방법 논문

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

DOI:

10.3791/55094

⸱

2017년 1월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 2Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

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이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

초록

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여기에서는 시험 관내 폐 세포 배양 여러 컴포넌트 세포 배양 하이드로 겔을 형성하기위한 방법을 제시한다. 돼지, 쥐, 또는 마우스에서 블록의 폐 조직 엔 건강을 시작으로, 조직은 관류 및 세포 파편을 제거하기 위해 후속 화학 세제에 잠겨있다. 처리 전후의 조직 학적 비교는 이중 가닥 DNA 및 알파 갈 락토시다 제 염색을 95 % 이상 제거하는 것을 확인 세포 파편의 대부분이 제거되어 나왔다. 탈세 포화 후, 조직을 동결 건조 후 분말로 cryomilled이다. 매트릭스 분말 산성 펩신 소화 용액에 48 시간 동안 절단 한 후, 프리 겔 용액을 형성하기 위해 중화된다. 프레 겔 용액의 겔화 37 ° C에서 배양하여 유도 할 수 있고, 곧바로 다음 중화 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 코팅은 C에 대한 비 처리 판의 프리 겔 용액을 사용하여 형성 될 수있다엘 첨부. 세포는 세포 골격을 통해 이전 또는 코팅에 도금 할 수있는 형성된 겔의 표면 상에 도금 된 3 차원 배양을 달성하기 위해 자기 조립 전에 프레 겔에 현탁 될 수있다. 전략에 변화가 겔화 온도, 강도, 또는 단백질 단편의 크기에 영향을 미칠 수 있습니다 발표했다. 하이드로 겔 형성 외에도 하이드로 겔 강성 genipin을 사용하여 증가 될 수있다.

서론

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체외 결과를 임상에 적용하는 것은 생물의학 연구자들이 직면한 가장 어려운 문제 중 하나입니다. 조직 배양 플라스틱에 대한 체외 연구는 더 쉽고 편리하며 높은 세포 생존력을 유지합니다. 1 이 접근법은 합리적인 출발점이지만, 임상 번역에 한계가 있는 결과를 보였다. 점점 더 많은 실험실에서 기존의 2차원 방법을 대체하기 위해 3차원 구조를 통합하고 있습니다. 생물학적 지지체에서 고분자 지지체에 이르기까지 다양한 3차원 환경에 대한 검토를 사용할 수 있습니다. 2,3

호

생물학적 프레임워크는 네이티브 매트릭스의 많은 단백질 및 글리코사미노글리칸 구성 요소를 포함하고 세포가 부착하고 인식할 수 있는 친숙한 결합 부위를 제공하기 때문에 생체 내 환경의 특성을 모방할 수 있습니다. 세포외 기질(ECM) 유래 물질은 세포 부착 및 증식을 위한 유능한 골격으로 나타났습니다. 4 ECM 하이드로겔 플랫폼의 적용을 제한하는 한 가지 문제는 겔화 후 본질적으로 약한 기계적 특성에서 비롯됩니다. 천연 조직은 종종 하이드로겔보다 훨씬 높은 기계적 특성을 가지고 있습니다. 무독성 가교제는 하이드로겔의 기계적 특성을 증가시켜 천연 조직 환경을 더 잘 모방할 수 ....

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프로토콜

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해결책 살균 필터 지도
DiH 2 O 예 DiH 2 O; 무균 여과
0.1 % 트리톤 X-100 솔루션 예 흄 후드에서 DiH 2 O 100 ㎖에 100 μL 트리톤-X 100 솔루션을 추가하고 용해 될 때까지 교반;
살균 필터.
2 % 데 옥시 콜레이트 솔루션 예 흄 후드에서 2g 나트륨 데 옥시 콜레이트 솔루션을 추가
100 ㎖ DiH 2 O 용해 될 때까지 교반 당; 살균 필터
1 M의 NaCl 예 DiH 2 O 1 L에 58.44 g의 NaCl을 추가; 용해 될 때까지 교반;
살균 필터

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결과

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이 방법을 사용하여, 우리는 정상 돼지, 래트, 마우스 폐 (도 1)로부터의 하이드로 겔을 제조 하였다. 폐 처리는 각각 5 ㎎, 40 ㎎, 및 ECM 분말 10g을 추정 제공한다. 공정의 개요는도 2에 도시되어있다. 과정에서 주요 시각화은 다음과 같습니다 : 데 옥시 콜레이트 세척 후 폐의 흰색 외관; 프레 겔을 형성 한 후에, 용액을 은폐되어야하고 4 ℃에서 저장하는 경우, 용액을 균질 개월 표시한다. 우리는 과정 (표 2)를 통해 오류의 원인을 파악하는 데 도움이되는 기본적인 문제 해결 테이블을 포함하고있다. 겔화 후, 수화겔 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 저장된다. 레올 로지 시험 겔의 90 % 이상은 37 ° C (도 3)에 도달 한 후 제 분에 발생하는 것을 확인한다. 형성된 하이드로 겔은 긴 PBS의 기간 있지만, 세포 부착 및 .......

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토론

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생물학 적분 측면 중 하나는 특정한 작업을 수행하는 계층 적 구조로 분자의 자기 조직이다. 연구실에서 (13)는, 자기 조립은 염 농도, 산도, 소화 기간 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 도시 된 바와 같이, 자기 조직화 하이드로 폼 가용화 된 단백질은 생리 학적 온도로 돌아 오면. 형성된 하이드로 겔은 생체 외에서 세포의 부착과 증식을 촉진 할 수있다.

ECM에서 생물 물리학 신호를 세포 반응 고분자를 사용하여 연구 할 수 없습니다. 생물 물리학 신호 조직 특이 적 세포 반응이 다른 조직을 이용하여 조사 할 수 없다. 재생 연구자 및 임상 decellularized 비계를 사용하여 조직 재생 및 상처 치유를 향상 생각합니다. 만성 폐 질환 환자는 장기 가용성을 증가시키고 면역 원성을 감소시키는 치료 개선이 필요합니다. 장기 특정 셀 ECM 상호 작용해야합니다또한 장기 생물학을 연구.

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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우리는 그대로 돼지의 폐 조직 기증에 대한 스미스 필드 팜을 감사드립니다. 우리는 또한 우리 자신의 장비를 사용할 수 있도록 박사 후 양 박사 크리스티나 당나라와 VCU 성형 외과 부서에 감사의 말씀을 전합니다. 히드로 겔 및 조직 샘플은 자금 조달 형태 NIH-NCI 암 센터 지원 그랜트에 의해 부분적으로 NIH - NINDS 센터 코어 그랜트 (5) P30 NS047463에서 자금에 의해 부분적으로 지원되는 해부학 및 신경 생물학 현미경 시설의 VCU 부서에서 SEM을 준비했다 P30의 CA016059. VCU 나노 기술 핵심 특성화 시설 (NCC)에서 샘플의 SEM 영상. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation), CMMI 1351162에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
트리톤 X-100 Fisher ScientificBP151-100눈 보호구와 장갑을 낀 채 흄 후드에 사용하십시오.
소듐 데옥시콜레이트시그마-알드리치D6750-100g후드에 보안경과 장갑과 함께 사용하세요.
마그네슘 황산염Sigma-AldrichM7506-500g없음
염화칼슘Sigma-AldrichC1016-500g없음
DNase Sigma-AldrichD5025-150KU없음
HClSigma-Aldrich258148-500ML보안경과 장갑과 함께 사용하십시오.
PepsinSigma-AldrichP6887-5G보안경과 장갑이 있는 흄 후드에 사용하십시오.
수산화나트륨Fisher ScientificBP359-500보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.
GenipinWako Chemicals078-03021눈 보호구 및 장갑과 함께 흄 후드에 사용하십시오.
PBS 10x품질 생물학119-069-151없음
PBSVWR45000-448없음
여과지Whatman8519N/A
핸드 펌프Fisher Scientific10-239-1N/A
대학원 비커VitLab445941N/A
크라이오밀SPEX6700크라이오글러브와 눈 사용 보호.
동결 건조기FTS FlexiDry장갑을 사용합니다.
RheometerDiscoveryHR-2장갑과 보안경을 착용하십시오.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
  2. Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
  3. Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture pro....

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재인쇄 및 허가

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