Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.
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방법 논문
와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹
이 논문에서
요약
초록
정확한 탐지 및 저주파 돌연변이의 식별은 치료 중 내성 돌연변이 신흥 심사, 치료 후 잔여 질병을 평가할 때 문제가 될, 또는 수의 환자가 몇 순환 종양 세포가있을 때. 서열 분석 하였다 PCR 차단 야생형 이러한 저주파 변이를 검출하는 방법으로 고감도, 유연성 및 단순성을 제공한다. 신설하거나 이전에 종래의 PCR 계 서열 분석에 핵산 올리고 뉴클레오티드 로크 설계 정의를 첨가함으로써, 1000 WT 대립 유전자의 배경에서 약 1 돌연변이 대립 유전자의 민감도 (1,000 1)를 실현할 수있다. 탈 아미 노화 이벤트와 연관된 시퀀싱 아티팩트 일반적 부분적 추출 단계 동안 우라실 DNA 글리코의 사용에 의해 해결 될 수 포르말린 고정 파라핀 조직에서 발견. 최적화 된 프로토콜은 여기에서 MyD88 돌연변이를 검출하기위한 특정이지만, 어떤을 설계하는 템플릿 역할을 할 수 있습니다WTB-PCR 분석. PCR 및 실시간 정량 PCR 가양 적게 발생, 유연성 및 구현의 용이성을 포함 특정 대립 유전자를 포함하여 낮은 주파수 변이의 검출에 대한 기타 일반적으로 사용되는 분석을 통해 WTB-PCR 분석의 장점, 둘 다 알려진 감지 할 수있는 능력 알 수없는 돌연변이.
서론
생거 시퀀싱은 전통적으로 알려진 알 수없는 체세포 돌연변이 시험에서 황금 표준되었습니다. 생거 시퀀싱의 한계 중 하나는 검출 한계 인 (~ 10 - WT의 배경에 20 % 돌연변이 대립 유전자 1). 감도 수준은 몇 순환 종양 세포 또는 골수 (BM)이 고르지 때와 암성 조직 또는 환자 샘플에 존재할 수있는 낮은 수준의 체세포 돌연변이를 검출하기위한 부적절한. 이것은 또한 치료 후 잔여 질병을 평가 또는 혼자 두 기존의 염기 서열에 의해 어려운 치료 중에 새로운 저항 변이를 감지한다. 잠긴 핵산 (LNA)와 종래의 PCR 대체함으로써 생거 시퀀싱에 PCR (WTB-PCR)을 차단 야생형를 매개 성, WT의 배경 최대 0.1 % 돌연변이 대립 유전자의 감도는 2, 3, 4를 달성 할 수있다. 에서WT WT DNA의 DNA 증폭 방지하여 우선적으로 결합 - (NT 14 ~ 10) 차단 (LNA) 올리고 WTB-PCR은, 돌연변이 대립 유전자 농축 짧은의 첨가를 통해 달성된다. 돌연변이 풍부한 WTB-PCR 제품은 다음 순서가 될 수있다. WT ....
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프로토콜
윤리 성명서 : 인간의 모든 샘플 테스트는 임상 시험 심사위원회 (IRB)의 승인을 얻은 후 시행 하였다.
1. FFPE 조직에서 DNA 추출, 말초 혈액 및 골수 대기음
- DNA FFPE 추출 키트 골수 FFPE 조직에 대한
- 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 - 10 μm의 두께).
참고 : 조직 부스러기 시작, 3 개를 사용하는 경우 - 5에서 6 섹션 - 10 μm의 두께와 1.1.6 단계로 건너 뜁니다. - 슬라이드 바구니 슬라이드 놓고 네 세척 저장소 (크실렌 두 100 % 알코올 개의)을 준비한다. 각 바스켓 용액을 600 mL의 최소 부피를 추가한다.
- 제 트레이에 5 분 크실렌 세척을 수행하여 슬라이드 Deparaffinize. 추가로 5 분 동안 제 크실렌 세척 저장소에 슬라이드 이동.
- 탈 파라핀 한 후, 5 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 세척한다. 두 번째로 슬라이드를 이동추가로 5 분 동안 세척 알코올 저장조.
- 슬라이드가 microcentrifuge 관에 면도날로 근근이 살아가고하기 전에 후드를 완전히 말리십시오.
참고 : 종양 지역과 H & E 슬라이드가 표시....
- 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 - 10 μm의 두께).
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결과
확장시 WTB-PCR의 개념적 개관도 1에 제시된다. 블로커-DNA 하이브리드의 단일 염기 미스 매치가 크게의 용융 온도 감소하므로 (ΔT의 m = 20 - 30 °의 C)에서, WT 대립 유전자의 증폭을 돌연변이 주형 DNA는 확장자 (17)을 완료 할 수없는 상태에서 차단된다. WT 선형 DNA 증폭 동안 이러한 방식으로, 돌연변이 DNA를 기하 급수적으로 증폭된다.
WTB-PCR에 의해 달성 돌연변이 농축 시연은도 2에 제시된다. 와 돌연변이가없는 환자의 게놈 DNA를 테스트했다 재래식 WTB-PCR 후 WTB-PCR에 의해 달성 전형적인 농축 및 WT DNA에 잘못된 반응의 부족을 보여 염기 서열. WTB MMX-PCR에 사용 된 .......
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토론
여기에 설명 된 WTB-PCR 분석은 신장 (도 1) 동안 WT에 DNA의 증폭을 차단하기위한 차단 올리고 프라이머와 일반 세트를 사용한다. WTB-PCR 생성물은 돌연변이 염기 서열을 분석한다. WTB-PCR / 생어의 유틸리티는 단순, 높은 감도 및 높은 처리량에있다. 여기에 설명 된 지침을 사용하여, 대부분의 기존 생어 기반 분석은 단순히 크게 감도를 증가시키기 차단 올리고 뉴클레오티드의 추가를 통해 수정 될 수 있습니다. 여기에 제시된 실시 예 분석에서 PCR 단일 차단 올리고 뉴클레오티드의 첨가는 WTB-PCR 분석 3> 0.5 %의 통상적 인 분석에 대한 WT의 배경에서 약 16 % 돌연변이 대립 유전자의 검출 한계를 증가. 효과는 임상 시험 3 본 위음성의 64 % 감소된다. 에서 MyD88 돌연변이의 존재를 확인하는 것은 중요한 진단 및 예후 IMPL있다ications; 거짓 전반적인 치료와 .......
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공개 사항
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감사의 글
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 또는 2 mL Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% 알코올 | VWR | 89370-084 | 조직학 등급; 91.5% 에탄올, 5% 이소프로필 알코올, 4.5% 메틸 알코올 |
| 3730XL 시퀀서 | ABI | 또는 동급 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | 마그네틱 비드 PCR 정제용 |
| 알루미늄 밀봉 포일 | GeneMate | T-2451-1 | PCR 및 냉장 보관용 |
| BigDye Terminator v3.1 주기 염기서열분석 키트 | Life Technologies | 4337455 | 양방향 염기서열분석용. 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 시리즈 | Eppendorf | A-2-DWP 로터(PCR 플레이트용) | |
| 96웰 플레이트용 냉각판 | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, 초순수 | |||
| dNTP (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 사이드 스커트 자석 | Thermo Fisher Scientific | 12027 | PCR 정제에 사용됩니다. |
| 에탄올 앱솔루트 | Sigma | E7023 | 200 proof, 분자생물학 |
| Exiqon 웹사이트 Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µ L) | Roche | 12032937001 | With10x 집중 PCR 반응 버퍼, 20 mM MgCl2 |
| Gel 전기영동 장치 | 2% 아가로스 젤 | ||
| GeneRead DNA FFPE 추출 키트 | Qiagen | 180134 | 서열분석 아티팩트를 줄이는 데 필요한 우라실 DNA 글리코실라아제를 함유 |
| Hi-Di 포름아미드 | ABI | 4311320 | 염기서열분석을 위해 사용됩니다. |
| LNA 올리고뉴클레오티드 | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA 염기) |
| M13-F 염기서열분석 프라이머 | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R 염기서열분석 프라이머 | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (1.5/2 mL microcentrifuge tubes용) | |
| NanoDrop 2000 분광광도계 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR 포워드 프라이머 | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR 리버스 프라이머 | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| 피펫터 | 20, 200, 1,000 &마이크로; L | ||
| 플레이트 격막, 96 웰 | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA 미니 키트 | Qiagen | 51304 | BM 흡인 및 말초 혈액용 |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | 염기서열 분석 |
| 슬라이드 바구니 | |||
| 아세트산 나트륨 (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| 멸균 여과 피펫 팁 | 20, 200, 1,000 &마이크로; L | ||
| 써모믹서 C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| 세척 reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | 조직학 등급 |
참고문헌
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M.
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