중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

요약

여기에서는 단클론 항체의 고유한 물리화학적 이질성을 품질 속성으로 평가하기 위한 포괄적인 모세관 영역 전기영동 프로토콜을 제시합니다.

초록

단클론 항체(mAb)와 같은 생물 치료 단백질은 만성 퇴행성 질환 치료를 위한 실현 가능한 대안입니다. 이러한 단백질의 생물학적 활성은 물리 화학적 특성에 따라 다릅니다. mAbs의 물리화학적 이질성 분석을 위해 크로마토그래피 및 모세관 전기영동과 같은 고성능 기술의 사용이 설명되었습니다. 오늘날 모세관 영역 전기영동(CZE) 기술은 생체 분자 분석을 위한 가장 단호하고 민감한 분석 방법 중 하나입니다. 또한 CZE의 전기 구동 분리는 물질의 광범위한 특성에 의해 제어되며 단백질을 원래 상태에 가깝게 분석할 수 있는 이점을 제공합니다. 그러나 일상적인 분석을 위한 이 기법의 성공적인 구현은 시료 및 시스템 준비 중 중요한 단계에서 분석가의 기술에 달려 있습니다. 이 튜토리얼의 목적은 mAb의 CZE 분석에서 성공하기 위한 단계를 자세히 설명하는 것입니다. 또한 이 프로토콜은 단백질 분석 화학 실험실에 관련된 인력의 기술 개발 및 향상에 사용할 수 있습니다.

서론

단일 클론 항체 (단클론 항체는)으로 인해 여러 가지 만성 및 퇴행성 질환 ^일에 대해 행동하는 능력에 관심을 증가 biotherapeutic 단백질이다. 다른 생체 분자와 마찬가지로, 모노클로 날 항체가 (최종 제품에 생합성에서, 예) 수명주기의 모든 단계에서 여러 가지 물리 화학적 변형을 받아야하는 경향이있다. 이러한 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 : 탈 아미드 화, 글리코 실화, 산화, 폐환 반응, 이성화 반응, 응집 단백질 분해 ^절단이. 따라서, 극한 이성체를 해결할 수있는 분석 기법은 품질 사양을 설정하기 위해 모노클로 날 항체 얼룩이 안정성을 모니터링 할 필요가있다.

모세관 전기 영동 (CE)는 배경 전해질 (BGE)로 채워진 좁은 용융 실리카 튜브 (μm의 범위)의 outinside 실시 고성능 분리 기술이다. 전계의인가시에, 충전 분자 (30,000 V까지)의는 반대 전하 (즉, 전기 구동 분리)와 전극으로 이동한다. CE에서 높은 전압의 사용은 전통적인 겔 전기 우수한 고속 분석 및 증가 된 효율을 허용한다. 모세관 영역 전기 영동 (CZE)는 통상적으로 제품의 품질 평가 ^3-9에 대한 생물 약제 산업에 사용되는 CE 기반 기....

프로토콜

솔루션 1. 준비

1. BGE 솔루션을 준비합니다.
   1. 0.05 %로 이루어지는 용액 100㎖를 제조 하였다 (m / v)의 하이드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC), 200 mM의 ε-N - 아미노 카프로 산 (EACA)와 30mm의 리튬 아세테이트.
      주 : HPMC는 점탄성 폴리머이기 때문에, 유리 비이커에 분말을 부어 물 80 mL를 첨가하고 마지막으로 교반 막대를 추가한다. 일반적으로 남아있는 시약을 계속 추가합니다. 그것은 눈 자극을 일으킬 수있는 리튬 아세테이트를 취급 할 때는 보안경을 착용한다.
   2. 50 % (v / v)로 아세트산으로 4.8 ± 0.1의 pH 값으로 조정한다. 용액을 5 분 동안 안정하고 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
   3. 메스 플라스크에 100 ㎖의 최종 부피를 만들기 위해 물을 추가합니다.
   4. 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막을 통과 필터.
   5. 최대 7 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오.
2. 내부 표준을 준비합니다.
   1. 1 mL의 준비1 % (m / v)로 히스타민 이루어지는 용액.
   2. 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막....

결과

도 2는 200 mM의 EACA, 30mm의 리튬 아세테이트의 전형적인 전류 프로파일을 도시 트리스 완충액 (50 mM의, pH를 8.0)로 희석 한 항 - TNFα 단클론 항체 샘플을 사용하여 pH 4.8 BGE. 관찰 될 수있는 바와 같이, 전류는 분석에 걸쳐 안정하고 30 내지 35 μA의 값 사이에서 발진 할 수있다. 검출 된 피크가 히스타민 내부 표준에 대응한다 그림 3은 빈 샘플의 CZE의 electropherogram을 보여줍니다. 3.7 ~ 4.1 분의 이동 시간을 갖고 히스타민 예상된다. 그림 4 항 TNFα 단클론 항체의 CZE의 electropherogram을 보여줍니다. 언급 될 수있는 바와 같이, 주 피크는 선행 작은 강도의 피크를 따른다. 분리가 (양에서 음 예) 정상 극성 하에서 수행되기 때문에, 분석의 기본 이성체 (단클론 항체는 양전.......

토론

실시 CZE가 성공 확률을 높이기 위해 모노클로 날 항체 분석 할 때이 튜토리얼에서, 우리는 적절한 방법의 중요성을 강조 표시합니다. CZE가 일상적으로 사용하는 경우에는, 문제가 필연적으로 발생한다 ^(12).

최상의 결과를 얻으려면, 그들이 극복하고 어려운 단계 문제를 해결하는 분석가 도움이 될 것 같은 프로토콜을 통해 포함 된주의 사항을 따르는 것이 중요합니다. 주어진 조건에 최적의 해상도를 얻기 위해 중요한 고려 BGE 용액의 정확한 제제이다. 이 프로세스는 완충제, 비 버퍼링 첨가제의 pH 농도의 이온 강도 엄격하게 제어 데 필요하다. 전반적으로, CE 시스템은 세부 사항에 관심과주의가 필요합니다. 시스템 청소 또는 어셈블리에 관한 단계를 무시할 경우 그것은 쉽게 손상 될 수 있습니다.

본 방법은 중성 모세관의 사용을 고려한다. 베어 융합 실리카 모세관 달리중성 모세관 따라서 분리 효율, 정확성 및.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
빙하 아세트산	Tecsiquim	AT0035-7
ACS 등급 염산	J.T. Baker	9535-05
히스타민 디하이드로클로라이드	Fluka	53300
(하이드록시프로필) 메틸 셀룰로오스	Fluka	09963
리튬 아세테이트	Sigma-Aldrich	517992
6-Aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus 제약 분석 시스템	Beckman Coulter	A66528
eCAP 중성 모세관	Beckman Coulter	477441
바이알, 마이크로, 200 &마이크로; l	Beckman Coulter	144709
범용 바이알 캡	Beckman Coulter	A62250
범용 바이알	Beckman Coulter	A62251
케이블, 광학, UV/Vis	Beckman Coulter	144093
UV/Vis 검출기 모듈	Beckman Coulter	144733
카트리지 어셈블리 키트, 빈	Beckman Coulter

144738