소 (또는 증가)에 도달 한 다음.레이저가 꺼진 후 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 역 TJump와 플로리다 uorescent 분자의 수반 다시 확산 관찰 할 수있다. 기본적인 결합 매개 변수를 액세스하기 위해, 상호 작용 파트너의 상이한 몰비를 분석 및 비교된다. 광학 표시 분자가 일정하게 유지되고, 표지 된 리간드의 양의 증가와 함께 공급되는 반면, 일반적으로 16 개의 다른 비율 번 MST 실험에서 연구되었다. 두 결합 파트너 간의 상호 작용은 열 영동의 변화를 유도하고, 따라서 표준화의 FL uorescence에서는, 다음과 같이 계산된다 F _규범 :

F _뜨거운 F _감기는 MST 추적의 드 Fi를 NED 시점에서 플라이 uorescence 강도 평균 나타냅니다. 결합 친화도 (K _d 또는 EC ₅₀ 값) CURV 의해 계산 될 수있다E 피팅 (도 1C).

전반적으로, MST는 어떤 종류의 분자 상호 작용을 연구하는 강력한 도구입니다. 그리고 25-NT의 짧은 ssDNA를 앱 타머 DH25.42 (7.9 kDa의)이 원고는 작은 분자 아데노신 트리 포스페이트 (0.5 kDa의 ATP) 사이의 도전적인 상호 작용을 특성화하기위한 프로토콜을 제공합니다. 원고의 과정 동안, ATP 분자의 앱 타머의 결합 부위는 ATP의 아데닌 그룹에 아래로 매핑됩니다.

Protocol

앱타 머는 작업 증권 1. 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 100 μm의 최종 농도에 도달, 물 (참조 ^18에서 5-Cy5에-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, 순서) 올리고 뉴클레오티드를 녹인다.
2. 버퍼를 결합 200 nm의에 올리고 뉴클레오티드 주식을 희석하여 앱 타머 작업 솔루션을 준비합니다 (20 mM 트리스, 산도 7.6, 300 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl _2, 0.01 % 트윈 20).
3. 90 ℃에서 2 분 동안 혼합 배양 한 샘플을 즉시 얼음에 식혀 실온에서 시료를 사용한다.

리간드 희석 시리즈 2. 준비

1. ) SAM (각 리간드 (아데노신 트리 포스페이트 (ATP), 아데노신 디 포스페이트 (ADP), 아데노신 모노 포스페이트 (AMP), 아데닌, 구아노 신 트리 포스페이트 (GTP), 시토신 트리 포스페이트 (CTP), 아데노신 트리 포스페이트 (dATP 존재) 및 S-아데노 실 메티오닌 10 mM의 스톡 각)는 16 단계 직렬 diluti 준비에 200 ㎕를 마이크로 반응 튜브.
   참고 : 집계를 제거하는 데 도움이 될 수 14,000 XG에서 5 분 리간드 주식의 원심 분리. 낮은 볼륨, 낮은 결합 반응 튜브는 튜브 벽 분자의 흡착을 방지하는 것이 좋습니다.
2. 추정 친화력보다 적어도 50 배의 최대 농도로 시작하여 각 희석 단계에서 50 % 리간드 농도를 감소시킨다.
   참고 : 제어 소프트웨어로 구현 농도 측정기 도구는 데이터 바인딩을 시뮬레이션하고 희석 시리즈에 적합한 농도 범위를 찾는 데 도움이됩니다.
3. 16 마이크로 반응 튜브에 2 앱 타머 바인딩 버퍼의 10 μl를 추가 튜브 1의 리간드 재고 (10 mM)을 20 μl를 입력합니다.
4. 이전 10 관 2 관 (1)의 μl의 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 적절하게 혼합한다. 다음 튜브에 10 μL를 전송하고 나머지 관이 희석을 반복합니다.
5. 마지막 튜브에서 10 μl를 초과 폐기하십시오. 어떤 B를 피하십시오uffer 희석 효과. 튜브 1 및 튜브 2-16의 버퍼가 동일해야합니다.

최종 반응 믹스 3. 준비

1. 피펫 팅의 오차를 최소화하도록 각각의 결합 20 μL의 부피와 반응 (앱 타머 작업 용액 + 각 리간드 희석액 10 ㎕를 10 μL)을 준비한다. 만 4 μL의 볼륨은 모세관 LL Fi에 SUF 과학 효율적인이다.
2. 각 리간드 희석의 10 μL에 200 nm의 앱 타머 작업 용액 10 μl를 추가로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 적절하게 혼합한다.
3. 샘플에 모세관을 담가 모세관 기준으로 샘플 LL 실온 인터넷에서 5 분간 샘플을 인큐베이션. 긴 배양 시간은 약간의 상호 작용에 대한 필요가있을 수있다; 그러나, 5 분은 대부분 적합합니다. NOT 광학 측정이 수행 될 중간 부분에 만 측에 모세 혈관을 터치합니다.
4. 일 상 모세 혈관을 배치전자 모세관 트레이와 MST 장치를 시작합니다.

4. MST 장치 시작

참고 :이 장치는 두 개의 사전 설치된 소프트웨어 패키지, 생성 된 데이터의 해석을위한 소프트웨어 '' ''분석 제어 실험 조건과의 기술적 설정을위한 소프트웨어 '를 "제공합니다.

1. 산악 표준시 장치에 모세관 트레이를 배치하기 전에 제어 소프트웨어를 시작하고 '드롭 다운 메뉴' ''온도 조절에서 "수동 온도 제어를 가능하게 '선택하여 전체 원하는 온도를 조정합니다. 이 방법으로 25 ° C의 온도를 조정합니다.
   참고 : MST 악기 온도 조절 45 ° C에 22에서 할 수있다.
2. 예상 수준에 도달하는 온도 기다린 다음 MST 장치에 모세관 트레이를 배치합니다.
3. Cy5에 염료은 "빨간색 ''에 LED 채널을 설정하고 FL uorescenc 얻을 수있는 LED 전력을 조정표준 센서와 MST 장치 300 1,000 형광 단위의 전자 신호를 출력한다. 25 % LED 전원이 연구에 사용된다.
   참고 : 6,000 18,000 형광 단위 고감도 센서와 MST 권장합니다.

5. 모세관 스캔

1. "컨트롤"소프트웨어에 대한 모세관의 위치를 ​​선택하고 클릭하여 샘플의 다른 품질의 측면을 확인하는 모세 혈관 검사를 수행합니다 "캡 스캔을 시작" 산악 표준시 측정을 시작하기 전에.
2. 형광 향상 / 담금질 및 소프트웨어의 고집 효과 (피크를 U 자형 또는 평평)의 모세관 스캔을 검사합니다.
   참고 : 탐지 및 형광 처리 및 접착 효과에 대한 자세한 정보는 토론에서 찾을 수 있습니다.

6. MST 측정

참고 : MST 측정을 시작하기 전에 제외해야합니다 고집 효과, 강화 / 담금질 효과, 또는피펫 오류 및 모세관 스캔이 플라이 uorescence 신호가 SUF 과학 효율적인 있음을 나타냅니다 있는지 확인합니다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.

1. . '제어'소프트웨어의 각 모세관 위치로 희석 시리즈 리간드 농도 할당 앱타 머는 리간드와 혼합 희석 단계 고려 (1 : 1).
2. 모세관 # 1에 대한 리간드의 높은 농도 (5 mm)를 입력 올바른 희석 유형을 선택합니다 (여기서, 1 : 1), 최대 농도를 클릭하고 자동으로 모세 혈관의 나머지 농도 # 2를 할당하는 드래그 기능을 사용 16. 가장 낮은 농도는 152.6 ㎚이다.
3. 제어 소프트웨어의 각 부분의 FL uorescent 앱 타머 (여기서, 100 ㎚)의 농도를 입력한다.
4. 5 초 동안의 FL uorescence 검출의 기본 설정을 사용하여 30 초 동안 MST를 기록하고, 상기 레이저 t의 비활성화 후 상기 5 초 동안 형광을 기록 O 분자의 확산을 다시 모니터링한다.
5. 제어 소프트웨어의 각 부분에 20 %의 레이저 파워를 조정한다.
   주 : 위해 최상의 신호 대 잡음비를 수신하고 비특이적 효과를 방지하기 위해서는 20 내지 40 %의 레이저 파워가 권장된다. 특정한 경우에있어서, 고출력 레이저는 비 결합 및 결합 분자의 양호한 분리를 얻기 위하여 요구 될 수있다.
6. 대상 폴더를 선택한 후 실험을 저장하고 '시작 MST 측정 "버튼을 눌러 MST 측정을 시작합니다.
   주 : .ntp 파일을 대상 폴더에 생성됩니다. 이 설정을 사용하여, 하나의 측정은 10 ~ 15 분 동안 지속됩니다.
7. EC의 값이 _50보다 정확한 판정을 위해 적어도 두 실험 절차를 반복한다.
   참고 기술의 재현성을 시험하기 위해서, 동일한 모세관 스캔 할 수 수회 (기술 반복).

7. MST 데이터 분석

NT "> 주 : 분석 소프트웨어는 측정 동안 플라이에서 데이터의 분석을 가능하게 분석 소프트웨어 리간드 농도 ³⁷ 대 MST 시간 추적 및 정규화 플로리다 uorescence (F _놈)의 변화를 나타내는..

1. 산악 표준시 분석 소프트웨어 (MO.Affinity 분석)를 시작하고 대상 폴더에서 .ntp 파일을로드합니다. 데이터 선택 메뉴에서 분석 유형으로 "MST"를 선택합니다.
   주 : 리간드 의존적 형광 효과의 경우, 초기 형광 분석을 위해 선택 될 수있다.
2. 드래그 앤 드롭하거나 각각의 실험 실행 아래의 "+"버튼을 눌러 새로운 분석 각각의 기술 또는 생물학적 실행 (들)을 추가합니다.
3. 실험, MST 추적, 모세 혈관 검사, 모세관 모양, 초기 형광, 표백 속도의 특성에 대한 정보를 얻기 위해 각각의 실험 실행 아래 정보 버튼을 누릅니다.
   참고 :이 원시 데이터 수 등그래서 분석 이후 단계에서 검사 될 수있다.
4. 시각적으로 볼 범프와 스파이크로 응집 및 침전 효과에 대한 MST 추적을 검사합니다.
   참고 : 검색 및 통합 효과의 처리에 대한 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
5. 시각적으로 평평하게 또는 U 자 모양의 봉우리로 보이는 모세 혈관 검사 및 흡착 효과 모세관 모양 오버레이를 검사합니다. 시각적으로 모세관 검사 및 형광 효과에 대한 초기 형광을 검사합니다. 시각적 효과를 photobleaching에 대한 표백 속도를 검사합니다.
6. 용량 반응 모드로 전환하고, 각각의 버튼을 누름에 의해 "전문가"모드 분석 설정을 변경. 산악 표준시 평가 전략으로 "T-점프"를 선택합니다.
7. 곡선 Fi를 tting에 대해 "힐"모델을 선택합니다. 바인딩 매개 변수가 자동으로 계산됩니다. 은 "결과를 비교"메뉴 정규화의 각 유형을 선택하여 데이터를 정규화한다. 내보내.XLS 또는 .PDF 등 중 데이터.
   참고 : 바인딩 그래프 아래의 표는 계산 된 바인딩 매개 변수를 요약 한 것입니다.

Results

본 연구에서는, MST는 ATP의 DH25.42 DNA 앱 타머 ^(18)의 결합 부위의 특성을 적용 하였다. ATP 또는 임의로 하나 이상의 형광 ^38-40 표지 단백질과 소형 분자 ATP를 흉내 낸의 상호 작용의 특성을 다른 연구와 대조적으로, 본 연구에서는 5 '말단에 한 Cy5의 분자와 7.9 kDa의 ssDNA를 앱 타머에 표지 된 버전을 포함 . 다른 ATP 유도체 및 관련 분자는 다양한 위치에서 ATP 상이한 모두는 ATP 분자의 결합 부위를 매핑하는데 사용되었다. 다른 리간드 (각각 50 %로 리간드 농도를 감소시키는 단계 (16)에서) 일련의 희석을 준비하고, Cy5에 표지 된 압 타머의 일정량과 혼합 하였다. 샘플은 25 LED %, 20 %의 레이저 전력 표준 모세관 분석 하였다. 이동 프로파일 (MST 시간의 흔적)을 기록하고, T-점프 단계에서 파생 된 형광 단위, 리간드 CONCENTR 대 꾸몄다했다ATIO...

Discussion

품질 관리 :

비특이적 부착 / 표면에 시료 물질뿐만 아니라, 응집 효과를 흡착, 선호도 데이터의 품질에 큰 영향을 미친다. 그러나, 몇 최첨단 기술을 모니터링하고 이러한 효과를 방지하기 정확하고 빠른 옵션을 제공합니다. MST 감지하고 기술적 인 설치의 단계적 최적화를 허용, 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 통합 된 품질 관리를 제공합니다. 응집 / 침전 효과 (단계 7.7)의 이동 프로파일 모니터링 할 수있는 반면 점착 형광 효과에 대한 중요한 정보는 모세관 스캔 모세관 형 (5.2 내지 7.5 단계)에서 추출 될 수있다. 이러한 컨트롤은 데이터 품질의 지속적인 개선을 가능하게하고 프로토콜의 중요한 단계를 나타냅니다.

흡착 효과와 문제 해결의 검출 :

모세관 스캔은 주로 INI로 실시은 최초 단계는 위에 형광을 스캔하여 트레이 홀더에 모세 혈관의 위치를 ​​확인합니다. 각 피크는...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aptamer 결합 완충액			20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
형광 표지된 ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		서열: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10mM 재고 용액 저장 위치 - 20°C; C
ADP	시그마 알드리치, 독일	A2754	10mM 재고 용액 저장 위치 - 20°C; C
AMP	시그마 알드리치, 독일	A2252	10mM 재고 용액 저장 위치 - 20°C; C
아데닌	시그마 알드리히, 독일	A8626	10 mM 재고 용액 저장 위치 - 20 ° C
SAM	시그마 알드리히, 독일	A7007	10mM 재고 솔루션 저장 위치 - 20°C; C
dATP	Sigma Aldrich, 독일	11934511001	10mM 저장 용액 - 20°C; C
CTP	시그마 알드리치, 독일	C1506	10mM 저장 용액 저장 위치 - 20°C; C
GTP	시그마 알드리치, 독일	G8877	10mM 재고 용액 보관 위치 - 20°C; C
모노리스 NT.115	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일	MO-G008	Blue/Red Channel MST 장치(표준 검출기 포함), Monolith NT115 pico는 고감도 검출기
Monolith NT.115 모세관	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일	MO-K002
Eppendorf PCR 튜브	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith 제어 소프트웨어.2.1.33, 사전 설치 장치	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일
Kaleidagraph 4.5.2	시너지 소프트웨어