중간엽 줄기세포/기질세포(MSC)의 치료 가능성은 잘 문서화되어 있지만, 환자를 위해 세포를 준비하는 가장 좋은 방법은 여전히 논란의 여지가 있습니다. 여기에서는 실험 및 임상 적용을 위해 이종이 없는 조건에서 프라이밍된 MSC의 치료용 구형 응집체 또는 '스페로이드'를 효율적으로 생성하고 관리하기 위한 프로토콜을 전달합니다.
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방법 논문
제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관
이 논문에서
요약
초록
중간 엽 줄기 / 간질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생명 공학 및 재생 의학에 큰 약속을 개최합니다. 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 강한 접착을 통해 다수의 성인 조직으로부터 분리 한 후, 추가 가장 일반적으로 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여, 시험 관내에서 확장 될 수있다. FBS는 중간 엽 줄기 세포는 면역 원성가 발생할 수 있기 때문에, MSC 문화에서의 존재는 세포의 모두 임상 및 실험 응용 프로그램을 제한합니다. MSC 문화에 대한 따라서 연구는 화학적으로 채용하는 이종없는 (XF) 미디어는 매우 가치가있다. 중간 엽 줄기 세포의 많은 이로운 효과는 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 주로 면역 인자의 분비를 통해 염증 및 면역 조절 능력에 기인하고있다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포는 이러한 요소를 생성하도록 활성화를 요구하고 중간 엽 줄기 세포의 효과는 종종 일시적이므로, 큰 관심은 세포 프리 오 미리 활성화시키는 방법을 발견하는 등장자신의 사용에 대한 연구, 따라서 생체 내에서 활성화에 대한 지연 시간을 제거. 여기에서 우리는 3 차원 (3D) 문화에서 효율적으로 작동하는 프로토콜이나 주요 중간 엽 줄기 세포를 제시 화학적으로 XF 조건 및 생체 내에서 이러한 사전 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 관리하는. 특히, 우리는 먼저 XF 매체를 이용하여 구형 MSC 마이크로 조직이나 매달려 방울의 '타원체'를 생성하고 분야와 에어컨 매체 (CM)는 다양한 애플리케이션에 수확 할 수있는 방법을 보여주기 위해 방법을 설명합니다. 둘째, 유전자 발현 화면 설명 및 시험 관내 기능 분석을 신속하게 세포의 항 염증 및 항암 가능성을 강조 타원체 MSC의 활성화 수준을 평가. 셋째, 생체 내 효능을 시험하기위한 마우스 복강 내로 그대로 MSC의 구 상체를 분사하기위한 신규 한 방법을 설명한다. 전반적으로, 프로토콜은 여기에 화학적으로 XF 콘에서 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 얻는 주요 문제를 극복ditions 및 치료에 대한 MSC의 타원체를 관리 할 수있는 유연한 시스템을 제공합니다.
서론
중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 다양한 재생 의학 접근 방식에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 중간 엽 줄기 세포는 초기 골수 간질 성분으로서 단리되었지만 사람의 지방 조직의 1, 2, 3을 포함하여 다수의 다른 성인 조직으로부터 수득 하였다. 흥미롭게도, 메인 분리 방법은 중간 엽 줄기 세포의 현저한 재산권 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 조직 배양 플라스틱에 단단히 부착 품은. 전통적인 분리 기술은 2 차원 배양의 MSC 쉽고 신속한 팽창을 허용하는 동안, 그것은 오도 매우 인위적인 중요한 세포 특성이 (4)의 전위 손실로 이어지는 기본 3 차원 환경의 중요성을 무시 6. 따라서, 3D 문화에서 중간 엽 줄기 세포의 연구하는전통적인 2D 문화보다 더 생리있다 "손실 / 감소"MSC 특성에 대한 검색에 등장했다. 또한, 관심 임상 응용 프로그램에 대한 세포가 더 순종하게하여 MSC 문화 활성화를 위해 이종없는 (XF) 화학적으로 정의....
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프로토콜
1. MSC의 분리 및 확장
- 초기 통로 준비를 위해 센터에서 중간 엽 줄기 세포와 성체 줄기 세포 (배포 구하는 http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 냉동 튜브를. 또한, 일상적인 프로토콜 14을 다음과 골수 흡인에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하고 냉동 튜브를 저장합니다.
- 최소 필수 배지 (αMEM가) FBS, 2 mM L- 글루타민을 선택 15~20% 프리미엄 보충 알파 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신이다 완전한 배양 배지 (CCM)를 준비합니다. 여과에 의해 배지를 멸균.
- 150mm 세포 배양 접시에 CCM 30 ㎖에 넣고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 요리를 배양한다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 2 분 동안 약 10 6 엽 줄기 세포를 포함하는 냉동 병을 품어.
- 5 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 배양 접시에 바이....
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결과
현재 작업에 매달려 드롭 문화는 소형 구형 마이크로 조직 또는 XF 조건에서 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 '타원체'을 생성하기 위해 사용되었다. 그림 1의 임상 로드맵은 중간 엽 줄기 세포는 자기 조립에 권장되는 타원체, 또는 CM은 구 유래의 치료 요인로드 한 후 72 시간에 대한 방울 매달려에 현탁 때 타원체로 수집 될 수 있으며, 잠재적으로 모두 사용되는 것으로 묘사 연구 및 임상 응용 프로그램. 구 생산에 필요한 세포의 다수 cm 2 당 일반적으로 저밀도 100-200 세포를 중간 엽 줄기 세포를 시딩하고 약 80 % 합류 (도 2까지 6-7일 위해 세포를 확대하여 일주일 이내에 취득 할 수있다 ). 세포 성장 동역학은 매일 생존 세포를 계수함으로써 결정 강력한 확장 단계 (3-7 일) 1~2일 간략한 유도기 (도 2c를 <다음 .......
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토론
일부 연구 및 임상 응용에 사용하기위한 최적의 MSC는 그들의 높은 이득을 최대화하기 위해 작동하고, 우선적으로 이러한 FBS 배지와 같은 이종 성분의 잠재적 인 항원의 전달을 최소화하기 위하여 화학적 XF 조건 하에서 제조한다. 여기에 설명 된 프로토콜에서, 우리는 1) 방법을 도시 한 타원체를 형성하여 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포를 활성화 2) XF 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 3D 활성화를 달성 3) 그들의 항에 관해서 타원체 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가 염증, 면역 조절 성 및 항암 전위, 4) 마우스에 그대로 타원체로 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 제공한다.
중간 엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직 등 다양한 성인 조직으로부터 플라스틱 접착을 통해 분리 할 수있다 다 능성 줄기 세포이다. 중간 엽 줄기 세포는 쉽게 표면 마커의 고유 한 집합을 표현 (~ 20 %) FBS 농도가 상대적으로 높은에서 조직 배양 플라스틱에 전파하고있다지방 세포, 골 세포, .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 보조금 P40RR17447와 텍사스 암 예방 및 연구소(Cancer Prevention and Research Institute of Texas)의 RP150637 지원으로 일부 자금을 지원받았습니다. 이 프로젝트에 대한 지원에 대해 Darwin J. Prockop 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MEM-&알파; (최소 필수 미디엄 알파) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | MSC 성장 배지(CCM) |
| FBS(소 태아 혈청) 준비를 위한 최소 필수 배지, 프리미엄 셀렉트 | 애틀랜타 생물학 | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | 모든 유형의 세포에 대한 완전한 배양 배지의 구성 요소 |
| L-글루타민 | ThermoFisher / Gibco | 25030081; 25030149; | 모든 유형의 세포에 대한 완전한 배양 배지의 25030164 구성 |
| 요소 페니실린 / 스트렙토 마이신 | ThermoFisher / Gibco | 15070063 | 모든 유형의 세포에 대한 완전한 배양 배지의 구성 |
| 살균 필터 장치, 0.22 &마이크로; m PES 멤브레인 | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | 미디어 살균 |
| 150 mm 세포 배양 접시 | Nunc | D8554 SIGMA | 세포 배양 |
| Thermo Forma 방수 CO2 가습 인큐베이터 | Thermo Fisher | Model 3110 | 배양 세포 조기 |
| 배양 조기 통로 MCSs | Center for the preparation and Distribution of adult stem cells at The Texas A& M 건강 과학 센터 의과 대학 Scott & Scott의 재생 의학 연구소 | 의 2D 및 3D 배양의 | |
| 37 °C; C | |||
| 피펫 | Eppendorf | 492000904 | 수동 액체 처리 |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | 취급 혈청학적 피펫 |
| Costar 멸균 혈청학적 피펫(5, 10, 25 및 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | 액체 처리 |
| PBS(인산염 완충 식염수), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | 세포 배양 처리 |
| 0.25% 트립신/EDTA 용액 | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | 리프팅 부착 세포 및 분산 세포 응집 |
| 15ml 원뿔형 튜브 | Corning/BD Falcon | 352097 | 원심분리 |
| 50ml 코 | 닝/BD Falcon | 352098 | 원심분리 |
| Eppendor 냉장 원심분리기 | Eppendorf/Fisher Scientific | 모델 5810R | 세포 원심분리 |
| 혈구계 | Fisher Scientific | 26716 | 세포 계수 |
| 트리판 블루 | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | 혈구계에서 세포 계수 중 사세포 배제 |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | 인간 중간엽 줄기세포의 성장과 확장을 위해 특별히 공식화된 Xeno-free 미디어 |
| 정의 xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | 정의, 인간 중간엽 줄기세포용 xeno-free 배지 |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Xeno-free MSC 매체 |
| rHSA (재조합 Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 | SIGMA 이종-무료 MSC 매체의 구성 |
| 요소 총 RNA 분리 미니 키트 | Qiagen | 74104 | 총 RNA 추출 |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | 총 RNA 추출 전 샘플 균질화 |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | 총 RNA 추출 중 온컬럼 DNA 제거 |
| β-메르캅토에탄올 | 시그마-알드리치 | M6250 RLT | 완충액에서 RNAs의 |
| Vortex | VWR | 97043-562 | 혼합 샘플 |
| 분광 광도계 | Biorad | NA | RNA 농도 및 품질 |
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| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | 세포 원심분리, 시료 채취 및 보관 |
| (-80 ° C) 냉동고 | Thermo Fisher | 모델 Thermo Forma 8695 | 시료 보관 |
| PGE2(프로스타글란딘 E2) ELISA 키트 | R& D Systems | KGE004B | 샘플 |
| DMEM(Dulbecco' ThermoFisher | /Gibco | 10566-016; 10566-024; 10566-032 | 대식세포 배양 배지 |
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| 12웰 플레이트 | Corning | 3513 | in vitro 대식세포 자극 |
| LPS(지질다당류) | Sigma-aldrich | L4130 | 체외 대식세포 자극 |
| 마우스 TNF-a ELISA 키트 | R& D Systems | MTA00B | 시료 내 사이토카인 농도 추정 |
| 마우스 IL-10(인터루킨 10) ELISA 키트 | R& D Systems | M1000B | 샘플의 사이토카인 농도 추정 |
| RPMI-1640 배지 | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | 비장세포 배양 배지 |
| BALB/c 마우스 | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo 스페로이드 전달; 비장세포 제제 |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | in vitro 비장 세포 자극 |
| 70 μ M 스트레이너 | Corning | 352350 | 플레녹사이트 준비 |
| 적혈구 용해 용액 (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | 플레녹사이트 분리 중 적혈구 제거 |
| 마우스 IFN-γ (인터페론 감마) ELISA 키트 | R& D Systems | MIF 00 | 내 사이토카인 농도 추정 |
| ATCC | CRL-1740 | 연구 암 세포주에 대한 3D MSC의 효과 in vitro | |
| DNA 기반 세포 증식 분석 키트 | DNA 함량을 기반으로 | ThermoFisher | C7026 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | 용해 시약 |
| EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) | ThermoFisher | FERR1021 | 칼슘 킬레이터, 용해 시약의 구성 요소 |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | DNA 측정을 위한 RNA 분해 |
| 필터 기반 다중 모드 마이크로플레이트 리더 | BMG 기술 | NA | 마이크로플레이트 분석(ELISA, 세포 정량화, 등) |
| HBSS(행크스 평형 염 용액), 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 | 없음 ThermoFisher/Gibco | 14175079 | in vivo 주사 전 MSC 스페로이드의 재흡수 |
| Isoflurane | MWI Vet < | em>in vivo 주사를 위한 마취 | 502017 |
| , 압축 가스 | Praxair | NA | 이소플루란과 함께 사용 |
| Thermo Forma BSL-2 캐비닛 | Thermo Fisher | 모델 1385 | 멸균 세포 배양 |
| 안전 I.V. 카테터/바늘 스틸레토, 20 g , 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | 복막강으로 슈페로이드 전달 |
| Sterile micropipette 팁 | Eppendorf | 액체/세포 | 다양하게 |
참고문헌
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).
- Le Bl....
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재인쇄 및 허가
