마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

요약

MicroScale Thermophoresis(MST)는 압타머-표적 상호 작용을 특성화하는 민감한 기술입니다. 이 원고는 압타머-소분자 상호작용을 특성화하기 위한 MST 프로토콜을 설명합니다.

초록

결합 친화도, 화학량론 및 열역학과 같은 기본 결합 매개변수 측면에서 분자 상호 작용의 특성화는 기초 및 응용 과학에서 필수적인 단계입니다. MST(MicroScale Thermophoresis)는 이 중요한 정보를 얻기 위한 민감한 생물물리학적 방법입니다. 온도 구배를 통한 분자의 이동을 설명하는 thermophoresis라는 물리적 효과에 의존하는 이 기술은 용액의 결합 매개변수를 빠르고 정확하게 결정할 수 있도록 하고 완충액 조건(완충액에서 용해물/혈청까지)을 자유롭게 선택할 수 있도록 합니다. MST는 결합되지 않은 분자가 결합 파트너와 복합체에 있는 분자와 다른 열영동 움직임을 나타낸다는 사실을 사용합니다. 열영동 운동은 크기, 전하 및 수화 껍질의 변화로 인해 분자 상호 작용의 순간에 변경됩니다. 두 결합 파트너의 서로 다른 분자 비율의 운동 프로파일을 비교함으로써 결합 친화도(pM 대 mM)와 같은 정량적 정보를 결정할 수 있습니다. 압타머와 작은 화합물과 같은 작은 크기의 분자 간의 까다로운 상호 작용도 MST로 연구할 수 있습니다. DH25.42 DNA 압타머와 ATP 간의 잘 연구된 모델 상호 작용을 사용하여 이 원고는 압타머-소분자 상호 작용을 특성화하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 연구는 MST가 매우 민감하며 7.9kDa DNA 압타머의 결합 부위를 ATP의 아데닌에 매핑할 수 있음을 보여줍니다.

서론

분자 사이의 상호 작용은 자연의 기초가된다. 따라서, 기본 및 응용 연구의 많은 분야에서 과학자들은 서로 다른 종류의 분자 상호 작용의 기본 원리를 이해하려고합니다. 마이크로 열 영동 (MST)는 버퍼의 자유로운 선택으로, 용액에서 분자 상호 작용의 빠르고 정확한 비용 효율성 및 품질 제어 특성을 수행하는 과학자들 수 있습니다. 여러 결합 파트너 ^1-8으로 이벤트 유효성 검사, 경쟁 분석, 실험을 결합, 도서관 검사를 포함한 분석의 다른 종류를, 기술, 혼자 2016에서 MST를 사용하여 1,000 개 이상의 출판물이 이미 있습니다. 일반적으로, MST는 분자 상호 작용의 어떤 종류의 결합 친화 (mM의 PM), 화학 양론, 열역학, 같은 고전적인 바인딩 매개 변수에 대한 연구를 허용합니다. MST의 큰 장점은 상호 작용 파트너의 크기의 독립적 인 바인딩 이벤트를 공부할 수있는 기능입니다. 심지어 chal같은 작은 분자, 약물, 항생제, 또는 대사 산물로 같은의 작은 핵산 앱 타머 사이의 상호 작용 (NT를 15 ~ 30) 및 목표 정량화 할 수있다.

현재 최첨단 기술은 압 타머 - 대상의 상호 작용이 실험실 강렬하고 매우 복잡한 중 하나입니다 특성화 또는 앱 타머 - 작은 분자가 ^9,10의 상호 작....

프로토콜

앱타 머는 작업 증권 1. 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 100 μm의 최종 농도에 도달, 물 (참조 ^18에서 5-Cy5에-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, 순서) 올리고 뉴클레오티드를 녹인다.
2. 버퍼를 결합 200 nm의에 올리고 뉴클레오티드 주식을 희석하여 앱 타머 작업 솔루션을 준비합니다 (20 mM 트리스, 산도 7.6, 300 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl _2, 0.01 % 트윈 20).
3. 90 ℃에서 2 분 동안 혼합 배양 한 샘플을 즉시 얼음에 식혀 실온에서 시료를 사용한다.

리간드 희석 시리즈 2. 준비

1. ) SAM (각 리간드 (아데노신 트리 포스페이트 (ATP), 아데노신 디 포스페이트 (ADP), 아데노신 모노 포스페이트 (AMP), 아데닌, 구아노 신 트리 포스페이트 (GTP), 시토신 트리 포스페이트 (CTP), 아데노신 트리 포스페이트 (dATP 존재) 및 S-아데노 실 메티오닌 10 mM의 스톡 각)는 16 단계 직렬 diluti 준비에 200 ㎕를 마이크로 반응 튜브.
   참고 : 집계를 제거하는 데 도움이 될 수 14,000 XG에서 5 분 리간드 주식의....

결과

본 연구에서는, MST는 ATP의 DH25.42 DNA 앱 타머 ^(18)의 결합 부위의 특성을 적용 하였다. ATP 또는 임의로 하나 이상의 형광 ^38-40 표지 단백질과 소형 분자 ATP를 흉내 낸의 상호 작용의 특성을 다른 연구와 대조적으로, 본 연구에서는 5 '말단에 한 Cy5의 분자와 7.9 kDa의 ssDNA를 앱 타머에 표지 된 버전을 포함 . 다른 ATP 유도체 및 관련 분자는 다양한 위치에서 ATP 상이한 모두는 ATP 분자의 결합 부위를 매핑하는데 사용되었다. 다른 리간드 (각각 50 %로 리간드 농도를 감소시키는 단계 (16)에서) 일련의 희석을 준비하고, Cy5에 표지 된 압 타머의 일정량과 혼합 하였다. 샘플은 25 LED %, 20 %의 레이저 전력 표준 모세관 분석 하였다. 이동 프로파일 (MST 시간의 흔적)을 기록하고, T-점프 단계에서 파생 된 형광 단위, 리간드 CONCENTR 대 꾸몄다했다.......

토론

품질 관리 :

비특이적 부착 / 표면에 시료 물질뿐만 아니라, 응집 효과를 흡착, 선호도 데이터의 품질에 큰 영향을 미친다. 그러나, 몇 최첨단 기술을 모니터링하고 이러한 효과를 방지하기 정확하고 빠른 옵션을 제공합니다. MST 감지하고 기술적 인 설치의 단계적 최적화를 허용, 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 통합 된 품질 관리를 제공합니다. 응집 / 침전 효과 (단계 7.7)의 이동 프로파일 모니터링 할 수있는 반면 점착 형광 효과에 대한 중요한 정보는 모세관 스캔 모세관 형 (5.2 내지 7.5 단계)에서 추출 될 수있다. 이러한 컨트롤은 데이터 품질의 지속적인 개선을 가능하게하고 프로토콜의 중요한 단계를 나타냅니다.

흡착 효과와 문제 해결의 검출 :

모세관 스캔은 주로 INI로 실시은 최초 단계는 위에 형광을 스캔하여 트레이 홀더에 모세 혈관의 위치를 ​​확인합니다. 각 피크는.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Aptamer 결합 완충액			20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
형광 표지된 ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		서열: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10mM 재고 용액 저장 위치 - 20°C; C
ADP	시그마 알드리치, 독일	A2754	10mM 재고 용액 저장 위치 - 20°C; C
AMP	시그마 알드리치, 독일	A2252	10mM 재고 용액 저장 위치 - 20°C; C
아데닌	시그마 알드리히, 독일	A8626	10 mM 재고 용액 저장 위치 - 20 ° C
SAM	시그마 알드리히, 독일	A7007	10mM 재고 솔루션 저장 위치 - 20°C; C
dATP	Sigma Aldrich, 독일	11934511001	10mM 저장 용액 - 20°C; C
CTP	시그마 알드리치, 독일	C1506	10mM 저장 용액 저장 위치 - 20°C; C
GTP	시그마 알드리치, 독일	G8877	10mM 재고 용액 보관 위치 - 20°C; C
모노리스 NT.115	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일	MO-G008	Blue/Red Channel MST 장치(표준 검출기 포함), Monolith NT115 pico는 고감도 검출기
Monolith NT.115 모세관	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일	MO-K002
Eppendorf PCR 튜브	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith 제어 소프트웨어.2.1.33, 사전 설치 장치	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, 뮌헨, 독일
Kaleidagraph 4.5.2	시너지 소프트웨어

이 있는 MST 장치입니다. 표준