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방법 논문

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

11.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55094

⸱

2017년 1월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 2Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

초록

여기에서는 시험 관내 폐 세포 배양 여러 컴포넌트 세포 배양 하이드로 겔을 형성하기위한 방법을 제시한다. 돼지, 쥐, 또는 마우스에서 블록의 폐 조직 엔 건강을 시작으로, 조직은 관류 및 세포 파편을 제거하기 위해 후속 화학 세제에 잠겨있다. 처리 전후의 조직 학적 비교는 이중 가닥 DNA 및 알파 갈 락토시다 제 염색을 95 % 이상 제거하는 것을 확인 세포 파편의 대부분이 제거되어 나왔다. 탈세 포화 후, 조직을 동결 건조 후 분말로 cryomilled이다. 매트릭스 분말 산성 펩신 소화 용액에 48 시간 동안 절단 한 후, 프리 겔 용액을 형성하기 위해 중화된다. 프레 겔 용액의 겔화 37 ° C에서 배양하여 유도 할 수 있고, 곧바로 다음 중화 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 코팅은 C에 대한 비 처리 판의 프리 겔 용액을 사용하여 형성 될 수있다엘 첨부. 세포는 세포 골격을 통해 이전 또는 코팅에 도금 할 수있는 형성된 겔의 표면 상에 도금 된 3 차원 배양을 달성하기 위해 자기 조립 전에 프레 겔에 현탁 될 수있다. 전략에 변화가 겔화 온도, 강도, 또는 단백질 단편의 크기에 영향을 미칠 수 있습니다 발표했다. 하이드로 겔 형성 외에도 하이드로 겔 강성 genipin을 사용하여 증가 될 수있다.

서론

체외 결과를 임상에 적용하는 것은 생물의학 연구자들이 직면한 가장 어려운 문제 중 하나입니다. 조직 배양 플라스틱에 대한 체외 연구는 더 쉽고 편리하며 높은 세포 생존력을 유지합니다. 1 이 접근법은 합리적인 출발점이지만, 임상 번역에 한계가 있는 결과를 보였다. 점점 더 많은 실험실에서 기존의 2차원 방법을 대체하기 위해 3차원 구조를 통합하고 있습니다. 생물학적 지지체에서 고분자 지지체에 이르기까지 다양한 3차원 환경에 대한 검토를 사용할 수 있습니다. 2,3

호

생물학적 프레임워크는 네이티브 매트릭스의 많은 단백질 및 글리코사미노글리칸 구성 요소를 포함하고 세포가 부착하고 인식할 수 있는 친숙한 결합 부위를 제공하기 때문에 생체 내 환경의 특성을 모방할 수 있습니다. 세포외 기질(ECM) 유래 물질은 세포 부착 및 증식을 위한 유능한 골격으로 나타났습니다. 4 ECM 하이드로겔 플랫폼의 적용을 제한하는 한 가지 문제는 겔화 후 본질적으로 약한 기계적 특성에서 비롯됩니다. 천연 조직은 종종 하이드로겔보다 훨씬 높은 기계적 특성을 가지고 있습니다. 무독성 가교제는 하이드로겔의 기계적 특성을 증가시켜 천연 조직 환경을 더 잘 모방할 수 있습니다. Genipin은 치자나무 식물에서 유래한 무독성 천연 교차결합제(natural crosslinker)로, 제니핀 농도의 변화에 따라 ECM의 기계적 특성을 밀접하게 조정할 수 있는 능력을 가지고 있습니다5,6.

신체의 거의 모든 세포는 ECM에 존재하며 ECM에서 조직하여 생산하거나 유지합니다. 모든 장기 또는 시스템의 조직, 상태 및 기능에서 ECM의 보편적 중요성에 대한 새로운 초점은 체외 조사를 위한 매트릭스 기반 플랫폼의 생산을 촉발했습니다. 돼지 소장 점막하(Porcine Small intestine submucosa)는 가장 광범위하게 연구된 자연 유래 골격으로, 힘줄, 인대, 골격근4, 심지어 뼈7를 재생하는 데 사용되어 왔습니다. 다른 장기와 기증자 종의 매트릭스도 우수한 조직 재생 잠재력을 보여주었습니다. 외부 ECM 구성 요소를 사용하면 면역 조절과 관련된 문제가 최소화됩니다. 숙주 세포 물질이 제거된 후, 나머지 ECM은 다른 모든 포유류 종과 아미노산 함량 및 조직이 유사할 것입니다8. 체외에서 세포-ECM 상호 작용을 검사하는 가장 좋은 방법은 장기 특이적 ECM 골격을 활용하는 것이라는 생각이 점점 더 커지고 있습니다. 각 기관은 단백질과 프로테오글리칸의 고유한 구성을 제공하여 세포 틈새를 만듭니다. 틈새(nicech)는 생물물리학적 신호전달에 기여하는 세포외 기질의 구조적, 기능적, 심지어 효소적 분해를 제공합니다. 생체 내 미세환경과 가장 유사한 시험관 내 미세환경을 얻기 위해 조직 특이적 ECM을 사용하면 연구를 위한 세포 틈새를 최적화할 수 있습니다.

이 프로토콜의 목표는 폐 ECM에 고유한 하이드로겔 골격을 확립하는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 폐 세포와 ECM 상호 작용에 대한 체외 연구를 위한 플랫폼을 제공합니다.

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프로토콜

해결책 살균 필터 지도
DiH 2 O 예 DiH 2 O; 무균 여과
0.1 % 트리톤 X-100 솔루션 예 흄 후드에서 DiH 2 O 100 ㎖에 100 μL 트리톤-X 100 솔루션을 추가하고 용해 될 때까지 교반;
살균 필터.
2 % 데 옥시 콜레이트 솔루션 예 흄 후드에서 2g 나트륨 데 옥시 콜레이트 솔루션을 추가
100 ㎖ DiH 2 O 용해 될 때까지 교반 당; 살균 필터
1 M의 NaCl 예 DiH 2 O 1 L에 58.44 g의 NaCl을 추가; 용해 될 때까지 교반;
살균 필터
DNase의 솔루션 예 12,000 추가단위 DNase의 1 L DiH 2 O에; 0.156 g 황산 추가
(무수물), 및 0.222 g의 CaCl2를; 용해 될 때까지 교반; 살균 필터
PBS 예 , 27.2 g 나 2 HPO 4 · 7H 2 O (이염 수화물)를 결합
80g의 NaCl, 10 L DiH 2 O와 2g의 KCl; 용해 될 때까지 교반; 7.4으로 산도를 조정; 살균 필터

표 1 : 조직 탈세 포화에 필요한 솔루션. 탈세 포화 프로세스에 대한 위의 솔루션을합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. 약 2.5 L은 한 돼지의 폐를 위해 필요합니다.

1. 하이드로 겔 형성

  1. (참조 9,10에서 적응) 돼지 폐 탈세 포화
    1. 마음과 vasc으로, 도축장에서, 블록 엔 정상 돼지의 폐를 구합니다ulature 그대로.
    2. 마음에 최대한 가까운 혈관을 절단, 마음을 멀리 해부 조직 가위 또는 메스를 사용, 나머지 혈관이 관류에 대한 이후 단계에서 사용됩니다.
    3. 조심스럽게 메스 나 가위를 사용하여 기관, 기관지 및 혈관 주위의 결합 조직을 멀리 해부하다.
      참고 : 탈세 포화 과정의 효과를 방해 할 수 큰 상처 또는 천공 늑막 통해 무기폐 또는 혈관 폐색 많은 양의없이 폐를 선택하여 절차의 나머지에 사용할 최적의 폐를 결정합니다.
    4. (처분 할 수있다 심장, 결합 조직 및 제거 된 폐의 로브) 가능한 한 기관에 부착만큼 기관지를 떠나 최적 폐를 버려야. 하나의 폐는 기관지와 혈관에 부착 된 남아가 있어야합니다.
      참고 : 원하는 경우 조직학에 대한 섹션을 유지. 9
    5. 페이지에 클램프 또는 봉합와 연결이 끊어진 기관지를 닫습니다하지 못하 초과 역류.
    1. (표 1) 필요할 때까지 4 ° C에서 탈세 포화 솔루션과 냉장을 준비합니다.
    2. 폐동맥 맞게 폐동맥 및 기관 모두를 통해 폐 조직을 탈 이온수로 3 회 관류하는 유관 핸드 펌프를 사용. 제마다 혈관을 관류. 혈관에 약 1 L 각 관류에 대한 기관에 1.5 L로 시작하지만, 세포 파편 제거로 더 많은 액체가 시스템을 통해 관류 할 수 있습니다.
    3. 트리톤 X-100 용액을 모두 혈관과 기관을 관류.
    4. 4 ℃에서 24 시간 동안 트리톤 X-100 용액에 폐 조직을 잠수함.
    5. DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다.
    6. 옥시 콜레이트 솔루션을 모두 혈관과 기관을 관류.
    7. 4 ℃에서 24 시간 동안 옥시 콜레이트의 조직 섹션 잠수함.
    8. DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다.
    9. NaCl 용액으로 모두 혈관과 기관을 관류.
    10. 4 ℃에서 1 시간 동안 여과 NaCl 용액에 조직을 잠수함.
    11. DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다.
    12. DNase의 솔루션을 모두 혈관과 기관을 관류.
    13. 4 ℃에서 1 시간 동안 여과 DNase의 솔루션에서 조직을 잠수함.
    14. 혈관 및 기관 PBS로 5 회를 모두 관류.
    15. 눈에 띄는 연골 조직, 기관 만 호흡 영역 (주로 주변 지역)을두고기도를 수행에서 (주로 폐문과 폐의 중간 부분 주위에 있음) 직경의 모든 세관 2mm 이상을 멀리 해부하다.
    16. 1 인치 절 이하에 조직을 해부하다. 조직의 방향은이 단계에서 문제가되지 않습니다.
    17. 50 ML 원뿔 튜브를 초과하는 액체와 장소 조직을 따르십시오. -80 ° C에서 조직을 동결.
      참고 : 조직학 세포 및 세포 debri의 제거를 보장하는 섹션을 유지S 원한다면. 우리는 H & E를 사용, α - 갈 락토시다 아제, picogreen, 하이드 록시 프롤린, 닌히 드린, 알 시안 블루, SDS-PAGE 및 질량 분석의 특징입니다. 9
  2. 폐 처리
    1. decellularized 폐 조직을 포함하는 냉동 튜브의 뚜껑을 제거합니다.
    2. 튜브 입구에 필터 종이를 놓고 고무 밴드로 고정합니다.
      참고 : 튜브 및 내용은 여전히 ​​고정 될 때까지 그렇지 않으면 -80 ° C에 배치 동결해야합니다.
    3. 모든 초과 액체 제조 업체의 지시에 따라 동결 건조기를 사용하여, 사라 될 때까지 조직을 동결 건조. 밀 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
    4. 근로 조건에 절연 및 내부 부품의 온도를 냉장고 밀에 액체 질소를 추가 시작하기 전에.
    5. 밀 튜브에서 자기 밀 줄을 제거하고 바닥을 충당하기 위해 조직을 추가합니다.
    6. 밀 줄을 교체하고 느슨하게 포장 조직을 추가합니다. 밀 바는 여전히 자유롭게 이동해야합니다.
    7. 밀 튜브와 괞 찮아을 닫습니다냉동 공장에서 가전.
    8. 최대 적재 선에 액체 질소를 입력합니다.
    9. 냉동기 밀 미분말에 모든 조직 (약 5 분 ~ 600 분의 충돌 속도 -1)와, 스테인레스 스틸 충격기 폴리 카보네이트 실린더뿐만 아니라 제조자 지시에 따라 냉동기 밀을 사용하여 스테인리스 단부 플러그이다. 사용 전까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
  3. 마이크로 다공성 겔 형성 (8 ㎎ / ㎖) (참조 각색 9,11)
    1. 1 % 추가 (W / V)를 decellularized 분말 및 0.1 % (w / v)의 0.01 M 염산을 펩신, 일정한 교반하에 들면, 실온에서, (액체의 최상위에 흐름을 볼 수 있어야한다) 48 시간.
      주 : 분말 정적 분말이 튜브 벽면에 과잉 세척 할 기회를 제공 한 후이므로 염산을 추가 충전된다.
    2. 48 시간 동안 소화 한 후, 5 분 동안 얼음에 솔루션 및 시약을 배치합니다.
    3. 냉장 10 % 사용 (v / v)의 0.1 M NaOH를,D 11.11 % (v / v)의 10 배 PBS는 7.4의 생리적 산도에 소화 단백질 용액을 가지고 (농도를 1 배 전체 솔루션을 가지고).
      참고 :이 솔루션은 이제 일주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 원하는 경우 유변학 (9)를 사용하여 겔화 반응 속도를 수행합니다.

2. 기계적 강도를 개선하기 위해 하이드로 겔 가교

  1. 1 %, 0.1 % 및 V genipin 가교 용액 / w 0.01 % 용액을 10 % DMSO에 genipin 분말의 필요량을 용해시켜 제조 하였다.
  2. 1 시간 동안이 용액을 15 분마다 와동.
  3. 이전 부분 1.3.4에서 조립 된 ECM 하이드로 겔 (96 웰 플레이트의 각 웰에 100 μL)를 커버하는 genipin 솔루션을 추가합니다.
  4. 37 ° C에서 24 시간 동안 가교 각 ECM 하이드로 겔을 둡니다.
  5. 세정액이 더 이상 청색까지 ECM 하이드로 겔을 PBS로 3 회 씻어 없다. 가교 하이드로 겔은 더 특성화 및 CE에 대한 준비가 될 것입니다LL 문화 연구.

미세 다공성 젤 3. 세포 배양

  1. 이차원 코팅
    1. 1.3.3에서 용액을 사용하여 96 웰 비 - 처리 된 조직 배양 플레이트의 각 웰에 프리 겔 용액 20 μL를 추가한다.
    2. 4 ° C에서 냉장 하룻밤 단백질 흡착 플레이트 할 수 있습니다.
    3. 기음 프레 겔 용액 PBS로 씻어.
    4. 통로 세포 (9).
    5. 우물에 10,000 세포 / cm 2를 추가합니다.
    6. 물론 당 100 μL 미디어를 높이고 37 ° C에서 품어.
  2. 삼차원 세포 배양 9
    1. 1.3.3에서 용액을 사용하여, 프리 겔 용액을 100 세포 / ml의 농도로 세포 펠렛을 재현 탁.
    2. 신속 3D 세포 배양 용 ~ 500 μm의 두께 하이드로 겔을 형성하기 위해, 96 웰 플레이트의 각 웰에 프레 겔 세포 현탁액 16 μL 분주.
    3. 30, 37 ° C에서 품어젤 분 형성한다.
    4. 형성된 하이드로 겔의 상단에 미디어 100 μl를 추가하고 37 ° C에서 품어.
  3. 가변 강성 젤에 세 차원 세포 배양
    1. 96 웰 플레이트의 각 웰에 피펫 1.3.3에서 프리 겔 용액을 100 μL 용액을 사용.
    2. 겔을 형성하도록 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
      참고 : 여기에 사용할 수있는 2 부에서 단계를 상호 결합.
    3. 통로 세포 (9).
    4. 우물에 10,000 세포 / cm 2를 추가합니다.
    5. 물론 당 100 μL 미디어를 높이고 37 ° C에서 품어.

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결과

이 방법을 사용하여, 우리는 정상 돼지, 래트, 마우스 폐 (도 1)로부터의 하이드로 겔을 제조 하였다. 폐 처리는 각각 5 ㎎, 40 ㎎, 및 ECM 분말 10g을 추정 제공한다. 공정의 개요는도 2에 도시되어있다. 과정에서 주요 시각화은 다음과 같습니다 : 데 옥시 콜레이트 세척 후 폐의 흰색 외관; 프레 겔을 형성 한 후에, 용액을 은폐되어야하고 4 ℃에서 저장하는 경우, 용액을 균질 개월 표시한다. 우리는 과정 (표 2)를 통해 오류의 원인을 파악하는 데 도움이되는 기본적인 문제 해결 테이블을 포함하고있다. 겔화 후, 수화겔 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 저장된다. 레올 로지 시험 겔의 90 % 이상은 37 ° C (도 3)에 도달 한 후 제 분에 발생하는 것을 확인한다. 형성된 하이드로 겔은 긴 PBS의 기간 있지만, 세포 부착 및 ...

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토론

생물학 적분 측면 중 하나는 특정한 작업을 수행하는 계층 적 구조로 분자의 자기 조직이다. 연구실에서 (13)는, 자기 조립은 염 농도, 산도, 소화 기간 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 도시 된 바와 같이, 자기 조직화 하이드로 폼 가용화 된 단백질은 생리 학적 온도로 돌아 오면. 형성된 하이드로 겔은 생체 외에서 세포의 부착과 증식을 촉진 할 수있다.

ECM에서 생물 물리학 신호를 세포 반응 고분자를 사용하여 연구 할 수 없습니다. 생물 물리학 신호 조직 특이 적 세포 반응이 다른 조직을 이용하여 조사 할 수 없다. 재생 연구자 및 임상 decellularized 비계를 사용하여 조직 재생 및 상처 치유를 향상 생각합니다. 만성 폐 질환 환자는 장기 가용성을 증가시키고 면역 원성을 감소시키는 치료 개선이 필요합니다. 장기 특정 셀 ECM 상호 작용해야합니다또한 장기 생물학을 연구.

...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

우리는 그대로 돼지의 폐 조직 기증에 대한 스미스 필드 팜을 감사드립니다. 우리는 또한 우리 자신의 장비를 사용할 수 있도록 박사 후 양 박사 크리스티나 당나라와 VCU 성형 외과 부서에 감사의 말씀을 전합니다. 히드로 겔 및 조직 샘플은 자금 조달 형태 NIH-NCI 암 센터 지원 그랜트에 의해 부분적으로 NIH - NINDS 센터 코어 그랜트 (5) P30 NS047463에서 자금에 의해 부분적으로 지원되는 해부학 및 신경 생물학 현미경 시설의 VCU 부서에서 SEM을 준비했다 P30의 CA016059. VCU 나노 기술 핵심 특성화 시설 (NCC)에서 샘플의 SEM 영상. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation), CMMI 1351162에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
트리톤 X-100 Fisher ScientificBP151-100눈 보호구와 장갑을 낀 채 흄 후드에 사용하십시오.
소듐 데옥시콜레이트시그마-알드리치D6750-100g후드에 보안경과 장갑과 함께 사용하세요.
마그네슘 황산염Sigma-AldrichM7506-500g없음
염화칼슘Sigma-AldrichC1016-500g없음
DNase Sigma-AldrichD5025-150KU없음
HClSigma-Aldrich258148-500ML보안경과 장갑과 함께 사용하십시오.
PepsinSigma-AldrichP6887-5G보안경과 장갑이 있는 흄 후드에 사용하십시오.
수산화나트륨Fisher ScientificBP359-500보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.
GenipinWako Chemicals078-03021눈 보호구 및 장갑과 함께 흄 후드에 사용하십시오.
PBS 10x품질 생물학119-069-151없음
PBSVWR45000-448없음
여과지Whatman8519N/A
핸드 펌프Fisher Scientific10-239-1N/A
대학원 비커VitLab445941N/A
크라이오밀SPEX6700크라이오글러브와 눈 사용 보호.
동결 건조기FTS FlexiDry장갑을 사용합니다.
RheometerDiscoveryHR-2장갑과 보안경을 착용하십시오.

참고문헌

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