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방법 논문

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

12.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55099

⸱

2017년 2월 3일

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

이 논문에서

요약

자식 작용의 활성화는 질병의 숫자의 예방에 유용하다. 생리 학적 접근 방법 중 하나는 생체 내에서 자식 작용은 운동이다 유도한다. 여기에서 우리는 유산소 운동으로 자식 작용을 활성화하고 마우스에서 자식 작용의 수준을 측정하는 방법을 보여줍니다.

초록

자가포식은 세포 항상성, 기능 및 분화에 필수적인 리소좀 분해 경로입니다. 스트레스 조건에서 자가포식이 유도되고 벌크 사이토졸, 손상된 세포 기관 및 잘못 접힌 단백질과 같은 다양한 화물을 표적으로 하여 리소좀의 분해를 수행합니다. 이렇게 생성된 영양소 분자는 새로운 단백질 합성과 ATP 생산을 위해 세포질로 다시 재활용됩니다. 자가포식의 상향조절은 많은 질병의 발병에 유익한 효과를 가지고 있으며, 자가포식을 활성화하기 위한 약리학적, 생리학적 전략이 보고되고 있습니다. 유산소 운동은 최근 쥐의 근육, 간, 심장 및 뇌를 포함한 여러 기관에서 효율적인 자가포식 유도제로 확인되었습니다. 여기에서는 강제 트레드밀 운동 또는 자발적인 바퀴 달리기를 통해 생체 내에서 자가포식을 유도하는 절차를 보여줍니다. 또한 자가포식소체와 함께 리소좀으로 운반되어 분해되는 마커 단백질 LC3 및 p62를 사용하여 마우스 조직의 자가포식 수준을 정량적으로 분석하는 미시적 및 생화학적 방법을 시연합니다.

서론

자식 작용은 기아 저산소증 1, 2와 같은 다양한 스트레스 조건에 응답하여 유도 된 진화 적 보존 열화 경로이다. 자식 작용하는 동안 두 번 막 소포는, 불필요하거나 손상된 세포 내 구성 요소를 통합하고 분해 3 리소좀로 수송, autophagosomes을했다. 기저 자식 작용은 신경 퇴행, 종양 및 2 형 당뇨병 4, 5, 6을 포함하여 많은 질환에 연루되어 세포 기능 및 유기체 개발 및 손상된 기초 자식 작용을 위해 필수적이다.

가장 잘 알려진 생리 자식 작용의 유도는 기아이다. 그러나, 두 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 기아는, 예를 들면, 효과적으로 동물에서 자식 작용을 유도하는 쥐의 음식 제한의 48 시간을 오랜 기간 소요대부분의 기관입니다. 둘째, 기아는 거의 때문에 뇌에서 상대적으로 안정적인 영양 공급, 뇌 자식 작용을 유도한다. 사실, 많은 약물이 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 없기 때문에, 저분자 유도제에 의해 자식 작용 유도를 검출하는 것이 곤란하다. 따라서, 더 좋은 질병 발병 자식 작용 활성의 기능을 분석하기 위해, 최근 운동 시간 7, 8, 9 단기간에 자식 작용을 유도하는보다 강력한 생리 방법임을 발견했다. 기아와 비교할 때, 자식 작용을 효과적으로 디딜 방아 빠른 30 분을 실행하여 유도된다. 따라서, 운동은 의료 혜택을 매개 질병을 예방 자식 작용의 메커니즘을 연구하는 편리하고 강력한 생리 학적 접근 방식이다.

LC3 및 P62을 포함 자식 작용 활성의 검출을위한 여러 단백질 마커가있다. LC3 (미세 소관 - 관련 단백질 1A / 1B-빛 Chain 3) 세포질 단백질이다 (LC3-I는 자식 작용의 유도에 따라 PE (포스파티딜 에탄올 아민)에 결합된다)을 형성. PE-LC3 지질 화 (LC3-II 양식) autophagosomal 막에 채용하고 GFP로 표지 때 autophagosomes을 시각화 할 수있다. 현미경에서 autophagosomes의 구조를 반점하는 세포질에서의 전위는 자식 작용 유도의 표시입니다. P62 (예 유비퀴틴 단백질 등) 자식 작용 기판 용화물 수용체이고,도 autophagosomes에 포함된다. 단백질이 autophagosomes 함께 리소좀에서 분해되기 때문에, 그 농도는 자식 작용의 플럭스를 측정하는데 사용될 수있다. 여기에서 우리는 강제 운동 (러닝 머신)과 자발적 운동 (바퀴를 실행)을 포함한 유산소 운동에 의해 유발 된 다른 마우스 조직에서 자식 작용을 정량화하기 위해 이러한 마커를 사용하는 방법을 보여줍니다. 동일한 절차가 다른 유도제의 투여 후 생체 내 자식 작용의 측정에 적용 할 수있다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 노스 웨스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 지침에 따라 수행 하였다.

1. 마우스 모델

  1. 운동 훈련에 8~12주 된 마우스를 사용합니다. 생체 내에서 행사에 의한 자식 작용을 감지하기 위해 영상 검사, 생화학 적 분석을위한 C57BL / 6 마우스의 GFP-LC3 형질 전환 마우스 (C57BL / 6 배경)를 사용합니다.

2. 운동에 의한 자식 작용

  1. 러닝 머신 설치 - 강제 운동
    1. 적응 및 2 일 동안 10 ° 오르막 오픈 러닝 머신에서 쥐를 훈련. 1 일에서 5 분 동안 마우스를 운동 8m / min으로하고, 2 일, 10m 또 다른 5 분 뒤에 8m / 분에서 5 분 동안 마우스를 운동 / 10 분. 부드러운 손을 찔러으로 실행하기 위해 쥐를 격려한다.
    2. 3 번째 날에, 마우스는 10 ° 오르막 디딜 방아, starti에 90 분 동안 실행하는 하나의 한판 승부를 받아야 할10m / 분의 속도로 ng를. 40 분 후, 30 분의 총 1m / 분으로 10 매 분의 속도로 러닝 머신 속도를 증가시키고, 다음의 비율로 속도를 증가 1m /가 될 때까지 매 5 분 분 17m / 분 운동 시간 90 분 거리를 실행 1,070m의 총.
    3. 낮은 강도 범위 (1.2 Hz에서)에 전기 자극을 설정하고 반복 발 충격을 방지하기 위해 실행하는 마우스 바랍니다.
    4. 조직 컬렉션의 경우, 즉시 운동 후 자궁 전위 다음 이소 플루 란 흡입 쥐를 안락사. 기타 승인 안락사 방법은 또한 CO2 또는 다른 마취제 IP 주입이 사용될 수있다. 자식 작용의 수준은 안락사의 방법에 의해 영향을받는 것으로 보이지 않는다.
  2. 실행 휠 설정 - 자발적인 운동
    1. 단일 보관 마우스로 케이지 안에 마우스 실행 휠 (11.4 cm 직경)을 놓습니다.
    2. 자전거 주행 거리계를 사용하여 실행중인 용량을 확인합니다.358에서 [휠의 전체 회전 당 (mm)에 거리] 휠 매개 변수를 설정 (11.4 * π). 24 시간 후 주행 거리를 측정한다.
    3. 마우스가 실행중인 휠 2 주 동안 자발적으로 실행할 수 있습니다. 조직 컬렉션의 경우, 실행 기간 후 아침에 마우스를 희생.

3. 자식 작용 플럭스 평가

  1. 휴식과 운동 조건에서 autophagic 플럭스를 측정하기 위해, 삼일의 자식 작용 억제제 클로로퀸과 쥐를 치료하고 PBS로 처리 된 마우스에 비교합니다.
    1. PBS (5 ㎎ / ㎖)에 클로로퀸을 용해하고, 복강 세 일 연속 50 ㎎ / ㎏ / 일의 용량으로 마우스로 클로로퀸을 주입. 쥐를 희생 마지막 주사 후 조직에게 3 시간을 수집합니다.
    2. 운동 생쥐를 들어 50 ㎎ / ㎏ / 일의 투여 량으로 개의 연속 일 클로로퀸 그들을 전처리. 셋째 날, 후 클로로퀸의 동일한 농도로 마우스를 주입하고,90 분은 그들에게 또 다른 90 분 동안 러닝 머신에서 실행 할 수 있습니다.
    3. 자궁 경부 전위 다음에 이소 플루 란 흡입 쥐를 안락사. 클로로퀸의 총 배양 시간 제어 (휴식) 마우스 (3 시간)과 동일 있도록 즉시 실행 한 후 조직을 수집합니다.
      주 : 또는 마우스 조직에서 자식 작용 플럭스를 결정 클로로퀸의 단일 주입을 사용한다.

4. 조직 수확 및 고정

  1. 7.4의 최종 pH에서 PBS에서 : 조직 수확에 앞서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (필수 개인 보호 장비 PFA주의)을 준비합니다. 4 ° C에서 두 솔루션을 저장합니다.
  2. (GFP-LC3 마우스 용) 4 % PFA 20 ㎖ - 15 30 ML의 주사기를 입력합니다. 20 G 카테터 바늘과 주사기를 연결합니다.
  3. 운동 후, 자궁 경부 전위 다음에, 이소 플루 란 흡입하여 쥐를 안락사.
  4. 그 바에서 깨끗한 작업 표면에 동물을 배치CK. 잘라 마음을 노출 다이어프램을 절단하여 흉강을 엽니 다.
  5. 폐와 간은 완전히 창백 설정 될 때까지, 피가 나올 수 있도록 간장에 작은 절개를 확인하고 카테터를 통해 심장의 우심실로 천천히 15 ml의 4 % PFA의 총을 주입. / hr로 90 ㎖로 일정 유량 주사기 펌프를 이용하여 운동 세션 직후 마우스 관류.
  6. 재관류 후, 바늘을 제거하고 관심 조직 (예 : 뇌 (11)과 골격근)를 수집합니다. 골격근의 경우, 광근 lateralis을 해부하다. 간략하게, 대퇴사 지역화 근육을 노출 뒤쪽 다리의 피부를 당겨 12 대퇴 및 대퇴골의 상부에 부착 된 외부 근육이다 광근 lateralis를 해부.
  7. 또한 고정 및 탈수를 들어, 4 ° C에서 24 시간 동안 4 % PFA에 GFP-LC3 마우스의 조직을 배치 한 다음 15 %로 전송4 ° C에서 자당 PBS 하룻밤 또는 조직이 정착 될 때까지 다음 밤새 4 ° C에서 30 % 자당 PBS에 이상 저장. 그들은 강한 빛에 민감 할 수 있으므로 가능한 한 많은 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오.
  8. 웨스턴 블롯 분석을 위해 액체 질소에 직접 C57BL / 6 마우스에서 조직을 동결하고, -80 ° C에서 보관 웁니다.

GFP-LC3 puncta의 5. 이미징 분석

  1. 조직 프로세스
    1. 같은 레이블이 작은 페트리 접시에 몇 분 동안 "최적의 절단 온도 화합물"OCT ()와 같은 매체를 포함에서 조직 (이전 PFA에 고정 30 % 자당에 저장)을 사전 처리합니다.
    2. 조직을 충당하기에 충분한 신선한 OCT를 포함하는 표시 cryomold에 조직을 전송합니다. 방향을 cryomold의 아래쪽으로 절편 표면합니다 (광근의 크로스 섹션은 헤미 - 두뇌 근육과 시상 부분을 lateralis). 거품의 형성을 피할 것.
    3. FREOCT를 흰색으로 바뀔 때까지, 드라이 아이스를 가득 덮여 거품 쿨러에 몇 분 동안 cryomold을 배치하여 샘플을 EZE. 레이블 포일에서 개별 샘플을 감싸 비닐 봉투에 밀봉하고,에서 -80 ° C 하룻밤 이상을 저장할 수 있습니다.
    4. 슬라이드에 섹션을 10 ㎛의 두께로 샘플 부분을 절단하고, 마운트 그라 이오 스탯을 사용합니다. -20 ° C에서 슬라이드를 저장하고, 항상 가능한 빛으로부터 멀리 슬라이드를 유지합니다.
  2. 슬라이드 준비
    1. 냉동기로부터 슬라이드를 제거하고 실온에서 이들을 해동. DAPI와 매체를 장착 한 방울 조직 절편을 커버. 상단에 적절한 크기의 커버 슬립을 놓고 거품 형성을 피하기.
    2. , 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 매니큐어가 실온에서 어둠 속에서 건조 할 수 있도록 다음 4 ° C에서 빛 밀폐 용기에 슬라이드를 저장하거나 GFP-LC3의 puncta의의 영상 캡쳐를 진행 매니큐어를 사용합니다.
  3. 정량 - 형광 현미경에 의한 LC3의 puncta의
    1. 모든 샘플에 대해 동일한 조건에서 사진 (노출 및 설정)을 캡처, 표면 형광 현미경을 수행합니다. GFP를 들어, 525 나노 미터의 방출 파장을 사용한다; DAPI를 들어, 490 nm의를 사용합니다. 광근 lateralis에 대한 60X 목적과 뇌의 전두엽 피질 영역을 사용하여 샘플 당 10 개 이상의 이미지를 획득.
    2. 실험군 위해 멀게 통계 분석을 위해 각각의 이미지에서 2,500 ㎛의 (2)의 조직 영역에서의 GFP-LC3 puncta의 수를 정량화. "객체 카운트"자동 측정 기능을 이용하여, 각 샘플의 이미지 (10)의 평균 수를 계산한다. 광근에 대한 설정 근육이 lateralis : 임계 값 L = 10, H = 200; 배는 부드러운; 1X 깨끗하고 뇌의 전두엽 피질에 대한 설정은 다음과 같습니다 임계 값 L = 11, H = 200; 배는 부드러운; 1X 깨끗한.

자식 작용 마커 6. 웨스턴 블롯 분석

  1. <강한> 조직 프로세스
    1. 용해 완충액 준비한다 : 50 mM 트리스 - 염산 단계; 150 mM의 NaCl을; 1 mM의 EDTA; 1 % 트리톤 X-100; 프로테아제 억제제 및 포스 파타 아제 억제제 (새로 추가).
    2. C 스토리지 -80 °에서 C57BL / 6 마우스의 조직을 제거합니다. 다음 공정 전에 면도날 작은 조각으로 근육 조직을 잘라. (헤미 뇌에 대한) 800 μL 또는 샘플에 차가운 용해 버퍼 (광근 lateralis 용) 500 μl를 추가합니다. 중간 속도에서 균질화 4 ° C에서 샘플 균질화.
    3. 완전 회전 4 ° C에서 1 시간에 다른 30 분 동안 균질 혼합물을 용균.
    4. 4 ° C에서 10 분 동안 12,000 XG에서 균질를 스핀 다운 펠렛을 폐기하고 새로운 튜브에 뜨는를 수집합니다.
  2. 자식 작용 분석
    1. 제조자의 규격에 따른 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 조직 용 해물의 단백질 농도를 결정한다. 각 샘플을 정상화동일한 농도.
    2. 1에서 2 배 램 믈리 시료 완충액으로 샘플을 결합 : 1의 비율로, 5 ~ 95 ° C에서 끓인다 - 10 분, 및 P62 (항 P62 항체로, 자식 작용에 웨스턴 블롯 분석 (14), (13) 마커를 진행, 1 : 500 희석) 및 LC3 (항 LC3 항체, 1 : 500 희석). 얼음에 이상 배양이 LC3의 여러 성능이 저하 된 밴드를 생성 할 수 있으므로, 즉시 샘플 버퍼를 첨가 한 후 샘플을 끓인다.
    3. ImageJ에 농도계를 사용하여 분석하여 P62 및 LC3 대역을 정량화하고, 대응 액틴 밴드 값을 정규화.

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결과

이 프로토콜은 유산소 운동으로 마우스 조직에서 자식 작용을 유도하는 두 가지 방법을 설명합니다 순응의 두 일까지 진행 다중 차선 러닝 머신에 강제 운동의 90 분의 총; 또는 단일 보관 마우스를 사용하는 실행중인 휠에 자발적 운동 2 주. 각각의 운동 프로토콜에서, 우리는 다양한 기관에서 형광 현미경 및 웨스턴 블롯 분석에 의한 자식 작용 플럭스를 측정 할 수 있습니다.

우리는 운동 1 자식 작용을 모니터링하는 리포터 시스템으로 GFP-LC3 태그를 발현하는 형질 전환 마우스 선을 사용 하였다. 자식 작용 유도시, LC3는 반점 구조에서 autophagosome의 세포질에서으로 전위. 단면 처리 한 후 GFP-LC3의 puncta의 형성 직접 형광 현미경 (도 1a)에 의해 시각화 될 수...

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토론

자식 작용은 에너지를 제공하고 세포질 구성 요소 나 손상된 세포 소기관의 리소좀 저하에 의해 세포 독성을 감소시키는 이화 과정이다. 자식 작용을 공부하는 것은 세포의 항상성의 조절 및 스트레스 반응의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 새로운 모델과 방법론은 여러 병리학 적 과정 16, 17에 기여하는 방법을 손상 자식 작용 연구, 연구 분야 (15)에 등장하고있다.

영양분 결핍 (고갈)와 약물 유도 일반적 관내 및 생체 내에서 자식 작용을 유도하는 방법을 사용한다. 특히 동물 모델에 대한 이러한 방법은, 전체 결과에 영향을 미칠 수있는 악영향을 표시 할 수 있습니다. 이 기아의 적어도 48 시간을 필요로하기 때문에, 예를 들어, 자식 작용의 검출 가능한 수준을 유도하기 위해 동물 에너지 정규 모...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

기술 지원 및 지원을 제공해 주신 Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratory와 GFP-LC3 형질전환 마우스를 제공해 주신 Noboru Mizushima(도쿄 대학)에게 감사드립니다. A. R.과 C. H.는 Northwestern University의 창업 자금과 National Institutes of Health(DK094980)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디딜방아콜럼버스 악기150-RM Exer 3/6
마우스 러닝 휠Super Pet100079365직경 11.4cm
주행 거리계BellDASHBOARD 100
주사기 펌프KD ScientificKDS100
형광 현미경Nikon모델: 도립 현미경 ECLIPSE
CryostatLeicaCM 1850UV
균질화 기IKA003737001 / 모델 : T10 Basic S1
ChloroquineCAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
ParafolmaldehyeSIGMA-ALDRICHP6148개인 보호 장비가 필요합니다. 이 제품은 암을 유발하는 것으로 알려진 화학 물질인 포름알데히드 가스를 방출할 수 있습니다.
마운팅 미디어Vector LaboratoriesH-1200
p62 항체BD Biosciences610833
LC3 항체Novus BiologicalsNB100-2220
2x Laemmli 샘플 버퍼Bio-Rad Laboratories161-0737
ImageJNIH

참고문헌

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