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방법 논문

단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

11K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55106

⸱

2017년 1월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

이 논문에서

요약

미세유체 칩을 제작하여 탠덤 버블 생성을 위한 한 쌍의 금색 점과 근처의 단세포 패터닝을 위한 피브로넥틴 코팅 섬을 생성했습니다. 그 결과 생성된 유동장은 입자 이미지 속도계로 특징지어졌으며 세포막 반작용, 막 변형 및 세포 내 칼슘 반응을 포함한 다양한 생체 효과를 연구하는 데 사용되었습니다.

초록

이 논문에서는 먼저 정확하게 탠덤 거품 잘 정의 된 위치 및 형상에 가까운 패턴 개별 세포의 생성을 제어하는 ​​동일한 유리 기판 상에 금 도트 피브로넥틴 - 코팅 영역으로, 미세 유체 칩의 제작 프로토콜을 설명한다. 그런 다음 몇 마이크로 초 시간 지연 골드 도트 쌍 조명 개의 펄스 레이저를 이용하여 탠덤 기포의 생성을 보여준다. 우리는 고속 촬상하여 버블 버블 제트 상호 작용 형성을 시각화 입자 화상 속도계 (PIV)를 사용하여 생성 된 유동장의 특성. 마지막으로, 우리는 고분자 흡수와 세포막의 poration, 부착 인테그린 결합 구슬의 변위에 의해 결정 지역화 막 변형 및 비율 적 영상에서 세포 내 칼슘 응답을 포함하여 단일 세포 분석,이 기술의 일부 응용 프로그램을 제시한다. 우리의 결과는 빠르고 방향 분사 흐름이 프로임을 보여근접 성장한 세포의 표면에서 매우 국부적 전단 응력을 부과 할 수있는 탠덤 기포 작용에 의해 선보였. 또 다른 bioeffects는 탠덤 기포 셀의 유격 거리를 조정함으로써 분사 흐름의 강도를 변화시킴으로써 유도 될 수있다.

서론

휴대 이질성이, 유전자, 단백질 및 대사 산물의 확률 적 표현에서 발생하는 큰 세포 집단 내에 존재하는 세포의 적응과 진화 한 수 있도록 생물학의 기본 원리 역할을하는 성장 인식이 있습니다. 따라서, 개별 셀들은 상호 작용의 기능을 이해하는 인구 기반 벌크 측정을 사용하는 정확하고 신뢰할 수 없다. 단일 세포 분석을위한 새로운 기술을 개발하는 것은 따라서 생물학적 및 약리학 적 연구에서 높은 관심, 그리고 더 줄기 세포 생물학 및 암 치료 2-4의 주요 신호 전달 경로 및 과정을 이해하는데 사용될 수있다. 최근, 미세 유체 플랫폼의 등장은 크게 각 셀의 응답의 위치 설정, 처리, 및 관찰 신규 분석 전략 5 수행 된 단일 세포 분석을 용이하게하고있다.

캐비테이션 고강도 의한 암의 치료를 비롯한 생물 의학적 응용의 다양한 범위에 중요한 역할 초음파 (HIFU) 6- 집중 연극 충격파 쇄석술 의한 신장 결석의 비 침습적 단편화 (SWL) (7) 약물 또는 유전자 전달 sonoporation 8 및 유체 역학적 거품 캐비테이션 (9, 10)에 의해 세포 나 조직의 최근보고 된 파괴에 의해. 그럼에도 불구하고, 캐비테이션 버블 (들) 생체 조직과 세포와의 상호 작용의 동적 프로세스는 잘 이해되지 않았다. 이 초음파, 충격파, 지역 유압에 의해 생성 된 캐비테이션 개시 및 거품 역학의 임의성 때문이다; 또한, 특히, 단일 세포 수준에서 생체 세포의 본질적으로 복잡하고 빠르게 응답을 해결하는 기술을 가능하게 부족하다.

이러한 문제의, 그것은 놀라운 일이 아니다 때문에 거의 연구는 꿀벌을 가지고N은 잘 조절 된 실험 조건 하에서 버블 - 세포 상호 작용을 조사하는 것으로보고. 예를 들어, 각각의 세포의 세포막의 poration 서스펜션 (11)에 포획 및 인간 적혈구 (12)의 임펄스 큰 변형이 미세 채널에서 발생 된 레이저 단일 기포를 이용하여 입증되었다. 후자의 기술은, 그러나, 인해 핵 (13)의 존재에 진핵 세포에서 매우 작은 변형을 생성 할 수있다. 또한, 세포 현탁액을 처리 할 때 하류 bioeffects을 모니터하기가 어렵다. 다른 연구에서, 단일 부착 세포에서 세포막의 poration 및 / 또는 세포 칼슘 응답을 생성하는 세포 - 결합 된 미세 기포 (또는 초음파 조영제) 초음파 자극은 8보고되었다. 단일 부착 세포의 멤브레인의 poration 또한 광 흡수 트리 판 블루 용액 (14)을 포함하는 얇은 액체 층에 레이저 발생 탠덤 거품을 사용하여 제조하거나 할 수있다microchambers 15 광학적 흡수 기판을 통해 조사 마이크로 레이저 펄스에 의해 발생 된 진동에 의한 기포. 비교하면, 후자는 세포에 독성이기 때문에, 광 흡수 기판을 레이저 흡수 트리 판 블루 용액에 비해 이점을 갖는다. 더 중요한 것은, 레이저 발생하는 기포는 음향 여기 기포보다 거품의 크기 및 위치의 관점에서 더 많은 제어 가능하다. 그럼에도 불구하고, 모든 이전의 연구에서, 셀 형상, 방향, 접착 조건은 실질적으로 세포 반응 및 기계적 응력 (16)에 의해 생성 bioeffects 영향을 미칠 수있는 조절되지 않았다.

이전 연구에서의 이러한 단점을 극복하기 위해 최근 버블 발생 세포 패터닝 버블 버블 - 세포 상호 작용 및 실시간 미세 TECHN의 독특한 조합을 이용하여 구성되는 마이크로 유체 칩 내의 세포 반응의 생물 검정을위한 실험 시스템을 개발iques. 분야의 다른 사람들로부터 우리 실험 시스템을 구별 세 가지 특징은 1) 유리 기판 상에 마이크론 크기의 금 도트 패턴은 버블 발생 17 지역화 레이저 흡수성을 활성화하는 단계; 2) 동일한 기판 상에 세포 접착 세포 외 기질 (ECM)의 마이크론 크기의 아일랜드의 패터닝 위치 및 각 셀의 구조 모두를 제어하는 ​​단계; 3) 준 2 차원 공간에 3 차원의 기포 거품 세포 상호 작용 도메인의 치수의 압축은 모든 캡처, 유동장, 셀의 변형, 및 bioeffects 분사 거품 기포 상호 작용의 면내 시각화를 용이하게 하나의 간소화 된 영상 시퀀스 (그림 1D).

figure-introduction-1
그림 1 : 미세 유체 칩과 다른 분석의 개략도. 가) 채널을 가진 조립 된 미세 유체 칩은 파란색 잉크로 가득 시각화를위한. b)는 패턴 세포와 골드 점 마이크로 유체 칩 내부 영역은 (근접에있는 두 개의 골드 점 사이의 거리)는 40 μm의입니다. 작업 단위의 다수 쌍의 채널에 배치 될 수있다. 금 도트 한 쌍의 셀 패터닝 영역에 부착 된 헬라 세포로 이루어진 단일 작업 단위의 c) 이미지. 디바이스 동작의 d) 회로도. 하나의 셀을 준수하고 피브로넥틴로 코팅 된 "H"모양의 섬에 펼쳐집니다. 역상 진동으로 캐비테이션 기포 (탠덤 기포)의 쌍은 주변 타겟 셀을 향해 이동 빠르고 국소 젯의 생성을 선도 (도 4a 참조)을 금 도트에 펄스 레이저 빔을 조사함으로써 생성된다. 세포는 변형 고분자 흡수위한 porated 및 / 또는 직렬 기포 셀의 이격 거리 (S의 d)에 따라, 칼슘 응답을 자극 할 수있다.F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 플랫폼은 또한 형광 분석법 캐비테이션 유도 bioeffects 대한 세포 표면에 부착 된 기능화 된 비드와 결합 될 수있다. 특히,이 플랫폼은 단일 세포 수준에서 신뢰성 및 정량 분석을위한 방법을 연다. 지금까지, 우리는 직렬 버블 의한 세포막 변형 셀의 poration 세포 내 흡수, 생존, 세포 사멸, 세포 내 칼슘 응답의 분석 장치를 사용했다. 다음의 프로토콜에서는, 칩 제조 공정과 상술 한 각종 bioeffects을 분석하는 과정을 설명한다. 또한, 칩의 동작은 설명한다.

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프로토콜

1. 미세

참고 : 모든 미세 절차는 클린 룸에서 수행된다. 크롬 마스크는, 이전에 미세하도록 설계 그림 2 참조한다.

figure-protocol-1
도 2 미세 유체 칩의 채널 디자인 및 작업 유닛의 치수의 회로도. ) (파랑 및 빨강 유리 기판 상에 정렬 된 PDMS 마이크로 채널 (녹색) 및 패턴) 마스크 디자인. 작동 부 배열의 대표 부분의 마스크 디자인 b) 확대 된 이미지. 셀 패턴 (파란색)와 골드 도트의 쌍 (빨간색)를 보여주는 하나의 작업 단위의 C) 도식. 모든 길이 스케일은 오른쪽 아래에 표시됩니다. 고맙다을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 게르 버전입니다.

  1. 골드 도트 패턴
    주 :이 부착 개별 셀을 방지 할 정도로 기포 생성을위한 레이저 에너지를 흡수하기에 충분히 큰, 그러나 작도록 각 금 도트의 면적은 25 ~ 30 ㎛의 2 내에 있도록 설계된다. 금 도트 제조를위한 개략도도 3a에 도시되어있다.
    1. (화학 후드) 청소 유리 슬라이드
      1. 이소 프로필 알코올 (IPA)이어서 아세톤으로 유리 슬라이드를 세척하고 N 2 흐름을 건조.
      2. 10 분 피라냐 용액 슬라이드 (: H 2 O 2 = 4 일 H 2 SO 4)을 담근다.
      3. 슬라이드를 꺼내 DI의 물로 씻어 후 N 2 흐름을 건조.
      4. 10 분 동안 120 ℃에서 열판에서 유리 슬라이드를 굽는다.
      5. 90의 100 W에 플라즈마 애셔에서 슬라이드를 취급합니다.
    2. 스핀 코팅 (스핀 코팅 후드)
      1. 열판의 전원을 켜고 온도가 95 ° C에서 안정 될 때까지 기다립니다.
      2. 코팅 절차를 따르십시오 :
        500 RPM / s의 램프 5 초 동안 1,000 rpm으로;
        다음 1,000 rpm으로 / s의 램프 30 초 동안 3,000 rpm으로.
      3. 진공을 적용하여 스핀 코터 상 세정 된 유리 슬라이드에 고정한다.
      4. P-20와 슬라이드 표면을 덮고 코팅 레시피를 시작합니다.
      5. NFR-네가티브 포토 레지스트의 코팅 과정을 반복합니다.
      6. 60 초 동안 95 ° C에서 슬라이드 베이크 및 실온까지 냉각 될 때까지 기다린다.
    3. 석판 술
      1. 마스크 얼 라이너에 크롬 마스크를 탑재하고 패턴면이 아래로 슬라이드쪽으로 향하게되어 있는지 확인하십시오.
      2. 마스크와 유리 기판을 정렬 빠르게 UV 노출과 9의 하드 노출 모드에 포토 리소그래피 법을 설정하고.
      3. 자외선 노출을 수행 한 후, 95에서 슬라이드를 구워6; C 1 분 동안 한 후 실온까지 냉각하자.
    4. 개발
      1. 60 초 동안 현상액에서 슬라이드에 패턴을 개발합니다.
      2. 개발자에서 슬라이드를 제거 DI 물로 세척하고, N 2 흐름을 건조.
      3. 현미경으로 패턴 형상을 확인하고 측정 기능의 크기를 기록한다.
    5. 금 증착 (E-빔 증발) 및 리프트 오프
      1. 5 분 동안 120 ° C에서 슬라이드를 구워, 실온까지 냉각하자.
      2. 500 Torr 내지 100 W. 90 (S)에 대한 반응성 이온 에칭 (RIE) 장치의 플라즈마 슬라이드를 청소
      3. 금고의 Ti 5 nm이고, 전자빔 증착기 (17)를 이용하여 슬라이드에 Au로 15 내지.
      4. 레지스트 NFR의 상단에 금 휴식을 제거하는 용매 포토 레지스트 제거를 포함하는 유리 비커에 밤새 슬라이드를 만끽 해보세요.
      5. 슬라이드를 검색, 플러시 전아세톤 IPA t는 다음과 N 2 흐름을 건조.
      6. 90 초 동안 100 W의 산소 플라즈마 애셔 그것을 청소하기 전에 115 ° C에서 핫 플레이트에 슬라이드를 건조시킵니다.
  2. 리프트 오프 (lift-off)에 의해 분자 조립 패턴 (MAPL)
    주 : 각 피브로넥틴 피복 섬의 면적은 700-900 μm의 2 섬 응집 여러 셀의 가능성을 최소화하면서 사각형 영역 확산 적절한 헬라 세포를 용이 내에 설정된다. 세포 패터닝 섬의 제조를위한 개략도도 3b에 도시된다.
    1. 스핀 코팅
      1. 1.1.2 단계를 반복하지만, S1813은 양성 포토 레지스트를 115 ℃의 온도를 사용한다.
    2. 정렬 된 포토 리소그래피
      1. 마스크 얼 라이너에 크롬 마스크를 탑재하고 패턴 측면이와 슬라이드를 향해 아래로 향하게되어 있는지 확인골드 점.
      2. UV 노출의 9의 하드 노출 모드에 포토 리소그래피 레시피를 설정합니다.
      3. 공간적 기준으로서, 상기 마스크의 에지 주변에 위치 정렬 마크를 사용하여 하단의 슬라이드 상부 마스크 정렬.
      4. 마스크의 중앙 부분을 확인하고 패턴 기능이 제대로 정렬되어 있는지 확인합니다.
      5. 후 베이킹없이 자외선 노출을 완료합니다.
    3. 개발
      1. 1.1.3하지만 개발의 45 초와 핫 플레이트에 건조 및 N 2 저장소에 보존 이전 단계를 반복합니다.
  3. 화학 처리
    1. 패시베이션 솔루션을 준비 : 0.5 밀리그램 / 10 mM의 HEPES 버퍼 mL의 PLL-g-PEG.
    2. N 2 저장 부로부터 슬라이드를 검색하여 파라미터 설정으로 RIE를 이용하여 청소 : 500 Torr의 압력, 100 W 전력, 및 90의 기간.
    3. 파라핀 필름의 조각에 솔루션을 패시의 피펫 한 방울.
    4. 패턴이있는 쪽이 필름을 향해 아래로 향하게되는 기능을 확인하고, 필름과 슬라이드 솔루션을 샌드위치; 버블의 형성을 피한다.
    5. 영화에서 슬라이드를 제거하기 전에 45 분 동안 기다립니다.
    6. 포토 레지스트 제거, 포토 레지스트 제거 및 DI 물 (1 : 1)로 연속해서 슬라이드 담근 및 DI 물, 각각의 침지 90 초 동안 초음파 욕을 교반.
    7. 데시 케이 터를 밀봉하여 냉장고에 보관하기 전에 수분을 제거하고, 핫 플레이트상에서 슬라이드를 건조.
  4. 칩 어셈블리
    1. 반복 1.1.1-1.1.4 단계 있지만 SU8-2025 네거티브 포토 레지스트 및 파라미터 설정에 포토 마스크와 실리콘 몰드를 제조 상기 MICROCHEM 프로토콜 (18)라고 함.
    2. PDMS 마이크로 채널 (40mm X 25mm X 5mm, L x 폭 x 높이)와 소프트 리소그래피를 사용하여 작은 PDMS의 슬래브 (800 μm의 넓은 홈 구조)를 제작.
    3. microchanne 펀치유체 액세스 포트 리터와 깨끗하게 테이프로 다음 IPA와.
    4. PDMS의 슬래브와 유리 기판의 패턴 화 영역을 보호하고, RIE를 적용 (100 W, 500 mTorr 이하, 60 초)이 주변 영역에서 PLL-g-PEG를 제거한다.
    5. RIE (25 W, 500 mTorr로 (25)들)의 감소 된 복용량 마이크로 치료하고 (제거 작은 PDMS 슬래브로) 패터닝 된 유리 기판에 정렬; 마이크로 및 입체경 아래 등각 접촉 패터닝 된 유리 기판을 가지고.

figure-protocol-2
그림 3 : 마이크로 칩 어셈블리의 개략도. 유리 기판 상에 금 도트) 패턴. MAPL을 통해 세포 패터닝 용 유리 기판의 b)의 제조. 다) 플라즈마 본딩과 미세 유체 채널의 조립. 오 정의에 대한 자료 목록을 참조하십시오약어 F. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 세포 부착
    주 : HeLa 세포는 통상적으로 세포 배양 인큐베이터에서 10 % FBS, 1 % 항생제 / 항 유사 분열 용액이 보충 된 DMEM에서 유지된다. 칩 어셈블리 및 세포 부착에 대한 개략도,도 3c에 도시된다.
    1. 프라임 1 μL / 분에서 30 분 동안 PBS로 칩을 다음 주입 피브로넥틴 용액 (PBS 중 50 μg의 / ㎖, 1 μL / 분)을 45 분 동안.
    2. 0.25 % 트립신 EDTA와를 Trypsinize 세포 배양을 기다리는 동안 배양액을 원심 분리 각 셀을 세척하고, 5 × 106 세포 / ㎖로 예열 된 (37 ℃) 배양 배지에서 세포 현탁액을 재구성한다.
    3. PBS로 피브로넥틴 솔루션을 교체하고 5 분 동안 10 μL / min으로 칩을 세척하십시오.
    4. 주사칩으로 제조 된 세포 현탁액은 흐름을 정지 출구를 고정하고, 30 분 동안 세포 배양 용 인큐베이터에 칩을 유지한다.
    5. 출구 릴리스 5 분 동안 10 μL / 분에서 세포 배양 배지로 세척 칩. 0.75 μL / 분 배양액 관류 유량을 줄이고 배양기에서 2 시간 동안 세포 배양을 유지한다.

2. 거품 생성과 흐름 시각화

참고 실험 장치의 개략적 인 탠덤 버블 발생 및 미세 유체 채널에 가까운 자라는 단일 세포로 생성 된 유동 상호 작용도 4a에 도시된다.

  1. 직렬의 발생이 레이저와 타이밍 제어 거품
    1. 거꾸로 현미경의 무대에서 마이크로 유체 칩을 놓고 두 개의 펄스 노스 다코타의 초점 정렬 : 패턴 골드 점 분리 (b)의 한 쌍의 YAG 레이저 (λ = 532 nm의, 5-ns의 펄스 지속 시간)y를 40 μm의.
    2. 금 점에서 개시 개의 기포를 생성하도록 약 2.5 μS 시간 지연 두 레이저를 트리거 디지털 딜레이 생성기를 사용한다.
    3. 50 ± 2 ㎛의 내 기포의 최대 직경을 생성하는 레이저 출력 에너지 (~ 10 μJ)를 조정한다.
    4. 레이저로 고속 카메라 (200 NS 노출 초당 200 만 프레임 (fps))를 동기화하고 버블 팽창 붕괴 버블 버블 상호 작용 제트 형성의 동역학을 캡처.
  2. 제트 속도의 정량화
    1. 제 버블 (B 1)과 B (1)의 선단부의 기단부에 상기 분사 팁 (J 1)의 위치를 기록한 제 버블 (B 2)의 발생에서 시작 J의 터치로 끝나는 B (1)의 선단부를 향해 1; 도 5a에서 회로도를 참조하십시오.
    2. 선형 로봇에 대한 위치의 시간 경과에 맞게시간 근위 (제트 팁) 및 말단부. 근위 단부는 분사 속도를 결정하기 위해 대 시간 곡선 선단 위치의 경사를 계산한다. 두 줄의 교차점은 제트 터치 다운 시간을 나타냅니다. 더 자세한 내용은 참조 (19)에서 찾을 수 있습니다.
  3. 탠덤 거품에 의한 유동장의 시각화
    1. DI 물에 1 μm의 폴리스티렌 (PS) 비드 서스펜션과 미세 유체 칩에 구슬을 주입 (/ V w 2.6 %)을 준비합니다.
    2. 단계 2.1.1-2.1.3에 기술 된 바와 같이 직렬 거품을 생성합니다.
    3. 100 NS 노출 시간 5 M fps의 프레임 율로 고속 비디오 카메라를 사용하여 탠덤 버블 역학을 기록한다.
    4. 상업 PIV 소프트웨어에 획득 한 이미지 시퀀스를 업로드합니다.
    5. 75 % 오버랩 16 × 16 화소 (픽셀)의 작은 심문 창에 각각의 이미지를 나눈다.
    6. 속도 장 계산의 오류를 줄이기 위해 멀티 패스 반복 및 지역 필터를 적용하고,출력 속도 벡터 맵의 결과.

figure-protocol-3
그림 4 : 실험 장치 및 영상 기록의 도식. 탠덤 거품 생성을위한) 실험 설정. b) 시계열 이미징 수집의 종류에 사용. FL : 형광 현미경, BF : 시야, IFT : 간 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 단일 세포 분석 및 Bioeffects

주 : 탠덤 버블 표적 세포 옆에 생성되고, 생성 된 bioeffects는 유격 거리 의존적으로 다룬다. 화상 취득의 다른 유형의 시간 시퀀스는도 4b에 도시되어있다.

  1. 멤브레인의 poration 및 고분자 흡수
    주 : 표적 세포에 세포 거대 분자의 흡수는 세포막에의 poration 사이트를 통해 막 impermeant 요오드화 프로피 듐의 점진적 확산 (PI)을 특징으로한다.
    1. 단계 150에 이어, 실험 내내 0.5 μL / 분의 관류 유량 실행 PI 용액 (DMEM 100 μg의 / mL)로 일반 배지 (즉, DMEM)를 교체한다.
    2. 자동 200 밀리 초의 노출 시간으로 형광 이미지를 캡처하기 위해 PI 형광 여기와 CCD 카메라 시점을 회전 터릿의 PI 형광 큐브를 선택하고 동기화 현미경 제어 소프트웨어 프로그램.
    3. 2 개의 레이저 초점 옆 탠덤 거품 처리 전의 표적 세포 기록 밝은 필드 (BF) 모두 형광 (FL) 이미지 금 도트의 한 쌍의 정렬 된 후.
    4. 즉시에 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여잠시 후 PI 흡수의 역사를 캡처하는 2.1 단계 대상 셀의 시간 경과 형광 영상 녹화를 시작합니다.
  2. 멤브레인 변형
    1. 1 μm의 구슬 (V / w 1 %, 수용성 카르 보디이 미드 활성화)를 준비하고 펩타이드-2000 (PBS 100 μg의 / mL)로 그들을 기능화.
    2. 단계 150 후, 30 분 동안 37 ° C에서 1 × 9 비드 / ㎖의 밀도로 작용 구슬 부착 된 세포를 배양한다.
    3. 반복 단계 2.1 표적 세포 옆 탠덤 기포 생성 및 초고속 카메라 5,000,000 fps의 프레임 레이트로 실행하는 세포 변형을 기록한다.
    4. 실험을하는 동안 이미징 비행기에 남아 3 구슬의 화음을 확인하고 자신의 위치 (× 1, Y 1) (× 2, Y 2)를 컴파일하고 (× 3, y를 3) 실험의 좌표.
    5. 전에 AF 트라이어드의 면적을 계산수식을 사용하여 직렬 거품 치료를 다 운 :
      figure-protocol-4
    6. 지역의 피로를 같이 계산한다 :
      figure-protocol-5
    7. 이전과 탠덤 거품 처리 후의 3 개의 꼭지점의 좌표에 기초하여, 설정된 프로토콜 20,21 다음 로컬 주 변형률과 변형률 공간을 계산한다.
  3. 생존과 사멸
    참고 : FITC 넥신 V가 포스파티딜 세린 (녹색 형광)의 외부화를 통해, 세포 사멸 포함 해 세포를 레이블. PI는 괴사 세포 (적색 형광)의 핵을 레이블. 밝은 필드 이미징은 세포 형태를 문서화하고, 세포 생존과 사멸의 식별을 지원하는 데 사용됩니다.
    1. 도 2b를 참조 채널에 주소 라벨에 의해 용이하게 미세 유체 채널 (각 처리 된 셀의 위치를 기록 ) 3.1 단계를 반복하면서.
    2. 15 분 동안 FITC 넥신 V 용액 칩을 관류하기 전에 또 다른 2 시간 동안 세포 배양액에서 처리 된 세포를 인큐베이션. 양성 세포는 녹색 형광을 표시합니다.
    3. 24 시간 탠덤 거품 처리 후 단계를 반복 3.3.2 표적 세포에서 장기 bioeffects을 연구한다.
  4. 칼슘 응답
    1. 승 3 μL 10 %와의 Fura-2 오전 원액의 3 μL (DMSO 1 ㎎ / ㎖)를 혼합 / 플루로 닉 F-127 최종 라벨링 솔루션 (6 μM)를 준비 감소 혈청 배지 500 μL에 V.
    2. 단계 150 후, 라벨링 용액으로 세포 배지를 교체하고 40 분 (1 μL / 분으로 관류 속도)에 어두운 곳에서 실온 하에서 배양한다.
    3. 세포 실험을 시작하기 전에 감소 된 혈청 배지 (0.75 μL / 분으로 관류 속도)와 채널 리필.
    4. 비율 적 영상을 시작 (파장 : 380분의 340 나노 미터, 50-MS 노출)표적 세포의 상업적 PTI 시스템을 사용.
    5. 휴식 수준에서 세포의 비율 계량 이미징, 단계 2.1에서와 같이 직렬 거품을 생산의 10 초 후, 1 분 동안 0.1 초의 간 시간 (IFT)와 첫 번째 레코드는 다음 다른 분 1 초에 IFT을 증가시키고, 2 분 후 5 초에 추가로 증가.
    6. 세포 내 칼슘 농도에 비례하는 관심 영역 (ROI)의 비 R = F340 / F380을 계산 PTI 소프트웨어를 사용한다.

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결과

이 연구에 기술 된 미세 기포 플랫폼 기포 상호 작용을 조사하기 위해 상기 단일 세포 수준에서 캐비테이션 유도 bioeffects의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 우리의 실험 시스템에서 수행 될 수 실험 연구 및 생물 검정의 다양한 입증하는 몇 가지 예를 제시한다. 먼저 제트의 형성, 생성 된 유동장의 시각화 및 분사 속도 (도 5a)의 계산 탠덤 기포의 일시적인 상호 작용을 설명 할 것이다. 우리는 직렬의 다음 본 실시 예 지역화 세포막 변형 기포 인한 것이다 (도 5B), PI 흡수 (도 5c), 및 세포 내 칼슘 응답 (도 5D)와 정확히 멤브레인의 poration. 이러한 세포 생존 및 아폽토시스 분석과 같은 다른 실시 예는, 참조 번호 (22)에서 찾을 수있다.

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토론

단일 세포 분석은 살아있는 세포 영상과 함께 크게 같은 표현형 개발 및 면역 반응 (23)과 같은 개별 셀에서 동적 종종 가변 과정에 대한 이해를 강화하고있다. 접시 또는 플라스크 종래 세포 배양액과 대조적으로, 미세 유체 시스템은 실시간으로 다운 단일 세포 수준으로 미세의 정확한 제어를 활성화. 따라서, 미세 유체 기술의 진보 및 기술은 대부분 단일 셀 분석 처리량 및 재현성을 향상하고있다. 소프트 리소그래피 및 표면 패터닝을 통합함으로써 마이크로 유체 시스템은 상기 시공간 변수 자극의 복잡한 패턴으로 하나의 셀의 응답에 대한 심층 분석을 용이하게하기 위해 설계 될 수있다. 예를 들어, 과도 화학적 또는 기계적 큐 성공적 생물학적 또는 기계적 응답을 자동으로 기록하는 동안 단 전지로 전달하고이 분석 된4. 이 일반적인 경향에도 불구하고, 세포 수준에서 캐비테이션 유도 bioeffects을 분석하는 마이크로 유체의 적용은 매우 제한되었다. 특히, 그것은 단지 micropillars

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

듀크 대학교의 클린룸 시설 SMIF를 사용하신 것에 대해 감사드립니다. 또한 제트 속도를 측정하는 데 도움을 주신 Hao Qiang에게도 감사드립니다. 저자들은 이 연구에 사용된 Shimadzu HPV-X 카메라를 제공한 Hadland Imaging의 Todd Rumbaugh에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NIH가 보조금 5R03EB017886-02 및 4R37DK052985-20을 통해 부분적으로 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagent/Materials
75 mm x 38 mm 일반 현미경 슬라이드Corning2947-75X38
AcetoneSigma Aldrich, Co.320110ACS 시약, ≥ 99.5%
이소프로필 알코올Sigma Aldrich, Co.W292907≥ 99.7%, FCC, FG
황산Sigma Aldrich, Co.320501ACS 시약, 95.0-98.0
%과산화수소Sigma Aldrich, Co.216763 H2O
프라이머 P-20MicrochemMCC Primer 80/20
NFR 포토레지스트JSRNFR016D2
포토마스크 PhotoplotstoreN/A4x4 직접 쓰기 마스크
MF-319 개발자Shipley (Rohm and Haas)Microposit MF-319
1165 포토레지스트 제거제Dow Chemical, Co. DEM-100180731-메틸-2-피롤리디논 기반
S1813 포토레지Shipley (Rohm and Haas)S1813
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)
HEPESThermoFisher Scientific15630080
파라핀 필름HACH251764
SU-2025 포토레지스트MicrochemSU-2025
PDMS다우 코닝184 SIL ELAST 키트 0.5KG
마이크로보어 튜빙Saint-Gobain PPL Corp.S-54-HL
금속 핀뉴잉글랜드 소형 튜브NE-1300-01컷 튜브(직선), 0.025" 외경 x 0.017 " 아이디 x 0.50 " Long
HeLa cellsDuke Cell Culture Facility(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) bufferThermoFisher Scientific14190144
DMEM 배양 배지ThermoFisher Scientific11995065
Fibronectin Bovine Protein, PlasmaThermoFisher Scientific33010018
0.25% Trypsin-EDTA (1x)ThermoFisher Scientific25200056
Propidium IodideThermoFisher ScientificP21493
카르복실레이트 마이크로스피어 1.00  &뮤; mPolysciences, Inc08226-15
카르복실레이트 마이크로스피어 2.00  &뮤; mPolysciences, Inc18327-10
EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염)ThermoFisher Scientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-hydroxysulfosoxynimide)24510
Peptite-2000Advanced BioMatrix5020-5MG
FITC Annexin VThermoFisher ScientificA13199
Fura-2, AMThermoFisher ScientificF1221
DMSO시그마 Aldrich, Co.D2650
F-127invitrogenP68660.2 &마이크로; m 여과 (물에 10 % 용액)
감소 된 혈청 매체 ThermoFisher Scientific11058021
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
Plasma asherEmitechK-1050XO2 / Ar 플라즈마 애싱 포토레지스트 및 기타 유기 물질
마스크 얼라이너SUSS MicroTec Karl Suss MA6/BA6
E-beam 증발기CHA IndustriesCHA Industries Solution E-Beam
RIETrion Technology Trion Technology 팬텀 II(산화물/질화물/폴리머) 에칭
입체경AmScopeAmerican Scope SM-4TZ-FRL실체 현미경
주사기 펌프Chemyx IncNanoJet
세포 배양 인큐베이터NuAireAutoFlow NU-8500 워터 재킷 CO2 인큐베이터
생물 안전 캐비닛NuAireNU-425-400
수조VWR1122s
원심분리기IECCentra CL2
현미경ZeissAxio Observer Z1
Nd:YAG 레이저  (레이저 1)뉴 웨이브 연구템페스트
Nd:YAG 레이저  (레이저 2)뉴 웨이브 연구오리온
지연 발전기버클리 핵전자공학 BNC 565-8c
플래시 램프Dyna-LiteML1000 섬유 결합 플래시튜브
고속 카메라DRS Hadland  Imacon 200
고속  카메라ShimadzuHPV-X
고속 카메라Vision ResearchPhantom V7.3
PIV 소프트웨어LaVisionDaVis 7.2
카메라ZeissAxioCam MRc 5
소프트웨어ZeissAxioVision
PTI 시스템HoribaS/N: 1705 RAM-X
EasyRatio 소프트웨어HoribaEasy Ratio Pro 2버전 2.3.125.86
63× objectiveZeissLD Plan Neofluar
스트

참고문헌

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