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방법 논문

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

13.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55080

⸱

2017년 4월 12일

 ,  ,  , 
1Department of Urology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota, 3Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, 4Department of Medical Microbiology, Immunology and Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 5Simmons Cancer Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

면역 적격 마우스에서 신 세포 암의 동소 모델의 구현은 연구자에게 동일한 동물의 신장 차 종양 및 폐 전이의 존재에 의해 정의 된 임상 관련 시스템을 제공한다. 이 시스템은 전임상 생체 내에서 다양한 트리트먼트를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

신장 세포 암 (RCC)는 매년 미국> 60,000명 영향을 미치며, ~ RCC 환자의 30 %는 진단 당시 여러 전이 있습니다. 전이성 신 세포 암 (mRCC)는 단지 18 개월 평균 생존 시간, 불치이다. 면역 기반 중재 (예를 들면, 인터페론 (IFN) 및 인터루킨 (IL) -2) mRCC 환자의 일부에서 영구 응답 및 multikinase 억제제 (예 sunitinib에 또는 sorafenib)을 유도 또는 항 VEGF 수용체 모노클로 날 항체 (항체)이다 대부분 완전 관해가 드문, 완화. mRCC 환자의 현재 치료에서 이러한 단점은 새로운 치료 프로토콜의 개발을위한 이론적 근거를 제공한다. mRCC위한 새로운 치료법의 임상 시험에서의 핵심 요소는 적절한 동물 모델이다. 인간의 조건을 요점을 되풀이 유익한 기능은 치료 중심의 면역 effecto을 조사하기 위해 차 신장 종양, 신장 종양 전이 및 손상 면역 시스템을 포함R 반응 및 종양 - 유도 된 면역 인자의 형성. 이 보고서는 이러한 모든 기능이있는 소성을 mRCC 마우스 모델을 설명합니다. 우리는 종양 신장 (주 사이트)의 성장과 폐 (전이성 사이트)의 평가 다음에 마우스 신장 선암 세포주 Renca를 사용하여 신장 내 주입 기술을 설명합니다.

서론

신장 세포 암 (RCC)는 전 세계 모든 성인 악성 종양의 악성 신장 종양의 대부분 및 약 3 % 1, 2를 차지한다. 증상의 부족, 오진 및 RCC에 대한 불충분 한 심사 도구로 인해, 환자의 약 30 %는 전이성 2 단계로 진행 환자의 추가 20 ~ 30 %로, 진단시 전이성 신 세포 암 (mRCC)와 함께 발표 할 예정이다. 이러한 경우 매년 ~ 13,500 사망 1, 3 초래한다. 이전 탐지 및 기본 RCC의 치료가 향상되었습니다 있지만, RCC 관련 사망률은 전이성 질환 사망률 3 크게 책임이 있다고 제안 증가하고 있습니다. RCC에 대한 치료의 개발은 발견과 표적으로 한 치료와 면역 요법의 구현 지난 10 년 동안 진행하고있다. 불행하게도, 무 진행 surviv 중알 및 고급의 경우 전체 생존 기간은 여전히 환자 4, 5, 6의 대부분 잘 아래 이년 있습니다. 이 통계는 더욱 식별에 대한 연구와 RCC에 대한 효과적인 치료법의 개발에 대한 필요성을 보증합니다. 적절하게 mRCC에 대한 치료 적 개입을 사전에 질병의 병진으로 관련 전 임상 모델이 먼저 필요하다.

적절하고 일관성있는 모델의 개발은 몇 가지 주요 질문 해결해야 고급 RCC의 인간 조건을 요점을 되풀이하기 : 1) 모델은 해부학 적으로 관련을; 2) 인간의 병리 유사하게 종양의 진행을합니까; 3) 전이는 원발 종양에서 발생합니까; 4) 기본 및 전이성 종양 진행 시간이 지남에 모니터링 할 수 있습니까? 치료의 종류에 따라, 마우스 RCC 종양 세포주 RCC 인간 종양 세포주 및 인간 RCC 환자 유래 xenog 조사되고보트는 면역 또는 면역 결핍 마우스에서 사용될 수있다. 온전한 기능적 면역 체계를 가진 호스트의 Balb / c 마우스 (7)의 자발 신장 선암 유래의 잘 설명 Renca 세포주의 사용을 필요로, 면역 요법의 일부 측면을 평가 이러한 연구에 필요하다. 대부분의 연구는 실험 폐 "전이"8, 9, 10, 11, 12을 생성 (IV)을 Balb / c 마우스에 정맥 쉬운 측정 로컬 종양을 형성하거나 Renca 세포를 피하 (SC)을 주입. 인간의 RCC 모델에 SC-이식 Renca 종양의 사용은 혈관 (13)의 부정확 한 신경 분포를 포함하여 많은 제한을 가지고, 미세 14, 15, 및 기관의 부족 / 종양 세포 COMMUNIC의 차이ATION 13, 16. 또한, 많은 사우스 캐롤라이나 종양 (특히 Renca)은 일반적인 임상 특성 17 이벤트의 연구를 억제, 말초 장기로 전이되지 않습니다. mRCC을 연구하기 위해, Renca 세포는 RCC 환자에서 전이의 폐 - 기본 위치에 종양 부담을 수립 IV 주입 할 수있다. 전이성 종양을 시작의 정맥 주입 방법은, 그러나,의 조사를 허용하지 않는 방법,시기, 또는 세포가 먼 사이트에 주요 기관 (즉, 신장)에서 마이그레이션 이유. 같은 동물에서 분명 기본 및 전이성 질환을 가진 모델은 특히 전이는 일반적으로 이러한 환자에서 사망률의 원인 점을 감안, 고급 질병의 진행 및 치료를 연구하는 것이 중요하다.

우리 연구실은 위에서 설명한 모든 기능을 통합 mRCC의 쥐 모델을 개발했다. 홍보를 설정하려면imary, 동소 종양, Renca 세포 투광성 복막을 통해 동물의 신장에 직접 주입된다. 왼쪽 측면에 작은 절개 (랜드 마크 등) 비장과 좌측 신장의 시각화를 허용. 작은 게이지 바늘을 사용 Renca 종양 세포 주입 동소 복막을 통해 신장에 직접 주입된다. 신장 캡슐 18 이하 Renca 세포를 주입하는 다른 방법에 비해, 이식이 방법은, 봉합을 필요로하지 않고, 비교적 비 침습적 인 저 통증 클래스이고, 시간이 효율적으로 더 높은 처리량을 허용 연습.

폐에 주입 된 신장에서 재현 차 종양 부담 (~ 99 % 포획 비율)뿐만 아니라 전이성 종양 부하이 잘 특성화 모델 결과. 이 모델의 중요한 장점은 면역 조사를 허용, 자사의 동계 특성을 포함한다; 의 자발적인 전이는 공부하기dvanced 질환; 그 동소 이식은 질병의 진행 및 치료에 대한 해부학 적 영향을 모델링합니다. RCC를 대상으로하기위한 치료는 크게 임상 개발하는 동안이 모델의 이용 혜택을 누릴 것입니다.

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프로토콜

다음 프로토콜은 유도 및 실험 소성을 신장 종양 및 잠재적 자연 전이의 성장을 모니터링하기위한 실험 절차를 설명합니다. 다음 절차는 모두 실험 동물의 인도적인 사용에 관한 제도적 정책 및 승인 절차에 따라 수행됩니다.

세포주 1. 유지 관리

  1. 쥐 신장 선암 세포주를 유지 Renca은 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지를 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 및 1 mM의 보충 비 필수 아미노산, L- 글루타민 각 (완전 RPMI 함), 나트륨 피루 베이트. 배양 37 ℃ 세포 배양기에서 5 % CO 2.
    주 : 확립 된 세포주와 마찬가지로 장기 종파 후 발생할 수있는 표현형 또는 유전 적 변화를 최소화하기 위해 형질 전환 이후의 주입을위한 통로 낮은 번호 Renca 세포를 사용하는 것이 권장URE.
    1. 안정적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)와 반딧불 루시 페라을 표현하는 Renca 세포를 엔지니어링하는 트랜스포존 시스템을 사용합니다.
      1. 트랜스 발현 벡터 (pPGK-SB11) 및 개똥 벌레 루시페라아제의 발현 트랜스포존 벡터 부호화뿐만 아니라 GFP하는 융합 유전자 부호화와 제 오신 내성 유전자를 가진 양이온 성 리포솜 기반의 형질 감염 시약, 공동 트랜 Renca 세포를 사용 , 양방향 프로모터 (pKT2 / LuBiG) (19)의 전사 제어하에 둘.
      2. 이틀 후, 제한 희석에 형질 전환 된 세포를 도금하고 완전한 RPMI이 오신 (300 ㎍ / mL)으로 보충에 세포가 확장 할 수 있습니다. 유동 세포 계측법에 의해 각 클론의 GFP 발현을 확인한다. 이 세포들은 Renca-GL을 불린다.
        주 : 제한 희석 클로닝 단일 세포로부터 유도 될 수있는 선택된 셀을 허용한다.
  2. intrarenally Renca 세포를 이식하려면 Renca 세포 전 준비행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 2 × 106 세포 / ㎖의 단일 세포 현탁액 NTO.
    1. HBSS에서 0.25 % 트립신을 이용하여 조직 배양 플라스크에서 Renca 부착 세포를 제거한다. ~ 5 분 후, 트립신을 중화 세정하는 원심 분리 튜브에 세포를 전송하는 완전 RPMI 플라스크에 추가. 원심 25 ° C에서 5 분 동안 300 g의 원심 상대 력 (RCF XG)의 세포.
    2. 상등액을 가만히 따르다 HBSS에서 세포를 재현 탁. 혈구를 사용하여 세포를 세어 / ㎖를 2 × 106 세포를 수득 HBSS로 볼륨을 조절한다.
    3. 세포의 전단 응력을 방지하기 위해, 18 게이지 바늘이 장착 된 1 ml 주사기로 세포를 그린다. 종양 세포의 주입 이전에 28 게이지 바늘을 18 게이지 바늘을 장착. 0.1 용액의 주입은 신장에 2 × 105 세포를 제공한다.

2. 외과 영역 준비

  1. 멸균 수술 준비가열 패드 위에 멸균 된 수술 용 드레이프를 배치하여 바이오 캐비닛 영역. 핀셋, 메스 위, 점안제, 5 % 포비돈 요오드 살균, 멸균 거즈 포함하는 모든 물품을 수집. 사용하기 전에 모든 악기를 압력솥.
  2. 무균 팁 기술을 사용하여 수술을 수행합니다. 구슬 살균기와 동물 사이의 재 멸균 악기. 멸균 장갑, 실험실 코트, 그리고 얼굴에 마스크를 착용 할 것.

3. 동물 제조

  1. 기관 가이드 라인에 따라 (각각 87.5 ㎎ / ㎏ 12.5 밀리그램 / kg, IP)을 케타민 / 자일 라진으로 마취 한 마우스. 발가락 핀치를 수행하여 마취 깊이를 결정합니다.
  2. 동물은 무응답 성으로 간주되면 (손가락) 버릴 면도 또는 털 (가위를 사용)으로의 Balb / c 마우스에 주입 부위 (예를 들어, 왼쪽 측면)을 준비한다.
  3. 수술 영역 (예를 들어, 주택 케이지) 수술 준비 영역에서 마우스를 이동하고에 수의사 연고를 적용눈이 건조를 방지합니다. 대충 5 % 포비돈 - 요오드와 방부제 제조 절개 부위를 면봉.
  4. 절개는 수술 전 마취로한다 지역으로 부피 바카 인 히드로 클로라이드 (2.5 ㎎ / ㎖ 용액, SC 0.1 ㎖)에 주입한다.
  5. 조심스럽게 있도록 복막을 침투하지, 멸균 메스 나 가위를 사용하여 동물의 왼쪽 측면에 - (1.5 cm ~ 1.0) 단일 절개를합니다. 멸균 가위 복막에서 진피 별개. 모든 혈액을 제거 멸균 거즈로 절개 사이트를 DAB.
  6. 옆구리를 지원하기 위해 머리와 오른손을 잡고 왼손을 사용하여, 두 손으로 마우스를 잡고.
  7. 아래에서 만져 마우스 오른쪽 손의 하나 개의 손가락, 복막을 통해 비장을 식별하고; 신장은 이제 복막을 통해 볼 수 있어야합니다. 복막 및 신장에서 긴장을 제공하기 위해 동물의 확고한 보류를 유지합니다.
  8. 두 번째 사람은 종양의 CE 마크를 삽입 한LLS (섹션 1.2에서 제조). 본래 복막으로 28 게이지 바늘이 장착 1 mL를 주사기를 사용하여 신장의 중심으로. 천천히 세포 0.1 ㎖ (2 × 105)를 제공한다. (10)의 셀의 역류를 감소 - 세포를 주입 후 5가 제자리에 바늘을 잡아. 세포를 주입 사람이 마우스를 잡고 사람의 손가락에 가까이에 바늘을 가져 오는 것,이 단계에서 극단주의에 대한 필요성을 주목하는 것이 중요하다.
  9. 바늘을 제거하고 조직 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 얇은 층을 절개를 닫는다.
  10. 멸균 종이 타월 깨끗한 케이지로 다시 동물을 놓는다. 동물이 가열 패드에 복구 할 수 있습니다. 회복 기간 동안 무인 동물을 두지 마십시오. 그들은 똑바로 세워 흉골 때까지 표준 주택 조건에 동물을 반환하지 않습니다. 실험 동물을 사용하는 모든 과정에서 제도적 지침을 따르십시오.

4. 바이오발광 이미징

  1. 생물 발광 영상으로 종양의 성장을 모니터링합니다.
    참고 : 발광 생물 이미징을 수행하기위한 절차 세부 사항은 임 등의 알에서 얻을 수 있습니다. 20 루시퍼 신호는 종양 세포 주입 후 빠르면 24 시간을 검출 할 수있다. 이 모델에는 외부 보이는 종양이 없기 때문에, 주기적으로 종양의 성장을 모니터링하는 것이 필수적입니다. 설계된 실험에 따라, 동소 종양의 성장은 시간의 길이를 변화시키는 진행할 수 있습니다. 루시퍼 라제 - 표현 Renca 세포를 사용하여 하나의 장점은 종양의 성장이 반복적으로 실험 기간 동안 일정한 간격으로 같은 동물에서 모니터링 할 수 있으며, 종양 - 베어링과 종양이없는 기관의 특정 질의가에서 할 수 있다는 것입니다 정의 된 엔드 포인트.
    1. 루시페린 IP (멸균 PBS에 15 ㎎ / ㎖ 용액 0.1 ㎖)을 주입하고 생물 발광 이미징 시스템에 마우스를 배치하기 전에 10 분 동안 순환 할 수있다. 미주리 배치 그 등쪽면을 위로 사용 위로 향 분사 신장을 위해, 약간 옆으로 겹쳐서.
    2. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 (ROI)의 규정 된 영역 내에 초 (광자 플럭스)마다 발광 광자 종양 부담을 측정한다.
  2. 개별 기관에서 종양 부담의 정량.
    참고 : 정량 안락사 생쥐에서 그들의 제거 후 개별 기관에 정의 된 시간 지점에서 수행 할 수 있습니다.
    1. 단계 4.1에서와 같이, 루시페린과 쥐를 주입.
    2. 10 분 후, 승인 된 절차를 사용하여 마우스를 안락사.
    3. 관심있는 기관 해부 (예를 들어, 신장, 폐, 아래 섹션 5 참조). 35 × 10-mm 배양 접시에 조직을 전송하고 생물 발광 이미징 시스템에 배치합니다.
    4. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정의 된 ROI 내에 제 (광자 플럭스)마다 발광 광자 종양 부담을 측정한다.
e_title "> 5. 장기 수확

  1. 각 실험에 대한 엔드 포인트 정의 바람직 기관 가이드 라인 (예를 들어, CO 2, 경추 탈구 마취 과다)에 의한 종양 - 함유 마우스를 안락사. 폐 인도 잉크 인플레이션 이후에 수집되는 경우, 자궁 경부 탈구를 방지.
  2. 습식 장기 중량을 측정함으로써 주입 신장 차 신장 종양 성장의 육안 평가를 수행한다.
    1. (g)에서 종양 질량을 결정하기 위해 (21)을 분리하고, 종양 - 함유 신장과 신장 무게의 차이는 종양 덩어리를 정의하는 동일한 마우스에서 대측 신장을 단다. 조심스럽게 자신의 무게를 측정하기 전에 절제된 신장에서 불필요한 결합 조직을 멀리 해부하다.
  3. Fekete의 솔루션에 폐를 인도 잉크 전 절제술을 함께 폐를 팽창 즉시 고정에 의해 폐에 종양 전이의 정도를 평가아가씨 = "외부 참조"> 22. 폐 표면에 전이 병변의 수동 계산은 다음을 수행 할 수 있습니다.
    1. 흉곽을 통해 중반 복부에서 시작 가위를 사용하여 중간 선 절개를 확인하고 최대 목 / 침샘을 통해. 조심스럽게 폐 조직을 손상시키지 않고, 가위와 집게를 사용하여 갈비뼈를 제거합니다.
    2. 결합 조직을 제거하여기도를 노출.
    3. HBSS 10 % 먹물 용액으로 충전 된 18 게이지 바늘을 가진 주사기 3 ㎖를 준비한다.
    4. 집게를 사용하여 조심스럽게 기관에서 실크 봉합사 스레드. 이것은 한 번 팽창 기관을 묶는 데 사용됩니다.
    5. 조심스럽게 기관 아래 바늘을 삽입하고 천천히 인도 잉크 솔루션으로 폐를 팽창 할 수있는 주사기를 우울. 약 한 - 인도 잉크 액 1.5 mL를 완전히 폐를 부풀려 것입니다.
    6. 잉크의 역류를 억제하는 바늘 아래 봉합사 여러 묶은 의해 폐쇄기도 핀치.
    7. Remov전자 바늘 조심스럽게 팽창 된 폐를 제거하는 결합 조직을 버려야.
    8. 화학 퓸 후드에서 5 ㎖ Fekete의 용액을 함유하는 15 mL의 원뿔형 튜브에 폐를 배치했다 (95 %의 EtOH 35 ㎖, DH 2 O 15 ㎖, 포름 알데히드 5 ㎖ 및 빙하 산성 산 2.5 mL를 100 ML 글래스 병) 23.
    9. 실온에서 48 시간 이전에 수동으로 탈 염색 종양 결절을 계산하기 - 폐는 24 / destain를 해결 할 수 있습니다.
    10. 탈색 후 그대로 폐를 제거하고 조심스럽게 35 X 10mm 페트리 접시에 엽에 의해 고정 된 폐를 해부. 해부 현미경 하에서 각 로브에 종양 결절의 개수 (흰색 결절) 개수.

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결과

Renca 세포의 성공적인 이식은 쥐의 폐에 신장과 전이 종양 개발에 발생합니다. 종양 베어링과 반대측 신장 적출 후, 웨트 티슈의 무게 (g)의 중량 증가 (도 1)에 기초하여 종양 부담을 입증 측정 하였다. Renca 사이토 케라틴 종양은 8, 18 염색법 (도 2)를 통해 면역에 의해 식별 될 수있다. 길이 연구, 루시퍼 라제 발현 Renca 세포주를 이식 하였다. 생물 발광 이미징 종양 부담과 시간 (도 3A) 위에 요법에 대한 응답을 추적하는 생체 내 이미징 시스템 (IVIS)를 사용하여 수행 하였다. 폐에 전이는 생물 발광 영상 (그림 3B)과 인도 잉크 폐 인플레이션 (그림 3C)에 의해 확인되었다.

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토론

우리는 동소 RCC의 마우스 모델을위한 프로토콜을 제시한다. 마우스 신장에 마우스 신장 선암 종양 세포의 주입은 mRCC의 임상 관련 모델을 제공합니다. 이 모델은 고급 RCC의 특징입니다 둘 다 폐의 신장과 원격 전이가 내 차 종양 발생합니다. 본 명세서의 설명은 면역을 Balb / c 마우스에서 Renca 세포주에 특이. 이 동소 모델을 사용하여, 우리는 치료 시험 17, 24, 25, 26, 27이 모델의 유용성을 입증의 Renca 종양이 면역 요법에 반응하는 것으로 나타났습니다. 이식을위한 동계 종양 세포 라인을 사용할 수있는 기능은 면역 학적 손상 동물에서 종양의 진행을 공부의 이점을 제공한다. 동계, 동소, 임상 관련 chara...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 국립 암 연구소 (R15CA173657 AW와 TSG에 R01CA109446에), (AW까지) 시몬스 암 연구소 및 Minnestoa 대학에서 보조금 (TSG에) 4 신장 암 재단 등반에 의해 지원되었다. 우리는 면역에 도움 박사 크리스틴 앤더슨합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인공 눈물 안과 연고AkornNDC 17478-162-35
Vetbond 조직 접착제3MCBGBIW011019
Betadine 용액 (포비돈 - 요오드, 5 %)Purdue Products, L.P.NDC 67618-155-32
0.25% 마르카인(부피바빈 HCl 주사)호스피라0409-1587-50 
가열 패드Sunbeam
주사기BD309659
GauzeVenture908291
KetaminePhoenix PharmaceuticalsNDC 57319-609-02
Xylazine 아콘NDC 59399-111
행크 s BalancedSalts Sigma-AldrichH2387
IVIS캘리퍼스
D-Luciferin, 칼륨 염GoldBioLUCK-1G
India InkChartpak Inc44201
가위
겸
자 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템Neuromics
렌카ATCCCRL-2947
SBT0200

참고문헌

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