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방법 논문

쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

14.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55078

⸱

2017년 1월 12일

 ,  , 
1Department of Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Health System, 2Department of Urology, National University Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 암컷 C57BL / 6J 마우스의 종양 성장을 모니터링 뮤린 동소 방광 종양의 발생을 설명한다.

초록

이 프로토콜은 전립선 특이 항원 (PSA)를 분비하도록 변형 된 뮤린 방광암 세포주 MB49을 사용하여 암컷 C57BL / 6J 마우스에서 방광 종양의 생성을 설명하고, 종양 주입의 확인 절차. 간단히, 마우스는 주사제를 사용하여 마취하고 지느러미 위치에 배치하게된다. 소변은 방광 비게하고 폴리 -L- 라이신 (PLL) 50 μL를 천천히 24 G IV 카테터를 사용하여 10 μL / 20 s의 속도로 주입된다. 이는 카테터 stoppering 20 분 동안 방광에 남아있다. 카테터를 제거하고, PLL은 방광에 부드러운 압력 비게된다. 이는 쥐 방광암 세포주를 10 μL / 20 s의 속도로 (1 × 105 세포 / 50 μL)의 점적 따른다. 카테터는 조기 탈출을 방지하는 마개를한다. 1 시간 후, 마우스를 반전 약물 부활되고, 블래 더는 비게된다. 느린 점적 율이 중요이 종양은 상부 요로 및 신장에서 발생 될 수 있습니다 방광 요관 역류를 줄일 수있다. 세포주 잘이 주입 후 종양 크기 불균일을 초래할 수 있기 때문에, 세포의 응집을 감소시키기 위해 재현 탁한다.

이 기술은 고효율 종양을 유도한다. 종양의 성장은 소변 PSA 분비에 의해 감시된다. PSA 마커 모니터링 방광 종양의 존재의 검출을위한 초음파 또는 형광 이미징보다 더 안정적이다. 방치하면 사주 - 마우스의 종양은 일반적으로 약 3가 최대 크기에 부정적인 영향 상태에 도달한다. 종양의 성장을 모니터링하여,이를 성공적으로 종양이 주입되지 않은 것들로부터 경화 된 생쥐를 차별화시킬 수있다. 단지 종점 분석으로, 후자는 실수 요법으로 치료 된 것으로 간주 될 수있다.

서론

이 방법의 목적은 쥐 정위 방광 종양을 생성하기 위해 종양 이식없이 생쥐가 종점 분석에서 경화 된 것으로 생각되지 않도록, 가능한 한 정확하게 주입 된 종양을 모니터하는 것이다. 전반적으로, 상기 방법은 분석을 위해 실험 쥐의 다수의 필요성을 감소 및 치료 학적 성과를 결정하는데 큰 정확성을 보장한다 도시.

이식 종양 세포를 피하 임상 질환의 환경 요점을 되풀이 또는 치료 전략의 개발을 가능하게하지 않기 때문에 암에 대한 동 소성 모델의 개발이 중요하다. 블래 더의 구조는 직접 최소 전신 효과 방광 방광암 치료의 점안을 허용한다. 따라서, 이러한 소성을 모델로이 환경을 요점을 되풀이 동물 모델, 새로운 치료법을 평가하는 것이 중요하다. 모든 실험 장치에서 도출 된 결론은 dependen된다모델의 제한시 t.

몇 가지 기술은 쥐에서 동소 방광 종양의 생산을 위해 개발되었다. 이는 방광의 글리코 사 미노 글리 칸 층을 손상 주입 될 종양 세포 활성화에 의존한다. 사용 된 기술은 블래 1,2- 한 부위에서 종양 발생을 선도, 방광 벽에 손상 단일 지점 결과 전기 소를 포함한다. 그러나, 전기 소를 사용하여 종양 이식 성공률 오퍼레이터 의존적 10 변하는 - 90 %, 그리고 복강 현상 종양 선도 방광벽 천공 될 것이라는 위험을 포함한다. 화학 소작은 질산은, 손상 방광 벽 (3)을 사용하여 수행된다. 유사하게, 산 방광 벽 (4)를 손상하는 데 사용되어왔다. 트립신은도 5와 블래 더를 손상하는 데 사용되어왔다. 이러한 방법은 방광에 하나 이상의 종양의 개발에 발생할 수 있습니다.화학 물질이 너무 오래 방광 벽과 접촉하여두면 또한, 방광에 심각한 손상의 우려가있다. Ninalga 등의 알이 개발 한 방법. 양전하 폴리 -L- 라이신 (PLL) 코트 방광 벽에 6 분자를 사용한다 이는 방광의 글리코 사 미노 글리 칸 층을 고집 음전기 종양 세포 수있다. 이 방법은 일반적으로 방광 현상 이상의 종양을 초래하지만, 종양 이식 80에서 인 - 100 % 4,7. 기술적으로는 수행 할 수있는 가장 쉬운 방법이기도하다. 개발 종양도 상당히 크기되도록, 상기 종양 세포를 이식하기 전에 큰 덩어리로 분류되지 않는 것이 중요하다.

치료 효능을 평가하기 위해, 상당히 유사한 크기의 종양을 가진 마우스에서 본 연구를 수행하는 것이 최상이다. 따라서, 주입 직후 종양 크기를 정량화 할 수있는 좋은 검출 시스템이 중요하다. 몇 가지 전략은 꿀벌이여기서 n은 종양을 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 자기 공명 영상 (MRI) 8-10 형광 11, 12, 13, 생물 발광, 초음파 (14)과 효소 면역 분석법 (ELISA) (15, 16)을 포함한다. MRI와 초음파 종양 세포의 수정이 필요하지 않지만, MRI 민감한 장비 및 대조 제제에 대한 필요성이 존재한다. luminescence-, fluorescence- 및 ELISA 기반 분석은 다음 방법에 의해 검출 될 수있는 마커 단백질을 발현하는 종양 세포의 수정을 요구한다. 발광 들어, 기판은 루시퍼 라제 활성의 검출을 위해 필요하다; 따라서, 추가 단계와 비용 증가가있다. 모두 발광 및 형광 전문 장비가 필요합니다. 형광을 생성하기 위해 산소 분자에 의해 촉매되는 녹색 형광 단백질 (GFP) 고리가 필요하다. 따라서, GFP 발현이 다소 불안정하게 마커 산소 액세스에 따라 종양 덩어리 내에 가변적 17. 대리 마커 다른 전략으로 뮤린 방광암 세포주 MB49의 변형은 전립선 특이 항원 (PSA) (15, 16)를 분비한다. 이러한 마커 또한, 실험 종료시 종양의 존재를 확인하고 그들에게 면역 대안을 만드는 다른 수단을 제공한다. 본 연구는 동소 이식 종양의 PLL 방법을보고하고 종양 검출 시스템, 즉 ELISA 형광 및 초음파 영상의 비교를 나타낸다.

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프로토콜

싱가포르 국립 대학의 동물 사용과 (프로토콜 번호 084/12)를 처리에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 부착 된 모든 동물 작동합니다.

1. 체외에서 MB49-PSA 세포 성장 및 PSA의 분비를 측정

  1. 유지 완료 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 (DMEM), 2 밀리몰 / L의 L - 글루타민의 방광암 세포 MB49-PSA 15 뮤린 및 인큐베이터 0.05 ㎎ / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신 (37)에서 ° C, 5 % CO 2. 200 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B는 PSA 분비 세포의 선택 압력을 유지하기 위해 추가합니다.
  2. PSA 분비 판 6 웰 배양 접시에 1 × 106 세포를 확인하고 48 시간 동안 5 % CO 2 존재 하 37 ℃로 배양.
  3. 이틀 후, PSA 측정을위한 뜨는를 수집합니다.
    1. 파스퇴르 피펫을 사용하면은 한모금을 전송15 ML의 원심 분리기 튜브에 ernatant.
    2. 부동 세포와 파편을 제거하기 위해 250 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에서 30 ° C - 점착성 분석은 다른 날에 수행되는 경우의 상등액을 저장한다. 그렇지 않은 경우, 즉시 다음 단계로 진행합니다.
    3. 인간없는 PSA ELISA 키트를 사용하여 7 PSA 농도를 결정한다.
  4. 도금 세포를 열거합니다.
    1. 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 DMEM의 1 mL로 세포를 씻어. 기음과 완전히 미디어를 제거합니다.
    2. 신선한 매체의 1 mL를 넣고 우물에서 셀을 제거하는 세포 스크레이퍼로 부드럽게 긁어.
    3. 미세 원심 분리 튜브에 세포를 전송하고 단일 - 세포 현탁액을 위해 철저히 다시 중단.
    4. 세포 현탁액과 0.4 % 트리 판 블루 용액의 동일한 볼륨을 섞는다. 혈구를 사용하여 (염료를 차지하지 않습니다) 라이브 세포를 계산합니다.
  5. NG와 PSA 식 계산PSA의 / mL의 미디어 / 10 6 세포. 120 NG / ㎖가 / 106 세포 - 마우스에서의 주입 MB49-PSA 세포의 PSA 식 80이다.

2. ELISA와 실시간 PCR 분석에 의한 PSA 측정의 감도를 결정

  1. 웰 당 1 × 106 세포 (예를 들어, 열 0, 열 1, 열 2, (10)의 최대가되도록 부모 MB49 셀의 상이한 양으로 6 웰 배양 접시에 완전 DMEM 배지에서 플레이트 MB49-PSA 셀 3, 10 4, 10 5, 10 6 MB49-PSA 셀) 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 MB49 셀 각각 106과 배양한다.
  2. 단계 1.3에 설명 된대로 어느 날 이후, PSA 측정을위한 뜨는를 수집합니다. 인간없는 PSA ELISA 키트를 사용하여 7 PSA 농도를 결정한다.
  3. 세포에서 RNA를 추출합니다.
    1. 를 LyseRNA 추출 시약 1 ㎖를 추가하여 직접 접시에 세포.
    2. 실온에서 5 분간 인큐베이션하고, 마이크로 원심 튜브에 세포 용 해물을 전송. 클로로포름 0.2 mL를 넣고 15 초 동안 적극적으로 샘플을 소용돌이. 실온에서 3 분 동안이를 부화.
    3. 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 조심스럽게 계면을 방해하지 않고 새로운 튜브로 위 수성 상 (0.5 ml)에 전송합니다.
    4. 이소 프로필 알코올 0.5 mL를 넣고. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 튜브의 하단에있는 RNA 침전물을 방해하지 않고, 완전히 뜨는을 제거합니다.
    5. 75 % 에탄올 1 mL로 한 번 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기. 모든 에탄올을 제거하고 10 분 동안 공기 건조에 펠렛을 할 수 있습니다.
    6. 클레아없는 물 30 μL의 RNA를 녹여. 너무 증가하여 60 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션lubility.
    7. 260 나노 미터 (A260)에 자외선 (UV) 분광법을 사용하여 흡광도를 측정함으로써 정량 RNA. RNA의 순도를 평가하기 위해, 파장 280nm (A280)에서의 흡광도를 측정하고, 1.6 이상이어야 A260 / A280 비율을 계산한다.
  4. RNA의 2 μg의에서 cDNA를 역 - 전사.
    1. 얼음에 반응 혼합물을 준비하고, 0.2 ㎖의 튜브에 옮긴다.
    2. 간략 내용을 스핀 다운하고, 기포를 제거하기 위해 원심 분리 튜브.
    3. 다음과 같은 조건에서 열 자전거 타는 사람에 튜브를 넣고 역전사를 수행 : 95 ° C에서 5 분 뒤에 37 ° C에서 60 분. 실행이 완료되면, 4 ° C에서 cDNA에 샘플을 유지합니다.
    4. 장기간 저장을 위해 30 ° C -에 샘플을 저장한다.
  5. PSA 및 세포질 베타 액틴을위한 실시간 PCR 분석을 수행합니다. 베타 액틴은 샘플을 정상화하는 데 사용됩니다. 96 웰 괞 찮아에 역 전사 RNA의 100 NG에 대한 분석을 수행테. 세중의 모든 샘플을 분석. 다음 매개 변수를 사용하여 40주기를 수행 : 2 분 50 ° C, 95 ° C에서 10 분에서 변성 95 ° C에서 15 초, 60 ℃에서 1 분. 순환 액 35 (CT)에서의 검출 하한치를 설정; 따라서, 35을 넘어 CT 값을 갖는 임의의 샘플은 검출되지 간주됩니다.

3. MB49-PSA 세포주의 종양 유발 유지

참고 : 체외에서 장시간 성장은 종양 유발의 손실로 연결. 발암를 유지하기 위해, MB49-PSA 세포주는 2 년마다 한 번 이상 마우스를 통해 계대된다.

  1. 세포.
    1. 수확은 기하 급수적으로 멸균 세포 스크레이퍼로 부드럽게 그들을 긁어하여 세포를 성장. 세포 현탁액과 0.4 % 트리 판 블루 용액의 동일한 볼륨을 섞는다. 혈구를 이용하여 생균 수를 계산. 세포의 20 % 이상이 죽은 경우 이식하지 마십시오.
    2. (1 × 10 필요한 생균의 양을 계산107 세포 / ㎖) 및 15 mL의 원심 분리 튜브로 옮긴다. 4 ° C에서 5 분 250 XG에 원심 분리하고 상층 액을 버린다. DMEM 빈 미디어에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 주입하기 전에 FBS의 모든 흔적을 제거하는 세척을 세 번 반복합니다.
    3. 쥐가 이식을위한 준비가 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
  2. 피하 등쪽 측면에 마우스에 종양 세포를 주입.
    1. 체중 10 g을 0.1 mL의 복강 주사 상기 마취제 케타민의 혼합물 메데 토미 (75 밀리그램 / kg 및 1 ㎎ / ㎏, 각각)을 이용하여 4 내지 6 주령의 C57BL6 / J 마우스를 마취.
    2. 피부를 노출 할 수있는 권리 측면을 면도.
    3. 한 쌍의 집게를 사용하여 피하에 24 G 바늘 하부 근육에서 분리하여 세포 현탁액 (1 × 106 세포)를 0.1 mL의 주입 피부를 리프트. 바늘을 제거하면서, 종양 세포가 수행되도록 5 내지 10 초 동안 주사 부위 핀치주사 부위에서 누설되지.
    4. 체중의 10g 당 0.1 mL의에서 atipamezole (1 ㎎ / ㎏)의 피하 주사와 마우스를 부활.
  3. 캘리퍼스를 사용하여 종양의 직경을 측정하여 이틀 종양의 성장을 모니터링합니다. 종양 체적은 "a"는 mm 모두에서 가장 긴 치수 "B"는 수직 폭 인 화학식 V = (AB 2) / 2를 이용하여 계산된다.
  4. 종양 체적은 적어도 50mm 3 (약 7 일) 인 경우, CO 2 마우스를 안락사. DMEM에서 무균 조건에서 멸균 집게와 가위 한 쌍의 장소 종양 덩어리를 절제.
  5. 6 웰 배양 접시에 무균 메스를 사용하여 작은 조각으로 종양 말하다. 또한 종양을 해리하는하는 '유봉'로 1 ML의 주사기 플런저를 사용합니다.
  6. 완전한 DMEM의 3 mL를 넣고 및 유지 보수 세포를 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 % CO 2.
  7. 세포는 작은지면에 부착되면전자 (일 이틀 사이), 멸균 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 흡입하여 미디어, 파편, 비 부착 세포를 제거합니다. DMEM로 두 번 씻으십시오. 세포를 방해하지 않도록주의하십시오.
  8. DMEM 1 ㎖를 추가하고 셀 스크레이퍼로를 긁어하여 세포를 수확. 96 웰 배양 플레이트에 웰 당 혈구와 플레이트 (1) 세포를 이용하여 세포를 계수 선택하고 단일 콜로니를 확장한다. 문화 37 ° C에서 200 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B와 DMEM에있는 세포와 5 % CO 2.
  9. 미디어를 변경하고 매 4 항생제 - 오일. 그들은 약 80~90% 합류에 때까지 세포를 모니터링합니다. 다시 플레이트 피펫 팅하여 24 웰 배양 접시에 세포를 웰로부터 셀을 제거한다.
  10. 24 웰 배양 접시에 세포가 합류되면, 셀 스크레이퍼로 긁어 그것들을 제거하고, 6 웰 배양 플레이트들을 접시.
  11. PSA 분비 다른 클론을 스크리닝, 단계 1에 기재된 바와 같이 높은 PSA 비밀로 클론은 극저온 - 보존이온 및 향후 마우스 실험을 위해 사용합니다.

4. 종양을 주입

참고 : 각 마우스 방광에 50 μL DMEM의 빈 미디어에 1 × 10 5 MB49-PSA 세포 주입된다. 때문에 카테터에 죽은 공간에 항상 여분의 볼륨 (마우스 당 추가로 적어도 100 μL)를 준비합니다. 다른 방법은 Kasman 등에 의해 기술 된 바와 같이, 공기 충전 주사기를 사용하는 것이다. 5 오히려 채워진 주사기보다.

  1. 세포.
    1. 세포가 약 80 % 합류 통로 완전 DMEM 배지에서 MB49-PSA 종양 세포 때 하나 일 주입 전 (10 % FBS, 2 밀리몰 / L L- 글루타민, 0.05 mg의 보충 / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 200 (1)의 분할 비율로 37 ° C에서 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B) 및 5 % CO 2 : 2.
    2. 절차 당일 멸균 셀 스크레이퍼로 부드럽게 스크래핑하여 세포를 수확. 세포 현탁액의 동일한 볼륨을 믹스0.4 %의 트리 판 블루 솔루션입니다. 혈구를 이용하여 생균 수를 계산. 세포의 20 % 이상이 죽은 경우 이식하지 마십시오.
    3. (2 × 106 세포 / ㎖)에 필요한 생균의 양을 계산하고, 15 mL의 원심 분리 튜브로 옮긴다. 4 ° C에서 5 분 250 XG에 원심 분리하고 상층 액을 버린다. DMEM 빈 미디어에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 주입하기 전에 FBS의 모든 흔적을 제거하는 세척을 세 번 반복합니다.
    4. 쥐가 이식을위한 준비가 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
  2. 4- 6 주 된 여성 C57BL / 6J 마우스는 절차 전에 일주일 동안 순응 할 수 있습니다. 모든 동물 연구는 무균 상태를 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되어야한다.
    1. 각 마우스의 무게와 체중의 10g 당 0.1 mL를 복강 마취 (75 ㎎ / ㎏ 케타민 1 ㎎ / ㎏ 메데 토미)을 주입. Bodyweights 17과 22g 사이 여야합니다. 더 RESPO을 관찰하지에 의해 마취 확인NSE 발가락 핀치 후.
    2. 식별을 위해, 이어 펀치를 사용하여 귀를 표시한다.
    3. 수화에 대한 2 시간 - 체중 10 g의 모든 1 당 0.1 mL를 복강 하트만의 솔루션 또는 화합물 나트륨 락 테이트를 주입한다.
    4. 깜박이는 반사가 마취하에 잃고 눈이 건조되기 때문에, 멸균면 전구를 사용하여 두 눈에 멸균 안과 연고를 적용합니다. 필요한 경우 다시 적용합니다.
    5. 체온을 유지하기 위해 (공기와의 접촉에 의해 활성화) 열 팩 위에 종이 타월에 부정사 위치에 마우스를 놓고 아래로 뒷다리를 테이프.
  3. 손가락의 하복부 영역에 부드러운 압력을 적용하여 1.5mL 용량 microcentrifuge 관으로 방광으로부터 소변을 수집한다. 이 샘플은 소변 PSA의 기초 값으로 제공합니다.
  4. 1 ML의 주사기에 멸균 폴리 -L- 라이신 (PLL)를 철회 제거 니들 탐침으로, 24 게이지 IV 카테터를 연결합니다. 카테터 및 기능의 끝 부분에 윤활제를 적용카테터 삽입을 안내하는 집게를 사용하여 방광 내로 요도를 통해 카테터를 ERT. 저항이 느껴질 때 중지합니다. 참고 : 연구자들은 방광 instillations을위한 마취 및 사후 절차 진통제의 사용과 윤활 젤의 사용에 대한 필요성에 대한 자신의 수의학 직원과상의해야합니다.
  5. 방광 요관 역류를 방지하기 위해 18, 10 μL의 20 매의 속도로 천천히 PLL의 50 μL를 주입. 밖으로 흐르는 것을 방지하는 스토퍼 20 분 동안 방광 카테터를 떠난다.
  6. 20 분 후, 카테터를 제거하고 부드럽게 하복부 눌러서 모든 콘텐츠의 방광을 비워야. 빈 1 ML의 주사기를 사용하여 카테터의에서 나머지 내용을 세척하십시오.
  7. 피펫에 의해 철저하게 MB49-PSA 세포를 혼합하고 1 ML의 주사기로를 철회. 카테터를 부착하고 윤활제를 적용합니다. 10 μL 매 20 s의 느린 속도로 1 × 10 5 세포의 50 μL를 주입. 마개를에 교체카테터. 제어 마우스를 식염수 50 μL를 제공합니다.
  8. 1 시간 후, 카테터를 제거하고 내용물의 방광을 비워야. 뒷다리에 테이프를 제거하고 자신의 복부 측면에 마우스를 놓습니다. 체중의 10g 당 0.1 mL로의 반전 약물 (1 ㎎ / ㎏ atipamezole) 주입 피하로 마우스를 부활.
  9. 운동이 관찰 될 때까지 마우스를 모니터링합니다. 자신의 새장에 마우스를 돌려줍니다.
  10. 종양 검출 프로토콜 (섹션 5, 7, 8), CO (2)를 사용하여 마우스를 안락사 완료시. 사후 종양 검출 (6)에 설명되어 있습니다.

ELISA 5. 모니터링 종양 성장

참고 : 종양의 존재와 성장은 소변으로 PSA 분비를 측정하여 마우스에서 모니터링된다. 연구진은 동물의 건강과 웰빙 후 종양 주입 및 인도 엔드 포인트를 모니터링에 미치는 수의학 직원과 상담해야합니다.

  1. 쥐에서 소변을 수집하는 방법은 두 가지가 있습니다.
    1. 분변 물질로 소변을 분리하기위한 개별 대사 케이지에 하나의 마우스를 배치하여 소변 하룻밤를 수집합니다. 셋업 냉장이 없으면 밤새 PSA의 열화를 방지하기 위해 소변 수집 튜브로 프로테아제 억제제 (100 μL)을 추가한다. 그러나, 가능한 대사 케이지의 수는 소변 수집이 방법의 유용성을 제한한다.
    2. 그것은 (예 ABSL2 실처럼) 대사 케이지를 사용하여 논리적으로 불가능하게되는 경우, 단계 4.2에 기재된 바와 같이 쥐를 마취 상태에서 하복부에 약간 힘을 발휘하기 위해 손가락을 사용하여 스팟 소변을 수집한다. 치료가 주입되기 전에 일반적으로 수행됩니다. 우리의 경험에서, 소변 적어도 150 μL은 마취 후 1 시간을 수집 할 수 있습니다.
  2. 즉시 얼음에 수집 된 소변을 배치합니다. 혈뇨는 종양 주입 후 두 번째 주에서 볼 수있다. 매우 용혈 시료는 ELISA 분석에 영향을 미칠 수있다. 따라서 소변얼음에 배치하고 수집 한 후 신속하게 처리해야합니다.
  3. 세포 또는 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 6,700 XG에서 소변 튜브를 원심 분리기.
  4. 새로운 튜브에 소변을 소변 생쥐 간 출력 분취 량의 차이를 정규화하고 분석 키트 (7)를 이용한 ELISA 키트 (7)을 이용하여 PSA 크레아티닌에 대한 분석을 수행 할 때까지 -30 ℃에서 보관한다. 마우스는 PSA를 생성하지 않는 경우에도 ELISA를 이용하여 검출 비특이적 결합의 낮은 수준이있다. 샘플은 포지티브로 간주 될 경우, 임계 값은 정상 마우스 + 3 표준 편차 (SD) 15보다 큰 값으로 설정되어야한다.

실시간 PCR 6. 감지 종양의 존재

  1. 종단에서, 마우스의 복강을 절개하여 방광을 찾을. 방광을 절제하고 cryovial에 배치합니다. 액체 질소에 즉시 동결.
  2. RNA의 extr의 조직을 균질화하여 RNA를 추출액션 시약.
  3. 섹션 2에서 전술 한 바와 같이, PSA에 대한 역전사 실시간 PCR 분석을 수행한다.

형광 이미징 7. 모니터링 종양 성장

  1. 근적외선 형광 염료 (19)를 1 × 107 MB49-PSA 셀 라벨.
  2. 세포가 20 유동 세포 계측법에 의해 생존과 형광을 유지하는 경우 - 재 판과 일 4, 7, 11, 14, 18에 표시된 세포를 수확하고, (21)은 확인합니다.
  3. 섹션 4에서 전술 한 바와 같이, 마우스 방광에 표시된 MB49-PSA 세포 임플란트.
  4. 이틀마다 형광 이미징 시스템을 이용하여 종양 성장을 모니터한다.
  5. 영상의 날에, 무게는 체중의 10g 당 0.1 mL를 복강 주사 상기 마취제 케타민의 혼합물 메데 토미 (75 ㎎ / ㎏ 1 ㎎ / ㎏, 각각)를 사용하여 마우스를 마취.
  6. 피부를 노출시키기 위해 복부를 면도.
  7. 촬상 챔버 내에 마우스를 놓고 취득촬상 시스템에 제공된 소프트웨어를 사용하여 방광의 사진.
  8. 체중의 10g 당 0.1 mL의에서 반전 약물 (1 ㎎ / ㎏ atipamezole) 주입 피하로 마우스를 부활.

고주파 초음파 이미징 8. 모니터링 종양 성장

  1. 섹션 4에서 상술 한 바와 같이 마우스에 이식 종양.
  2. 이틀은 초음파 영상을 이용하여 종양 성장을 모니터링한다.
  3. 영상의 날에, 무게는 체중의 10g 당 0.1 mL를 복강 주사 상기 마취제 케타민의 혼합물 메데 토미 (75 ㎎ / ㎏ 1 ㎎ / ㎏, 각각)를 사용하여 마우스를 마취.
  4. 피부를 노출시키기 위해 복부를 면도.
  5. 24 게이지 IV 카테터를 사용하여 방광 멸균 0.9 % 식염수 100 μL를 주입. 식염수는 방광을 넓히다 및 초음파 이미징 동안 가시성을 향상시킬 수 있습니다.
  6. 초음파 플랫폼에 마우스를 놓고 리터에 전도성 젤을 적용심고 복부.
  7. 피부 휴대용 프로브를 내리고 이미징 플랫폼 (21) 상에 블래 더의 B 모드 화상을 취득.
  8. 체중의 10g 당 0.1 mL를 피하 주입 반전 약물 (1 ㎎ / ㎏ atipamezole)로 쥐를 부활.

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결과

MB49 세포로부터 PSA 분비가 성장 배지로 변화였다. 이 증가 된 PSA 분비 (도 1a)을 초래하기 때문에 MB49-PSA는 DMEM 배지에서 성장시킨다. 점착성 ELISA 실시간 PCR의 감도를 결정하기 위해, MB49-PSA 분비 세포의 다른 번호 MB49 부모 세포와 혼합 하였다. 실시간 PCR 분석은 100 PSA 분비 세포 / 1 × 106 세포 (도 1c)를 검출하면서 PSA ELISA 1 × 105 PSA 분비 세포 / 1 × 106 세포 (도 1b)의 최소값을 검출한다. 따라서, 리얼 타임 PCR ELISA는보다 민감 있지만 전체 블래 더 수행 할 수있다. 이 엔드 포인트 분석의 유틸리티를 제한합니다. 방광 종양 다중 현상 (도 2A)에서 종...

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토론

프로토콜에서 가장 중요한 단계는 1) 성공적 세포주의 발암를 유지하는 단계; 2) 마우스에서 종양 세포의 주입 전에 측정 PSA 분비를 보장; 종양 크기의 변화를 감소 시키도록 3) 주입 한 세포 현탁액을 생성하는 단계; 4) 신장 종양 세포 주입의 결과 방광 요관 역류를 방지하기 위해 느린 속도로 세포를 주입.

체외에서 장시간 통과 한 후, MB49 / MB49-PSA 세포는 쥐에서 종양을 생산하기 위해 자신의 무능력에 의해 입증 된 바와 같이, 자신의 종양 유발을 잃을 수 있습니다. 마우스를 치료 후 경화 유무 이것은 교란 요인이 될 수있다. 종양의 부재에있어서, 상기 세포주는 종양을 형성 할 수 없기 때문에 전혀 없음으로 인해 종양 원성 종양 또는 마우스에서 자발적 경화 생쥐 요법 치료 마우스 구별하는 것은 불가능하다. 이 대응하는 한 방법을 다시 통과를 위해 마우스 세포 SU를 제조하는 것이다B-피부 종양. 이 재 계대 너무 빈번하게 수행되는 경우 지나...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Kesavan Esuvaranathan 교수에게 수여된 싱가포르 국립 의학 연구 위원회(NMRC/CIRG/1335/2012)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MB49-PSA 셀N/AN/A참조 (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 매체HyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 미디어BiowestL0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South AmericanBiowestS1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, PremiumBiowestS181B
Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-글루타민BiowestX0550
페니실린-스트렙토마이신BiowestL0022
Hygromycin BInvitrogen10687-010
무료 PSA (인간) ELISA 키트AbnovaKA0209
TRIzol RNA 추출용 시약 Ambion
고용량 cDNA 역전사 키트
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan 유전자 발현 분석 – Mouse ActbApplied Biosystems4331182
Mm00607939_s1 TaqMan 유전자 발현 분석 – Human KLK3Applied Biosystems4331182
Hs00426859_g1 C57BL/6J 암컷 마우스In Vivos4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg 케타민 및 1 mg/kg 메데토미딘)지역 약국
반전 약물(1 mg/kg 아티파메졸)지역 약국
귀 펀치전자 현미경 과학72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactateB Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointmentAlcon
Heat pack - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV catheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel 윤활 젤리현지 약국
Poly-L-lysine solution, 0.01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일Roche4693159001
Quantichrom 크레아티닌 분석 키트BioAssay 시스템DICT-50 
형광 염료 - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE 동결 조직 전이 솔루션Ambion4427575
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR 시스템적용 Biosystems
7500 소프트웨어 v2.3Applied Biosystems
대사 케이지Tecniplast 용 수직형 랙
BD FACSCanto I 시스템 BD Biosciences
BD FACSDiva 소프트웨어 v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo 이미징 시스템 캘리퍼 생명과학 
리빙 이미지 소프트웨어 v3.1캘리퍼 생명 과학 
Vevo 2100 이미징 시스템 비주얼소닉스 
RNase 억제제가 포함된 15596026 , 4374967 12케이지

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