Method Article

수평 유전자 전달의 연구에 대한 방법론 황색 포도상 구균

DOI:

10.3791/55087

⸱

March 10th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France

In This Article

Summary

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우리는 여기에서 황색 포도상 구균의 활용, 전달, 자연 변화의 체외 조사에 대한 세 가지 다른 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

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주요 기회 인간 병원체 황색 포도상 구균의 한 가지 중요한 특징은 빠른 속도로 항생제에 대한 내성을 획득하는 그것의 특별한 능력이다. 게놈 연구는 황색 포도상 구균이 수평 유전자 이동은 (HGT)은 황색 포도상 구균의 진화에 중요한 역할을한다는 것을 시사 모바일 유전 적 요소에있는 많은 독성 및 내성 유전자를 운반 것을 알 수있다. 그러나 여전히 부족한 특히 최근에이 박테리아에보고 된 자연의 변화를, 관련되는 황색 포도상 구균에 HGT을 연구하는 데 사용되는 방법론의 완전하고 상세한 설명. 접합, 파지 전달, 천연 변환 :이 작품은 체외 황색 포도상 구균의 HGT의 조사에 유용한 세 가지 프로토콜을 설명합니다. Phenicols을 부여,이 목표는 CFR 유전자 (클로람페니콜 / florfenicol 저항), Lincosamides, 옥사 졸리 디논, Pleuromutilins 및 Streptogramin A (PhLOPS에A) 표현형 - 저항을 사용 하였다. 황색 포도상 구균은 다른 균주에 유전 물질을 전달되는 메커니즘을 이해하는 것은 저항의 빠른 획득을 이해하는 필수적이며, 보급의 모드 감시 프로그램에보고 또는 더 미래에 확산 모드를 예측하기를 명확히하는 데 도움이됩니다.

Introduction

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황색 포도상 구균은 자연스럽게 인간과 동물의 피부와 비강을 붙어 사는 공생 그람 양성 세균이다. 이 박테리아 종은 병원 및 의료 설정에서 원내 감염의 주요 원인이다. 또 다른 항균 화합물에 대한 내성을 발전 할 수있는 능력은 세계적으로 관심이 세균에 의한 감염의 관리했다.

저항 표현형의 확산에 관여하는 두 가지 주요 경로는 알려져 있습니다 저항성 유전자형의 클론 보급 및 세균 풀 중 유전 적 결정의 보급을. S. 아우 레 우스, 다른 항생제 내성 유전자 (및 병독성 결정자)의 경우 모바일 유전 요소 (MGEs)과 연관된 것으로 밝혀졌다 1. S. 아우 레 우스의 게놈에서 이들 요소의 존재는 세대의 수집 및 전송 것을 나타낸다세균 집단 내에서 etic 물질은 황색 포도상 구균 적응과 진화에 중요한 역할을 할 수있다.

변환, 접합 및 파지 형질 : 유전 물질은 그람 양성균에 HGT 세 공지 된 메커니즘을 통해 교환 될 수있다. 변환 무료 DNA의 흡수를 포함한다. 역량 단계 : 외국의 DNA를 획득하려면, 박테리아 세포는 특별한 생리 학적 위상을 개발해야합니다. 이 단계에 도달하면 적격 세포의 세포질 내로 DNA를 운반하는 새로운 유전 결정을 취득 할 수있다. 황색 포도상 구균의 경우, 자연 변화의 존재는 최근이 입증되었다. 이과 일치, 우리의 그룹은 구성 적 발현이 reachin 할 수있는 황색 포도상 구균을 렌더링하는 방법을 개발 역량 무대와의 한숨 인자의 발현의 관련성 (애매한 차 전사 시그마 인자)에 빛을 발산했습니다자연의 변화 (2)에 의한 내성 표현형의 취득을 허용 g 역량 단계.

활용은 다른 (받는 사람) 하나의 살아있는 세포 (기증자)에서 DNA의 전송을 포함하는 과정이다. 두 셀은 튜브 또는 구멍과 같은 특수한 구조에 의해 보호되는 상태에서 DNA를 교환 할 수 있도록 직접 접촉한다. 이 방법에 의해 DNA의 전송은 공역 기계가 필요합니다. S. 아우 레 우스에있어서, 원형 플라스미드 공역 공역 오페론 TraA 3 PGO1 품고있다.

파지 형질 도입은 감염 박테리오파지 통해 셀 사이의 DNA 전달을 포함 파지 캡시드 내로 바이러스 DNA 대신에, 박테리아 DNA의 패킹을 의미한다. S. 구균 균주의 대부분은 박테리오파지 1 용 원화되어있다. 스트레스 조건시 prophages은 세균 genom로부터 절단 될 수있다전자 및 용 균성 생활사로 이동.

이는 S. 구균의 DNA 전달을위한 세 개의 공지 된기구이다. 예 : "의사 변환"2 병원성 섬 (4)의 전송에 파지와 같은 시스템과 같은 몇 가지 추가 전송 메커니즘이있다. 최근, 한 그룹은 "나노 튜브"는 인접한 셀 (5), (6) 사이 (플라스미드 DNA를 포함) 다공질 재료의 전사에 관여하지만, 후속 연구가 지금까지 다른 그룹 등장하지 않았 음을보고 하였다.

활용, 전달, 천연 변환 :이 작품은 세 가지 주요 이동 경로를 해결하여 황색 포도상 구균에 HGT을 연구하는 데 필요한 방법을 제공합니다. 이러한 방법으로 얻어진 결과 중에서 CFR 유전자 전달 (클로람페니콜 / florfenicol 저항)을 연구하기 위해 사용되었다황색 포도상 구균은 7 균주. 이 세 가지 기술은 황색 포도상 구균에 MGE 전송의 조사를 위해 다양한 도구입니다.

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Protocol

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참고 :이 작업에 사용 된 균주 및 재료는 각각 표 1에 나열된 및 재료의 표합니다. 투과 실험에서 N315 및 양성 유도체 CFR COL은 CFR 유전자의 도너 (N315-45 및 COL-45)로 하였다. 이 균주는 이전에 표준 활용 프로토콜 (아래 참조)에 따라 기증자 임상 CFR 양성 Staphyloccocus 표피의 변형 (ST2)로 사용, 접합에 의해 얻어졌다. 이 균주는 pSCFS7 같은 플라스미드 7 일 CFR 유전자를 숨겨.

1. 활용 필터 - 결합 방법을 사용하여

주 : CFR 유전자 (N315-45) 7 (R 형상)을 운반하는 S. aureus에 N315 균주 도너로서 사용 하였다. COL 8 Mu50 9 균주 (구정 R, CM S)를받는 사람으로 사용되었다. 더블-내성 콜로니 32 밀리그램 / 클로람페니콜 더하기 8 mg을 L의 존재하에 성장할 수 (테트 R, CM R은) / 테트라 사이클린 L은 추정 transconjugants로 간주하고, 콜로니 PCR에 의해 CFR의 존재를 결정하고를 결정하기 위해 분석 하였다 받는 사람의 감수성 프로필.

  1. 약간의 수정과 함께 이전에 설명한 프로토콜 10 다음 접합을 수행합니다 :
    1. 37 ℃에서 진탕 (와 각각 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜없이) 트립신 간장 국물 (TSB) 매체에 기증자와받는 사람의 하룻밤 문화 5 mL를 준비합니다.
    2. 신선한 TSB 배지를 사용하여 1 (OD = 1.0 (600))에 하룻밤 동안 배양 물의 광학 밀도 (OD 600)를 조정한다. 받는 사람 문화의 0.5 ㎖ (COL 또는 Mu50)와 기증자 문화 (N315-45)의 0.5 mL의 혼합. 혼합물에 1 ml의 PBS를 추가합니다.
    3. 0.45 μm의 필터 멤브레인 USI에 박테리아의 혼합물 전송진공 펌프 시스템 겨.
    4. 양 혈액 아가 플레이트 상에 여과막을 넣어. 1 일 동안 37 ° C에서 품어.
      주 :이 단계에서, 농축 된 배지 더블 내성 세포의 성장을 허용 할 필요가있다.
    5. 플레이트로부터 여과막을 꺼내 인산 완충 식염수 (PBS) 10ml에 일시. 소용돌이 잘 막에 연결된 모든 박테리아를 수집합니다.
    6. 신선한 TSB를 사용하여 세균 현탁액 직렬 10 배 희석을 만든다. TSB 한천의 0 ~ 10 -4 희석 된 샘플 플레이트 100 μL은 (TSA) 판은 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜 8 밀리그램 / transconjugants의 선택을위한 L의 테트라 사이클린 보충. 희석 현탁액 (10-5 -10 -6) TSA 플레이트 상에 단독으로 8 ㎎ / ℓ의 테트라 사이클린과 접시 100 ㎕를받는 사람의 총 수를 계산합니다. 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
    7. CF의 존재를 두 번 저항하는 식민지 (추정 transconjugants를) 분석식민지 PCR (7)과 감수성 프로필 (antibiogram)에 의해 R 유전자.
    8. 표준 희석법 또는 디스크 확산 방법 (11)에 따른 적절한 항생제의 최소 억제 농도 (MIC가)를 측정하여 antibiogram을 결정합니다. transconjugants의 감수성 프로필은 클로람페니콜 (그리고 CFR 유전자에 의해 영향을받는 다른 화합물)을 제외하고,받는 사람에게 동일해야합니다. 이 판정은 공여자 균주가 개발 테트라 사이클린 저항성을 배제하는 것이 필수적이다.

2. 파지 형질 도입

참고 : Siphoviridae 가족 (실험실 주)에 속하는 박테리오파지 MR83a는 전달 실험에 사용 하였다. N315-45 파지 감염에 대한 CFR 공여체로서 사용 하였다. N315, COL, 또는 Mu50 균주는받는 사람으로 사용되었다. CFR의 인수는 AB에 의해 결정되었다수신자 균주 ility 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜의 존재 하에서 성장할. 이 조건에서 성장 콜로니 (콜로니 PCR에 의해) CFR의 존재를 결정하고, 오염 가능성을 배제하기 위해 민감성 프로파일을 결정하기 위해 분석 하였다.

  1. 기증자에 파지 증폭
    1. (180 RPM)을 진탕 37 ° C에서 3.6 밀리미터 칼슘 2 + (NBCaCl 2) 보충 영양 배지 5ml에 N315-45의 야간 문화를 준비합니다.
      참고 : 칼슘은 파지 감염이 필요합니다. 재료 표를 참조하십시오. 다른 회사의 영양소 국물은 칼슘 침전 등의 문제를 가지고 있습니다.
    2. 50ml의 유리 플라스크 또는 유리 바이알에 NBCaCl (2)의 10 ㎖의 최종 부피 1000 : 밤새 배양 한 희석 계대 배양을 준비한다. (180 RPM)를 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 박테리아 성장.
    3. NBCaCl 2 메디칼에 희석 파지 MR83a 일련의 준비UM (10-2, 10-3, 10-4, 10-5 및 10-6). 박테리아 문화에 희석 된 파지의 20 μl를 추가합니다. 또한 박테리아 세포의 성장에 대한 양성 대조군으로서 제공하고, 다음날 파지 역가를 결정하는데 사용될 수있다 파지 감염없이 제어 배양을 준비한다.
    4. 밤새 부드러운 흔들림 (100 RPM)와 37 ° C에서 문화를 성장.
      주 : 감염성 파지 초과하지 않는 경우에는 세포가 어느 정도 증가 할 것이다; 다음, 그들은 의한 용균 사이클을 통해 파지 증폭에 용해 단계로 들어갑니다. 파지와 문화가 투명성 별개의 비율을 보여줍니다 동안 파지없는 문화는 전체 성장을 보여줍니다.
    5. 추가 된 파지의 가장 높은 희석와 하나 또는 두 개의 해제 문화 튜브를 선택합니다.
    6. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 문화를 전송합니다. 클로로포름 250 μl를 추가하고 튜브 반전에 의해 철저하게 섞는다.
    7. 5000에서 튜브를 원심 4 ℃에서 20 분 XG.
    8. 신선한 튜브에 상층 액을 전송하고 사용할 때까지 4 ° C에 저장합니다.
      파지는 적어도 몇 달 동안 안정적이지만, 너무 오래 파지 준비를 저장하면 역가 및 전달 효율을 감소 : 주.
  2. 파지의 역가를 측정 (파지 플라크 분석)
    1. 영양 국물 한천 (1.5 % 한천) 매체를 준비; 55 ° C에서 물 목욕은 따뜻한 유지. 3.6 mM의 최종 농도로 배지에 멸균 된 0.5 M CaCl2를 용액을 첨가. 90mm 배양 접시 (NBCaCl 2 판)로 하거라.
    2. 진탕 37 ° C에서 NBCaCl 2 5ml에 N315의 야간 문화를 준비; 이것은 상술 한 제어 배양한다 (단계 2.1.3)로 치환 될 수있다.
    3. NBCaCl 2 200 μL에 하룻밤 문화의 10 μl를 추가하고 균일하게 NBCaCl 2 판에 그것을 확산. 때 표면의 확산을 중지판은 액체로 덮여있다. 판 건조를 할 수 있습니다.
    4. 직렬 1시 10분 희석합니다 (10 -5 -10 -10) NBCaCl이 매체를 사용하여 이전에 제조 된 파지 (단계 2.1.8)의.
    5. 스팟 박테리아로 덮여 접시에 각각 파지 희석의 3 μL.
    6. 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
    7. 플라크 수를 카운트하고, 다음의 방정식을 사용하여 파지 역가를 계산 : 플라크 형성 단위 (PFU) / ㎖ = 플라크의 수 X 희석 계수 / 발견 볼륨 (3 × 10-3 mL) 중
  3. 파지 전달
    주 : 이전 단계 (2.1.8)에서 제조 한 파아지 풀은 S. 아우 레 우스 균주에 CFR 유전자의 전달을 시험하는 데 사용된다. 이 실험에서는, N315, COL 또는 Mu50가 수신자로서 사용되는 균주.
    1. (180 RPM)을 진탕 37 ° C에서 NBCaCl 2 5 ㎖의 N315, COL, 또는 Mu50의 야간 문화를 준비합니다.
    2. t 희석그는 10 9 PFU / mL로 ~에 NBCaCl 2 파지.
    3. 50 mL 유리 바이알에서 밤새 배양 500 μL의 신선한 NBCaCl이 500 μL 및 파지 1 ㎖ (~ 109 PFU / ㎖)를 혼합한다; 감염의 예상 다양성 (MOI)은 부드러운 30 분 (100 RPM)을 진탕 37 ° C에서 1 품어 혼합물을 초과 할 수 없습니다.
      주 : 직전 파지 첨가합니다 (내재적 제한 효소를 불 활성화하기 위해 2 분 동안 52 ° C)을받는 세포의 열처리 효율 12을 증가시킬 수있다.
    4. 20 % 나 3 -Citrate의 50 μl를 추가합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 흔들어 부드러운 계속합니다.
      참고 : 나 3 -Citrate 칼슘의 적당한 킬레이트 역할을합니다.
    5. 녹은 뇌 - 심장 주입 (BHI) 한천 (1.5 % 한천) 매체를 준비하고 55 ° C에서 물을 욕조에 보관합니다.
    6. , 100 mL의 플라스크에 세균 파지 액 이동 32 ㎎ / ℓ의 chloramp 보충 따뜻한 BHI 한천 배지 50 ㎖를 추가henicol, 잘 섞는다. 90mm 배양 접시에 혼합물을 부어.
      참고 :이 방법은 성장 식민지 (추정 transductants) 적은 수의 검출을 가능하게한다.
    7. 24 ~ 48 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
    8. 또한 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜로 보충 된 새로운 BHI 아가 플레이트 상에 콜로니를 전송함으로써 저항 생성 콜로니 (transductants)를 테스트한다. 식민지 PCR (7)에 의해 CFR 유전자의 존재를 확인합니다.

3. 자연 변환

참고 : S. 구균의 자연적인 형질 전환 분석은 이전 연구 2에 기재된 방법에 따라 수행 하였다. N315 유도체 N2-2.1 2, 7, 수신자로서 사용 하였다. 이 변형에서, 한숨의 궤적이 중복 된 구성 적 표현 한숨이되도록. DET의 경우한숨 발현 능력 변종을 분리하는 방법에 대한 ailed 절차는, 이전의 설명 2 참조하시기 바랍니다. 전송에 대한 내성 마커 클로람페니콜 없으면 PRIT 한숨-CM (R)는 이전이 설명 된대로 한숨 표현하는데 사용될 수있다. 정제 된 플라스미드 또는 CFR에서 전체 DNA 추출물은 S. 아우 레 우스 COL-45 (7)는 변환을위한 DNA 도너로서 사용 -acquired.

  1. 공여자 DNA의 제조
    1. TSB 50 ㎖을 함유하는 300 ㎖의 플라스크에서 37 ° C에서 진탕 COL-45 밤새 배양 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜로 보충. 문화 대장균 HST04 수행 pHY300 플라스미드 (테트 R)을 대조 실험을 위해 플라스미드를 추출한다.
      참고 : HST04 (댐 - / DCM -)는 DNA가 유전자 13 메틸화 없다. DNA의 methylases와 다른 기존의 균주도 사용 될 수 있습니다DNA의 메틸화 상태는 변환 효율에 영향을주지 않기 때문에, D는 공여체 DNA를 제조 하였다. 대안 적으로, S. 아우 레 우스 균주 COL로부터 정제 pT181 플라스미드는 형질 전환 분석 2 양성 대조군으로 사용할 수있다.
    2. 원심 분리 (4 ℃에서 10 분 동안 8,000 XG)에서 세포를 수집합니다.
    3. 전체 DNA를 정제 플라스미드 DNA 추출 키트 또는 종래 DNA 정제 방법을 이용하여 플라스미드를 추출한다.
    4. 분광계에 의해 정제 된 DNA를 정량화하고 사용할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
      참고 : 변환 분석, 오래 보통 이하 1 주일 새로운 DNA의 준비를 사용합니다. 오래 DNA 제제 변환의 효율을 감소시킨다.
  2. 변환 분석
    1. 문화 진탕 37 ° C에서 하룻밤 TSB 5 ㎖에받는 사람 세포 (N2-2.1).
    2. 1.5 ML 튜브에 하룻밤 문화의 0.5 ml에 전송합니다. Precipi원심 분리 (4 ℃에서 1 분 10,000 XG)에서 세포를 하므로.
    3. 50 ㎖의 튜브 CS2 배지 10 mL로 세포를 일시.
      참고 : CS2 매체 (재질 표 매체 구성 참조) 황색 포도상 구균이 자연 변환에 역량을 유도하는 완전한 합성 매체입니다. 이러한 TSB 또는 BHI 같은 다른 표준 실험실 매체는, 변환이, 13에 적합하지 않습니다.
    4. 후반 지수 단계 (약 8 시간)까지 (180 RPM) 진탕 37 ° C에서 박테리아를 성장.
    5. 원심 분리 (4 ° C에서 5 분 5,000 XG)에서 세포를 수확.
    6. CS2 신선한 배지 10ml에 세포를 재현 탁.
    7. 세포 현탁액에 정제 플라스미드 또는 게놈 DNA (단계 3.1.4)의 10 μg의 추가. 37 ° C에서 흔들어 2.5 시간 동안 180 rpm으로.
      참고 : DNA와 짧은 배양 시간 (<2.5 시간)보다 낮은 TRANSF 결과ormation 주파수.
    8. 원심 분리 (5,000 XG에 5 분 4 ° C에서)에 의해 세포를 수집합니다.
    9. BHI 배지 10 ㎖로 세포를 재현 탁. 용융 BHI 한천 90 ㎖의 32 ㎎ / ℓ의 클로람페니콜 (제어 실험 5 ㎎ / ℓ 테트라 사이클린)을 (55 ° C) 보충하여 세포 현탁액을 혼합한다. 90mm 배양 접시에 혼합물을 부어. 신속 시원하고 한천이 응고 할 수 있습니다.
    10. 2 일 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
    11. 그들의 저항 특성을 확인하기 위해 적절한 항생제를 함유하는 새로운 BHI 아가 플레이트에 (이쑤시개를 이용) 콜로니를 전달함으로써 생성 콜로니 (형질 전환) 복제. 식민지 PCR (7)에 의해 획득 내성 유전자 (CFR 또는 tetM)를 확인합니다.

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Results

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여기에 표시되는 결과는 이전에 발표되었다 (게시자의 허가 기준 7 일부터 적용). 우리 HGT 세 가지 메커니즘을 조사하여 저레벨 리네 졸리 드 내성 및 S. 아우 레 우스 균주에 PhLOPSA 내성 표현형 14, 15의 발현을 일으키는 CFR 유전자의 잠재적 인 송신 경로를 연구 하였다.

도 1은 공역 분석에서 얻어진 결과를 나타낸다. 공액 프로토콜은 다른 공역 도너 동일한 공역 벡터를 이용하여 유사한 결과를 제공 잡종 변속기 (A)뿐만 아니라 인트라 종 전송 (B)에 유용하다. 접합의 효율이 transconjugants의 Nº (콜로니 형성 단위 또...

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Discussion

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이 작품은 황색 포도상 구균의 유전 적 결정의 HGT을 연구하는 세 가지 주요 방법을 설명합니다. 전달 및 접합 수십 년 동안 연구되어 왔지만, 자연적인 변화의 존재는 최근이 인정되었다. 따라서, S. 구균 HGT의 세 가지 모드 모두 장착되며, 이들 모두의 시험은 유전자 결정 인자의 가능한 전파 경로를 명확히 할 필요가있다. 이 연구의 목적은 완전한 프로토콜을 컴파일하고, 이전에 발행 업무 7에서 사용 된 방법에 관한 유용한 정보를 제공하는 것이다. 접합 및 전달 프로토콜을 사용할 수 있지만,이 상세한 프로토콜 변환 기술 한 제 종이이다.

필터 - 결합 방법을 이용하여 접합 간단한 기법 및 다른 세균 종 공역 전송 연구에 적용 할 수있다= "외부 참조"> 7,

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution 및 JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC)의 일부 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
트립틱 소이 브로스(TSB) 벡턴 디킨슨 
뇌 심장 주입 (BHI)Becton Dickinson 
영양 국물 No. 2OxoidCM0067
양 혈액 한천Eiken 화학 주식 회사E-MR96Tryptic soy 한천에는 5%(v/v) 양의 혈액이 추가되었습니다. 
한천 가루Wako Pure Chemical Industries010-08725
구연산 나트륨 (Trisodium citrate dihydrate)Wako Pure Chemical Industries191-01785
셀룰로오스 에스테르 Gridded 0.45 μ L HAWG 필터Merck MiliporeHAWG 02500
QIAfilter 플라스미드 미디 키트QIAGEN12243
211825211059제조업체에 따르면

References

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