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방법 논문

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜

28.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55128

⸱

2016년 12월 1일

 ,  ,  , 
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, Programs in Human and Molecular Genetics and Neuroscience, The Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Department of Natural Sciences, University of Houston - Downtown, 3Department of Neurobiology and Anatomy, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

이 논문에서

요약

성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.

초록

인간의 뇌 퇴행성 질환 모델 성인 뇌에서 신경 회로들을 매핑하고, 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초 공부 초파리 사용에 관심이 증대되고있다. 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 전체 마운트 준비는 전체 뇌 기반 연구를위한 중요하지만, 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이후의 처리 단계를 용이하게하기 위해 본체의 나머지에 부착 된 그대로의 뇌를 유지하면서,이 프로토콜은, 이하 10 초에서 성인 플라이 머리 쉬운-내용 원스텝 절개 방법을 설명한다. 이 절차는 일반적으로 나중에 묘화 공정을 방해 할 수있는 뇌와 관련된 눈 기관 조직의 대부분을 제거하는 것을 돕고, 또한 해부 포셉의 품질에 덜 요구 놓는다. 또한, 우리는 (B)의 양쪽을 이미징 중요 커버 슬립에 장착 뇌 샘플의 편리 반전을 가능하게하는 간단한 방법을 설명비슷한 신호 강도 및 품질 비. 프로토콜의 예로서, 우리는 WT 성인 뇌에서 도파민 (DA) 신경 세포의 분석을 제시한다 (1,118와트) 날아간다. 절개 방법의 높은 효능은 초파리에서 대규모 성인 뇌 기반 연구에 특히 유용합니다.

서론

일반적으로 과일 파리로 알려진 모델 생물 초파리는 긴 우아한 유전 도구, 짧은 생식 번 평가하고, 높은 분자 및 세포 경로를 보존하고있다. 초파리 성공적 기본 신호 경로 다세포 유기체의 패터닝 메커니즘뿐만 아니라, 신경 발달 기능의 기초가되는 메커니즘 질병 1,2- 해부하는데 이용되어왔다. 셀 라벨 및 이미징 기술의 최근 발전과 함께, 초파리의 뇌는 신경 회로의 미세 매핑 및 학습과 기억, 그리고 활동 일주기 1,3와 같은 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초를 해부 특히 강력한되고있다 4,5,6,7,8.

초파리 시스템의 하나의 특별한 장점은 일정한 화합물 또는 공 초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 전체 뇌 실장 준비 및 시험 수는 상대적으로 작은 크기이다. 티S 기능 따라서 전체 내에서 연구 된 환자의 전체적인 관점 그 정확한 형상을 모두 제공하는 전체 뇌 조직의 맥락에서, 세포 및 세포 내 수준의 신경 회로의 상세한 해부학 및 기능 분석 또는 단일 뉴런을 활성화 뇌. 그러나, 뇌의 미니어처 크기보다는 주어진 또한 효율적 성인 플라이에 보호 외골격 헤드 케이스로부터 온전한 ​​뇌 조직 해부의 기술적 과제를 제시한다. 다양한 효과적이고 상대적으로 단순한 박리 방법은 일반적주의 포함하고 단계적 헤드 케이스를 제거하고 눈을 포함한 관련 조직, 기관, 지방을 9,10. 이러한 미세 수술 절개 방법 적절한 뇌로부터의 상세히 설명되었지만 자주 쉽게 손상 될 수있는 미세 잘 정렬 된 팁 집게에 의존 해부 포셉의 품질에 다소 엄격한 요구를 배치합니다. 또한, 같은 해부 뇌는 종종 해부하다신체의 나머지 에드 뇌 쉽게 그들의 작은 크기 및 프로세싱 버퍼 투명성의 연속 염색 및 세척 과정 중에 손실 될 수있다. 여기, 우리는 몸통에 부착 된 해부 두뇌를 유지 성인의 뇌에 대한 비교적 간단하고 배우기 쉬운 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다. 해부 과정은 종종 쉽게 눈과기도로 뇌 관련 조직의 대부분을 멀리 지우고 좋은 품질의 해부 포셉에 대한 수요를 감소시킨다.

형광 화합물 현미경 또는 공 초점 현미경으로 뇌를 영상화 할 때 또한, 멀리 형광 광원으로부터 뇌의 측면은 종종 인해 전체 마운트 뇌의 두께로 약한 신호와 적은 선명한 이미지를 생성합니다. 여기서는 유사한 신호 intensi와 뇌의 양측의 편리한 촬상있게 뇌 샘플 쉽게 반전을 허용하는 간단한 장착 방법을 서술타이 및 품질.

개념 증명 성인의 뇌를 연구하는이 방법의 응용 프로그램에 대한, 우리는 또한 1118 파리 w의 뇌에서 DA 뉴런의 존재를 조사; 종종 유전자 파리 많은 초파리 연구 야생형 제어를 생성하기위한 부모 선으로 사용되는 유전자형.

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프로토콜

뇌 해부 및 면역 형광 염색에 사용 1. 솔루션

  1. 성인 인공 뇌척수액에서 머리를 비행 해부 (ACSF) : 119 mM의 NaCl을, 26.2 밀리미터의 NaHCO3, 2.5 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 NaH 2 PO 4, 1.3 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 포도당. 사용하기 전에, 가스 5 % CO 구십오분의이 10 %의 O 2와 ACSF - 2.5 mM의 CaCl2를 15 분, 스파이크. 0.22 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 용액 ACSF 멸균.
    참고 : 저장 ACSF를 4 ° C에서 세균 오염을 방지 할 수 있습니다. 해부 뇌의 최종 이미지 품질에 두 박리 용액의 효과의 상세한 비교가 수행되지 않은 비록 플라이 뇌 또한, 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 절개 될 수있다.
  2. 일반적으로 분주 및 -20 ° C에 저장되어있는 정착액 솔루션으로 1X PBS에서 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용합니다.
    CautioN : PFA는 독성과 부식성 및 취급시주의해야한다.
  3. 해부 뇌의 면역 염색하는 동안 뇌에서 마지막 세척 단계 후 PFA를 씻어 1X PBS를 사용합니다. 10 배 PBS 원액에서 1X PBS를 준비 (1.37 M의 NaCl, 27 mM의 KCl을, 100 밀리미터 나 2 HPO 4, 18 mM의 KH 2 PO 4).
  4. 해부 뇌의 면역 염색 동안 모든 후속 세척 단계 1X PBS (1X PBT)에서 0.3 % 트윈 20을 사용합니다.

성인 플라이 헤드 2. 미세 수술 해부

주 : 박리 과정이도 1에 도시되어있다.

  1. CO 2와 함께 성인 파리를 마취. 5 초 - 집게를 사용하여 비행을 선택하고 짧게하면 3 70 % 에탄올에 침지하여 표피를 왁스 제거. 이 ACSF 또는 1X PBS의 해부 용액에 침지 할 때 기포가 비행 표피에 부착 없음을 보장합니다.
  2. 아래손에 의해 차단되지 않습니다 각도에서 광원 현미경을 해부, 파리 (1.2X 배율)의 명확한 뷰를 달성하기 위해 대물 렌즈를 설정합니다. 동물을 고정하고도 1a에 도시 된 바와 같이, 그것의 복부가 위쪽으로 향하도록 추위 해부 솔루션으로 파리를 체험하기 위해 쓰지 않는 손으로 집게를 사용합니다.
  3. 160에서 집게를 유지 - 파리의 복부에 작은 힘을 발휘하면서, 해부 접시에 대해 170 ° 각도 (그림 1A에서 화살표로 도시). 이 단계는 플라이 및 고정 (15)에 의해 후방으로 헤드를 이동하도록 강제 - 25 ° 위쪽 코를 확장하는 동안. 이 과정에서, 표피의 소프트 및 반투명 영역은 코 아래에 명백해질 것이다. 배율을 증가시키고이 지역에 초점면을 조정합니다.
    참고 : 너무 단단히 집게를 잡지 마십시오,하지만 충분히 아니라 그냥 회사 안정비행. 너무 많은 힘은 내부 장기 용액에 파열의 원인이됩니다.
  4. 유지 손에서 압력이 해제 될 때 집게가 열려 봄 않도록, 포셉의 조언에 가벼운 저항하는 힘을 생성합니다 그것의 끝이 폐쇄되도록 해부 집게를 눌러 지배적 인 손을 사용합니다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 비행을 들고 집게에 수직으로 집게를 놓습니다.
    1. 피어스 그림 1B에서 빨간색 화살표로 도시 된 바와 같이 코 아래에있는 표피의 부드럽고 반투명 영역을 통해 해부 포셉의 폐쇄 팁. 너무 깊이는 뇌에 접촉하는 집게를 관통하지 않는 것이 중요합니다. 적절한 뇌는 볼 수있게한다. 비 우세 손으로 파리의 안정적인 권력을 유지한다.
  5. 신속하지만 꾸준히, t 자신의 힘에 의해 해부 포셉의 팁을 해제하고 멀리 눈물이 릴리스에서 모멘텀에 의존그는 외골격 플라이 머리 주변. 볼이되어야 적절한 손상되지 않은 뇌 (즉시 그림 1C에서 바닥 forcep의 끝 위의 흰색 조직) (그림 1C에 도시 바깥쪽으로 빨간색 화살표로 도시)를 출시 forcep 팁의 모멘텀을 안내하는 가상 선을 따르십시오. 이 부드럽게 외골격을 제거하고 뇌에서 뇌 관련 눈과 기관의 가장 것입니다. 적절한 타이밍과 힘은 외골격은 연구자의 경험에 의존 할 것이다 열 적용했다.
    참고 :이 해부하는 동안 가장 중요한 단계입니다. 이는 노출 된 뇌 떠나는 것은 신체의 나머지에 부착 된 상태로 남아 외골격을 제거 개구 포셉 운동량으로부터 발생하는 자연의 힘에 의존하는 것이 중요하다.
  6. 조심스럽게 백색 섬유 구조로 표시되는 기관으로 남은 액세서리 조직을 제거하는 지배적 인 손에 집게를 사용 remainiNG는 뇌에 연결합니다. 당기거나 적절한 뇌 손상되지 않도록주의하십시오.

뇌의 3 면역 형광 염색법

  1. 60 분 - 40 4 % PFA의 약 1 mL에 관련 흉상과 함께 해부 뇌 샘플을 수정합니다.
    참고 :이 이후의 단계는 제대로 용액에 시료를 혼합하는 nutator에 샘플 튜브 또는 플레이트를 유지합니다.
  2. 아래로 3 번 용액을 위로 피펫 팅에 의해 1X PBS 1 mL로 씻어. 떨어져 머리를 대기음하지 않도록주의하십시오.
  3. 5 분마다 1 배 PBT와 5 회 반복한다. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오.
  4. 4 ° C에서 / 적절한 희석 O에서 일차 항체와 N을 품어.
  5. 다음 날, 차 항체를 제거하고 1X PBT와 샘플을 5 회 반복한다. 각 세척 사이에 1 배 PBT 용액에 10 분 - 5 샘플을 남겨주세요. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오.
  6. 세척을 품어제안 된 희석 및 배양 시간에 적절한 보조 항체의 샘플.
  7. 각 세척 사이에 10 분 배양과 1X PBT와 샘플을 여섯 번 씻으십시오.
    이 단계는 샘플에서 비특이적 결합 이차 항체의 제거를 위해 중요하다.
  8. 30 분 동안 1X PBT 용액 1 ㎎ / ㎖ 4 ', 6'- diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 10,000 희석 1 부화. DAPI는 DNA의 AT 영역에 결합하고, 뇌의 전반적인 형태를 나타 내기 위해 사용될 수있는 DNA 염료이다.
  9. 1X PBS로 3 회 씻어.
  10. 전송 해부 접시에 샘플, 그리고 집게를 사용하여 절개 접시에 시체에서 머리를 분리합니다.
  11. 염색 및 세척 단계 후, 둘 사이의 커버 슬립의 두뇌를 탑재하고 장착 슬라이드의 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 뇌의 양쪽이 동일한 신호 강도로 이미징 될 수 있도록 이러한 방법으로, 뇌 샘플 용이 대칭 될 수있다.
    참고 : 대신 직접 장착 슬라이드의 커버 슬립의 뇌를 장착하여 자유롭게 샘플의 방향의 반전을 할 수 있습니다. 실장 공정은 아래에서 더 상세히 설명한다.
    1. 장착 슬라이드의 상단에 18 X 18mm의 coverslip에 배치합니다. 블레이드와 피펫 팁의 개구를 넓히고 18 X 18mm의 커버 슬립 상 1X PBS 용액에 뇌를 전송하도록 사용.
    2. 안티 - 페이드 장착 매체의 40 μL (0.2 % (99.5에서 w / v)의 n- 프로필 갈 레이트 - 다른 (20), 커버 슬립의 중간에 두뇌를 놓습니다 미세 피펫 팁과 뇌 주변의 액체를 제거하고 추가 뇌 % 이상 ACS 등급 글리세롤).
      주 : 배지 첨가 실장 양 검사 뇌의 수에 의존한다.
    3. 바깥쪽으로 점성 장착 매체 변위 동안 부드럽게 머리를 확산. 그것은에 닿을 때까지 제 일측에서 상기 슬라이드를 하강시킴으로써 뇌의 상단에 제 18 X 18mm의 커버 슬립을 배치장착 미끄러짐 표면은 천천히 기포와 뇌의 접촉을 최소화하기 위해 다른 쪽을 낮추는.
      주 : 장착 매체의 볼륨으로 두 커버 슬립 사이에 스페이서를 사용하고 뇌 두 커버 슬립을 분리하기에 충분한 공간을 제공해야 할 필요가 없다.
    4. 슬라이드가 정착하도록 허용합니다. 실험실 조직과 슬립의 측면에서 나오는 과도한 액체를 제거합니다.
    5. 운송시 장착 슬라이드를 탈락 탑재 된 두뇌와 커버 슬립을 방지하기 위해 장착 슬라이드로 된 커버를 부착하는 테이프의 작은 조각을 사용합니다.
      주 : 뇌에 장착 된 슬라이드를 즉시 묘화 또는 슬라이드를 밀봉하는 밀봉 제를 사용할 필요없이, 형광 신호의 현저한 손실없이 1 주 4 ℃에서 보존 될 수 사이. 스테인드 뇌 장기 보존 두 슬립의 측 w를 밀봉 할 수있다i 번째 네일 폴란드어 및 저장 -20 ° C의 냉동고, 스테인드 뇌가 시간이 지남에 따라 자신의 신호를 잃을 수도 있지만. 이 권장되지 않습니다.
  12. 이미지에 머리를 적절한 화합물 형광 현미경 공 초점 현미경을 사용합니다.
    1. 우선, 목적에 가까운 뇌 측으로부터 화상을 취득하고 신중 중간에 끼워진 샘플을 갖도록 플립 커버 슬립. 이 단계는 같은 뇌의 다른 쪽의 화상을 취득 용이하게한다.
    2. (예를 똑바로 화합물 형광 현미경 및 이미지에 20 배 대물 렌즈 전체 뇌 (그림 2의 예) 및 한 쌍의 전방 내측 (PAM) 클러스터 지역에서 DA 뉴런과 뇌의 이미지 작은 지역에 40X 목표를 사용하여 그림 3).

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결과

상술 한 바와 같이 그림 1, 성인 뇌 해부를위한 주요 절차를 보여 2 및도 3은 3 일짜리 WT의 대표 이미지입니다. (유전자형가 : 1,118 원) 성인 티로신 하이드 록에 대한 항체와 costained 된 머리를 비행 (TH를 그림 2에서 빨간색으로 색깔과 그림 3) 흰색, 마커는 일반적으로 모든 분화 된 신경 세포의 모든 세포 핵 및 Elav 단백질에 대한 항체, 마커에 라벨을 붙이기 위해 DNA 염색 DAPI 이외에, DA 뉴런 (11) 레이블을 사용 파리에서 함께 뇌의 전체 구조를 공개하는 (녹색 색).

1 200 희석 및 랫트 항 - Elav ...

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토론

인간의 뇌 질환, 신경 회로, 및 높은 뇌 기능을 연구하기 위해 성인 초파리 뇌 사용에 대한 관심이 증가, 대형 - 특히 중요 전체 마운트 분석을위한 완전한 비행 뇌를 얻었다 간단하고 빠른 방법을 개발하는 것이 필요하다 뇌 기반의 화면을 확장 할 수 있습니다. 우리의 방법은 간단하고 배우기 쉬운 플라이 머리를 해부하는 방법을 (자주 경험 미만 10 초에) 잘 보존 된 형태와 크게 관련 조직의 해제가 제공합니다. 해부 뇌 여전히 플라이 본체의 나머지에 부착 될 때, 그들은 일반적으로 신속하게 샘플 튜브의 바닥에 가라 세탁 염색 단계에서 인식하고 수집하기 쉽다. 이것은 상당히 작은 물리적 크기의 뇌 샘플을 처리에서 눈에 띄는 문제가 될 수있는 샘플 손실을 최소화 할 수 있습니다. 이 문제는 대규모 연구에 특히 중요 할 수있다. 뇌 용이 본체로부터 분리 될 수있다장착 전에 염색 공정의 종료 후.

절개 동안, 올바르게 플라이를 위치 즉시 헤드로부터 외골격을 제거 할 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 프로젝트에 자신의 엄청난 지원 씨 ENES 메 흐멧, 미스 키아라 엔드 레데, 미스 필로드 리 게스, 크리스 곽, 그리고 양 다나 Ghafir을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
w*;   공원Δ 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. S65T}DC10,  하버드 의과대학의 Sb1Bloomington Drosophila Stock Center51652밸런서는 TM6B
PBac{WH}parkf01950Exelixis로 전환되었습니다. 하버드 의과대학의f01950밸런서는 TM6C로 전환되었습니다
NaClFisher ScientificS640-500
중탄산나트륨(NaHCO3) Fisher Scientific02-003-990
염화칼륨(KCl)Fisher ScientificBP366-500
인산나트륨, 일염기성 일수화물(NaHCO3)Fisher Scientific02-004-198
염화마그네슘(MgCl2)Fisher Scientific02-003-265
D-소르비톨시그마-알드리치S1876-500G는 포도당
칼슘 클로라이드 디하이드레이트 (CaCl2). Sigma-AldrichC5670-500G
EMD Millipore  Durapore PVDF 멤브레인 필터: 친수성: 0.22 & 마이크로; m 기공 크기Fisher ScientificGVWP14250
포르말린 용액, 10% (조직학적)Fisher ScientificSF98-20
인산칼륨, 이염기성, 분말, 초순수 생물 시약Fisher Scientific02-003-823
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Excelta 정밀 핀셋 매우 미세한 점 FisherScientific17-456-055프로토콜은 매우 미세한 점을 요구하지 않습니다.
anti-tyrosine hydroxylase 항체Pel-Freez BiologicalsP40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-ELAVThe Developmental Studies Hybridoma BankClone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) secondary 항체, Alexa Fluor 647 conjugateThermoFisher ScientificA-21247
goat anti-Rabbit IgG (H+L) secondary 항체, Alexa Fluor 594 conjugateThermoFisher ScientificA-11037
DAPI 용액 (1 mg/mL)ThermoFisher Scientific62248
프로필 갈레이트 분말Sigma-AldrichP3130-100G
글리세롤 ACS 시약, ≥ 99.5%Sigma-AldrichG7893-500ML
Zeiss AxioImager Z1Zeiss견적
Zeiss Apotome.2Zeiss견적
Zen lite 소프트웨어견적
. 를 대체합니다

참고문헌

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