방법 논문

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

DOI:

10.3791/55130

⸱

2017년 3월 29일

 ,  , 
1NeoGenomics Laboratories

이 논문에서

요약

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Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.

초록

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정확한 탐지 및 저주파 돌연변이의 식별은 치료 중 내성 돌연변이 신흥 심사, 치료 후 잔여 질병을 평가할 때 문제가 될, 또는 수의 환자가 몇 순환 종양 세포가있을 때. 서열 분석 하였다 PCR 차단 야생형 이러한 저주파 변이를 검출하는 방법으로 고감도, 유연성 및 단순성을 제공한다. 신설하거나 이전에 종래의 PCR 계 서열 분석에 핵산 올리고 뉴클레오티드 로크 설계 정의를 첨가함으로써, 1000 WT 대립 유전자의 배경에서 약 1 돌연변이 대립 유전자의 민감도 (1,000 1)를 실현할 수있다. 탈 아미 노화 이벤트와 연관된 시퀀싱 아티팩트 일반적 부분적 추출 단계 동안 우라실 DNA 글리코의 사용에 의해 해결 될 수 포르말린 고정 파라핀 조직에서 발견. 최적화 된 프로토콜은 여기에서 MyD88 돌연변이를 검출하기위한 특정이지만, 어떤을 설계하는 템플릿 역할을 할 수 있습니다WTB-PCR 분석. PCR 및 실시간 정량 PCR 가양 적게 발생, 유연성 및 구현의 용이성을 포함 특정 대립 유전자를 포함하여 낮은 주파수 변이의 검출에 대한 기타 일반적으로 사용되는 분석을 통해 WTB-PCR 분석의 장점, 둘 다 알려진 감지 할 수있는 능력 알 수없는 돌연변이.

서론

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생거 시퀀싱은 전통적으로 알려진 알 수없는 체세포 돌연변이 시험에서 황금 표준되었습니다. 생거 시퀀싱의 한계 중 하나는 검출 한계 인 (~ 10 - WT의 배경에 20 % 돌연변이 대립 유전자 1). 감도 수준은 몇 순환 종양 세포 또는 골수 (BM)이 고르지 때와 암성 조직 또는 환자 샘플에 존재할 수있는 낮은 수준의 체세포 돌연변이를 검출하기위한 부적절한. 이것은 또한 치료 후 잔여 질병을 평가 또는 혼자 두 기존의 염기 서열에 의해 어려운 치료 중에 새로운 저항 변이를 감지한다. 잠긴 핵산 (LNA)와 종래의 PCR 대체함으로써 생거 시퀀싱에 PCR (WTB-PCR)을 차단 야생형를 매개 성, WT의 배경 최대 0.1 % 돌연변이 대립 유전자의 감도는 2, 3, 4를 달성 할 수있다. 에서WT WT DNA의 DNA 증폭 방지하여 우선적으로 결합 - (NT 14 ~ 10) 차단 (LNA) 올리고 WTB-PCR은, 돌연변이 대립 유전자 농축 짧은의 첨가를 통해 달성된다. 돌연변이 풍부한 WTB-PCR 제품은 다음 순서가 될 수있다. WT DNA를 차단하기보다는 특정 돌연변이 선택 WTB-PCR은 분 세포 분획에 존재하는 알려진 알려지지 돌연변이 농축을 허용한다.

여러 방법이 현재 작은 세포 분획에 돌연변이를 검출하기 위해 사용된다. 이는 고성능 액체 크로마토 그래피 (DHPLC), 비드, 에멀젼, 증폭, 및 마그네틱들 (빛나는), 전계 유도 방출 측정 (EFIRM) 변성 대립 유전자 특이 적 PCR 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS), 높은 해상도를 포함 녹는 점 등이있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 가양 만 분석은 4 설계된 하나의 돌연변이를 검출 할 수있는 능력에 의해 제한된다 SUP. WTB-PCR은, 그러나, 여러 돌연변이 유형의 검출을 가능하게하고 유물 또는 탈 아미노 이벤트로 인한 오탐 (false positive)을 배제 도움이 될 수 시퀀싱 흔적을 시각화 할 수있게합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)이 기존의 시퀀싱에 적합한 대안을 제공 할 수 있습니다, 그러나, 실질적으로 더 큰 비용, 복잡성, 긴 분석 시간은 그것을 몇 가지 서로 다른 분자 마커 많은 질병 유형 또는 부상에 대한 치료를 환자 모니터링을위한 불필요한 옵션을 렌더링 저항 돌연변이. 5 % 미만의 변이 대립 유전자 빈도와 또 높은 탐지율이 검출 변이체 6 앰플 리콘 기반 NGS 5 문제를 제기 할 수있다.

여기에서는 Albitar 등에 의해 기술 된 바와 같이 골수 분화 인자 88 유전자의 돌연변이에 대해 스크리닝 WTB-PCR에 의해 달성 감도의 증가를 보여준다. 3에서 MyD88의 mutatioNS는 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 (WM) 알 수없는 의미 (IgM의-MGUS)의, IgM의 단일 클론 감마 병증, 비장 한계 영역 림프종 (SMZL)에서 중요한 진단 및 예후 인자, 그리고 큰 B 세포 림프종 (DLBCL)을 확산. 에서 MyD88 돌연변이는 WM의 거의 모든 경우와 면역 글로불린 M (IgM의) MGUS를 -secreting 환자의 약 50 %에서 발견된다. 이에 대해서,에서 MyD88 돌연변이는 SMZL 환자의 0 내지 6 %에서 발견 다발성 골수종 7, 8 결석된다. 겹치는 형태 학적, immunophenotypic, 염색체 및 WM 및 SMZL 또는 종종 감별 진단을 복잡하게 할 수-IgM의 다발성 골수종 사이의 임상 적 특성 때문에하는 돌연변이에서 MyD88의 존재하에 유용한 식별 9 인자로서 작용할 수있다. 에서 MyD88 돌연변이 또한, 치료 (7) 다음 DLBCL와 가난한 전체 생존 환자에서 더 큰 질병 부담과 관련이있다 10. 또한에서 MyD88 돌연변이가 자주보다 활성화 된 B 세포 형 (ABC) DLBCL에서 발견되기 때문에 B가 셀 형상 (GCB) DLBCL 또는 기본 종격동 B 세포 림프종 (PMBL)에서 MyD88 돌연변이 상태가로서 작용할 수 배 중심 ABC 방송의 아형 (11), (12)에 대한 대리 마커.

여기에 제공된 상세한 프로토콜은 새로운 분석법이 개발 될 수 있거나 대부분의 기존 서열 분석을 용이하게 정확하게 다양한 샘플 종류 저주파 돌연변이를 검출하도록 구성 될 수있는 주형으로 작용한다. 이 접근법은 또한 모니터링하거나 종양 환자가 치료 표적 항생제로 처리되는 동안 생길 수 심지어 박테리아 개발할 수 내성 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수있다. 또한, 주소, 특히 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직에 돌연변이 농축과 관련된 많은 문제 구제.

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프로토콜

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윤리 성명서 : 인간의 모든 샘플 테스트는 임상 시험 심사위원회 (IRB)의 승인을 얻은 후 시행 하였다.

1. FFPE 조직에서 DNA 추출, 말초 혈액 및 골수 대기음

  1. DNA FFPE 추출 키트 골수 FFPE 조직에 대한
    1. 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 - 10 μm의 두께).
      참고 : 조직 부스러기 시작, 3 개를 사용하는 경우 - 5에서 6 섹션 - 10 μm의 두께와 1.1.6 단계로 건너 뜁니다.
    2. 슬라이드 바구니 슬라이드 놓고 네 세척 저장소 (크실렌 두 100 % 알코올 개의)을 준비한다. 각 바스켓 용액을 600 mL의 최소 부피를 추가한다.
    3. 제 트레이에 5 분 크실렌 세척을 수행하여 슬라이드 Deparaffinize. 추가로 5 분 동안 제 크실렌 세척 저장소에 슬라이드 이동.
    4. 탈 파라핀 한 후, 5 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 세척한다. 두 번째로 슬라이드를 이동추가로 5 분 동안 세척 알코올 저장조.
    5. 슬라이드가 microcentrifuge 관에 면도날로 근근이 살아가고하기 전에 후드를 완전히 말리십시오.
      참고 : 종양 지역과 H & E 슬라이드가 표시된 경우 사용할 수 있으며, 슬라이드를 정렬 만 종양 영역을 긁어.
    6. 키트에 포함 된 제조업체의 유인물의 지시로 진행합니다.
  2. BM 대기음 및 말초 혈액의 경우
    1. 이러한 사양은 제조업체의 지침 유인물에 따라 압축을 풉니 다.
      참고 : 많은 상용 키트와 FFPE 조직과 세포에서 DNA 추출 방법이 있습니다. 실질적으로 모두 사용할 수 있습니다. 실험실에서 확립 된 방법을 사용합니다.
      1. 200 μL 말초 혈액 (PB) 100 μL BM + 100 μL PBS를 사용합니다.
      2. 4 μL의 RNase 주식 솔루션을 사용합니다.
      3. 100 μL 용출 완충액으로 용출시켰다.
  3. DNA의 정량화
    1. (순수한 DNA 위해) 약 1.8 260 ㎚ / 280 nm의 비율을 보장하는 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 비가 상당히 낮은 경우, 하류 어플리케이션을 방해 할 수있는 단백질, 페놀, 또는 다른 오염 물질의 존재를 나타낼 수있다.
    2. 적합한 용출 완충액 100 NG / μL - 약 50 DNA의 농도를 조정.

PCR을 차단 2. 야생형

  1. 프라이머 디자인
    1. 이전에 따라 관심의 유전자 설계 및 취득 프라이머는 PCR 프라이머 디자인 (13)의 일반적인 가이드 라인을 설명했다. M13 감기를 포함하고 PCR 프라이머의 보편적 인 시퀀싱 프라이머를 역.
      주 :에서 MyD88 세이에서 MyD88의 엑손 5를 증폭하기 위해 개발되었다 (G259 - N291) 5에 위치하고 있으며 110 개의 뉴클레오티드 '프라이머 인트론 4. 순방향의 접합 부위와 부품을 커버하고 리버스 인트론 영역은 5 설계된' -M13 시퀀스 (M13 포워드 : TGT ACG AAA GCC ACG AGT; M13 역 : CAG GAA ACA GCT ATG ACC)는 (재료 표 참조) 상보 시퀀싱 프라이머 어닐링을 허용한다.
  2. 잠금 핵산 올리고 뉴클레오티드 디자인
    1. 돌연변이 보충이 요구되는 WT 템플릿 길이가 15 염기와 상보 - 약 10로 차단 된 올리고 뉴클레오티드를 설계한다.
      주 : 짧은 올리고는 불일치 차별을 향상시킬 수 있습니다. 높은 목표 특이성을 달성하기 위해,이 매우 "끈끈한"올리고 뉴클레오타이드가 발생할 수 있기 때문에 너무 많이 차단 뉴클레오티드를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 콘텐츠와 길이 및 염기 차단 차단해야하는 특정 염기에 따라 최적화 될하도록해야한다. 이는 이차 구조를 손상 자기 상보성 위험없이 높은 결합 특이성을 달성하기 위해 중요하다.
    2. 확장 temperat 위 15 °의 C - T 자에 10 m를 갖는 차단 올리고 설계열 순환 동안 URE. G 또는 C 염기 차단 - (4- 염기 3) 추가하거나 차단 염기를 제거하거나 긴 스트레치를 회피하면서 블로킹 DNA 염기 치환하여 T의 m을 조정한다.
      1. 올리고 도구 웹 사이트로 이동 (재료의 표 참조)하고 "올리고 Tm은 예측 차단"도구를 선택합니다.
      2. 은 "올리고 시퀀스"박스에 차단하고자하는 WT 템플릿의 서열을 붙이기. 차단 기지를 나타 내기 위해 기지 앞에 "+"추가합니다.
      3. DNA의 차단제 하이브리드 대략 T의 m을 결정하기 위해 "계산"버튼을 선택한다.
    3. 이차 구조의 형성 또는 자체 이량 체를 피하기 위해 차단 올리고을 디자인합니다.
      1. 올리고 도구 웹 사이트로 이동 (재료의 표를 참조) "올리고 최적화를 차단"도구를 선택합니다.
      2. 상자에 차단하고자하는 WT 템플릿의 서열을 붙이기. 기지를 차단 나타 내기 위해 기지 앞에 "+"추가합니다.
      3. "차 구조"와 "오직 자기"의 두 상자를 선택합니다. 문제를 일으킬 차 구조 또는 자체 이량 체의 올리고를 검토 할 수있는 분석 버튼을 누릅니다.
        참고 : 점수는 T m의 이차 구조와 자기 이량 체의 매우 거친 견적을 나타냅니다. 낮은 점수 따라서 최적이며 차단제 차단제 쌍을 제한함으로써 달성 될 수있다. 아미노산 Q262-I266 다루도록 설계 및 기능 된 3'-가 반전에서 MyD88 [(TCAGA + AG + C +는 G +는 + C T + G + A + T + CC / invdT가 / +) MYD88blocker]의 차단 올리고 DT는 3'- 엑소 뉴 클레아 제에 의한 DNA 중합 효소에 의해 열화를 모두 확장을 억제한다. 이러한 특정 차단 올리고는 "+ N"으로 표시되어 열 개 차단 염기와 17mer이다. 나머지 7 개 염기는 일반적인 DNA 뉴클레오티드이다.
  3. WTB-PCR 설정 및 열 순환
    1. WTB-PCR 마스터 마일 준비X / 20 mM의 승의 MgCl 2, 250 개 μM의 dNTP를 0.2 μM 정방향 2.5 μL PCR 반응 완충액 10 배하여 (MMX) 및 역방향 프라이머, 1.2 μM MYD88blocker와 DNase를, RNAse가없는, 고순도의 H 2 O 최종를 만들 반응 당 21.75 μL 용액의 부피.
      주 : 작업 농도 (DNA 템플릿과 폴리머의 첨가 후) 25 μL의 최종 반응 부피위한 것이다. 종래의 PCR MMX 단순히 차단의 추가를 생략하여 제조된다. 모든 프로토콜 단계는 WTB 기존 PCR 모두 동일하게 유지됩니다. 이 검증에 사용할 수 있으며, 결정 농축는 차단제의 첨가에 의해 달성했다.
      1. MMX의 양을 산출 할 때 (오염 확인 양성 및 음성 대조군과 비 템플릿 제어) 및 피펫의 오류에 대하여 적어도 하나의 추가의 반응 3 개 추가의 반응을 고려하여 확인 제조 하였다.
    2. 철저하게 소용돌이 MMX. MMX는 불안하기까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다귀.
    3. MMX에 반응 당 0.25 μL의 Taq DNA 중합 효소를 추가하고 혼합하는 반전. 중합 효소는 MMX에 추가되면, 얼음에 보관하십시오.
    4. 각 웰에 효소 반응과 냉각 판과 피펫에 MMX 22 μL을 새로운 96 웰 PCR 플레이트를 넣어.
    5. 폴리머와 MMX를 함유하는 각각의 웰에 100 NG / μL - 3 μL 게놈 DNA (50 추가.
    6. 용액을 각 웰의 바닥에 닿을 수 있도록 플레이트 및 원심 간단히 인감.
    7. 열 순환기에 PCR 플레이트를로드합니다.
      1. 다음과 같이 WTB-PCR 반응을위한 열 순환 조건을 설정 : 초기 변성을 6 분 동안 95 ℃로; 1 분 20 초 동안 72 ° C에서 30 초 동안 56 ° C에서 30 초, 프라이머의 어닐링, 95 ℃에서 변성, 및 연장 40 사이클; 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장.
        참고 : 모범 사례는 amplicon의 오염을 방지하기 위해 물리적으로 분리 된 지역에 프로토콜의 나머지 부분을 완성 포함 전n은 미래 설정.
  4. WTB-PCR의 성공 여부를 결정하는과 비 템플릿 컨트롤의 증폭의 부족을 확인하기 위해 이전에 설명한 프로토콜 (14)에 따라 겔 전기 영동을 수행합니다.
  5. 자석 구슬에 의한 PCR 제품의 정제
    1. 4 ° C에서 자기 구슬을 제거하고 실온에 가져다.
    2. 새로운 PCR 플레이트에 10 μL PCR 제품을 전송합니다.
    3. 소용돌이는 자기 구슬 적극적 완전히 자기 입자를 재현 탁합니다.
    4. 새로운 플레이트에 각 웰에 18 μL에게 자기 구슬을 추가합니다. 피펫 10 배를 섞는다.
    5. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
    6. 용액으로부터 분리 된 비드 2 분간 사이드 스커트 자석판 위에 PCR 플레이트를 놓는다.
    7. 비드 펠렛을 피하고, 다중 채널 피펫으로 상층 액을 흡인.
    8. 각 150 μL에 70 % 에탄올을 잘 분배하고, 실온 FO 부화적어도 30의 R. 멀티 채널 피펫과 에탄올을 대기음 및 팁을 폐기합니다. 다시 한번이 세척 절차를 반복합니다.
    9. 20 μL 멀티 채널 피펫 잘 각각의 나머지 에탄올을 대기음 및 팁을 폐기하여.
    10. 우물 (~ 10 분) 건조되면, 15 시간 또는 소용돌이 부드럽게를 자석 플레이트에서 제거하고 각 웰 피펫 믹스 40 μL에게 뉴 클레아없는 물을 추가합니다.
    11. 2 분 동안 실온에서 인큐베이션.
    12. 용액으로부터 분리 된 비드 1 분 동안 자석 플레이트 상 PCR 플레이트를 놓는다.
    13. 새로운 PCR 플레이트로 정제 된 생성물의 양도 35 μL. 이 정제 된 PCR 제품은 이제 양방향 시퀀싱을 진행 할 준비가 또는 필요할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
      참고 : 새로운 분석을 개발할 때, 정제 된 PCR 산물의 정량화가 요구 될 수있다. 1 - NG / μL의 DNA 앰플 리콘 양방향 시퀀싱에 적합하다. 농도가 지속적으로 낮은 경우, PCR 제품 및 자기 구슬을 증가 proportionally (1 : 1.8). 농도가 지속적으로 높은 경우, 물을 더 큰 볼륨으로 용출.

WTB-PCR 제품의 3 연속

  1. 양방향 시퀀싱
    참고 : 다음 프로토콜은 적은 시약을 사용하여 최적화 된 제조업체의 지침의 수정 된 형태이다.
    1. 순방향 준비 및 역방향 시퀀싱 반응은 최종 용액을 만들기 위해 추가의 DNase, RNAse가없는, 고순도의 H 2 O 0.25 μL 레디 반응 혼합물 1.88 μL 시퀀싱 버퍼, 1.78 μM M13-F 또는 M13-R 시퀀싱 프라이머와 함께 혼합 반응 당 9 μL 부피. 이 염기 서열 반응 믹스 년까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
    2. 순방향 시퀀싱 반응을위한 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 순방향 시퀀싱 반응 혼합물의 9 μL 피펫. 역방향 시퀀싱 반응을위한 별도의 플레이트상에서 반복한다.
    3. 정제 된 WTB-PCR 제품 t의 1 μL를 추가O 각 웰에 순방향 및 역방향 모두 판.
    4. 용액을 각 웰의 바닥에 닿을 수 있도록 플레이트 및 원심 간단히 인감.
    5. 열 순환기에 PCR 플레이트를로드합니다.
      1. 다음 시퀀싱 반응을위한 열 순환 조건을 설정 : 1 분 동안 96 ° C 단계; 10 초 동안 96 ℃에서 30 사이클, 5 초 동안 50 ℃, 4 분 동안 60 ° C; 정제를위한 준비가 될 때까지 4 ° C에서 개최.
  2. 시퀀싱 제품을 정화
    1. 3M 아세트산 나트륨 (pH5.2), 100 % 에탄올의 신선한 1시 25분 용액을 준비한다.
    2. 신선한 70 % 에탄올 용액을 준비합니다.
    3. 아세트산 나트륨의 30 μL 서열 플레이트 피펫 믹스 5 배 순방향 및 역방향의 각 웰 / 100 % 에탄올 용액을 추가한다.
    4. 플레이트를 봉인하고 20 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다.
    5. 15 분 동안 2,250 XG에 플레이트를 원심 분리기.
    6. 플레이트의 봉인을 제거하고 폐기물을 통해 반전컨테이너.
      참고 : 반전 한 번만 또는 펠렛이 잘 바닥에서 느슨해 질 수 있습니다.
    7. 1 분 동안 150 XG에 깨끗한 종이 타월 및 원심 분리기의 반전 플레이트를 놓는다.
    8. 각 웰에 150 μL 70 % 에탄올을 추가합니다.
    9. 5 분 2,250 XG에서 플레이트 스핀을 다시 봉인.
    10. 반복 3.2.6와 3.2.7 단계를 반복합니다.
    11. 우물이 완전히 건조하지 않은 경우, 실온에서 건조 공기로 할 수 있습니다. 건조하면서 샘플을 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다.
    12. 각 웰 피펫 믹스에 10 배를 10 μL 포름 아미드를 추가합니다. 플레이트를 다시 봉인.
    13. 5 분 동안 39 ° C이어서 3 분 동안 95 ℃의 열 순환기에 변성.
    14. 변성 후, 제조업체의 지침 15에 따라 시퀀싱 플랫폼에서 격막 및 순서와 함께 접시 실러를 교체합니다.

시퀀싱 결과 4. 분석

  1. 시퀀싱 DAT를 사용하여 시퀀싱 흔적을 시각화제조업체의 지침 (16)과 각각의 기준 서열 정렬에 따른 분석 소프트웨어. NCBI 참조 서열 "NM_002468"에서 MyD88에 정렬.

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결과

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확장시 WTB-PCR의 개념적 개관도 1에 제시된다. 블로커-DNA 하이브리드의 단일 염기 미스 매치가 크게의 용융 온도 감소하므로 (ΔT의 m = 20 - 30 °의 C)에서, WT 대립 유전자의 증폭을 돌연변이 주형 DNA는 확장자 (17)을 완료 할 수없는 상태에서 차단된다. WT 선형 DNA 증폭 동안 이러한 방식으로, 돌연변이 DNA를 기하 급수적으로 증폭된다.

WTB-PCR에 의해 달성 돌연변이 농축 시연은도 2에 제시된다. 와 돌연변이가없는 환자의 게놈 DNA를 테스트했다 재래식 WTB-PCR 후 WTB-PCR에 의해 달성 전형적인 농축 및 WT DNA에 잘못된 반응의 부족을 보여 염기 서열. WTB MMX-PCR에 사용 된 ...

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토론

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여기에 설명 된 WTB-PCR 분석은 신장 (도 1) 동안 WT에 DNA의 증폭을 차단하기위한 차단 올리고 프라이머와 일반 세트를 사용한다. WTB-PCR 생성물은 돌연변이 염기 서열을 분석한다. WTB-PCR / 생어의 유틸리티는 단순, 높은 감도 및 높은 처리량에있다. 여기에 설명 된 지침을 사용하여, 대부분의 기존 생어 기반 분석은 단순히 크게 감도를 증가시키기 차단 올리고 뉴클레오티드의 추가를 통해 수정 될 수 있습니다. 여기에 제시된 실시 예 분석에서 PCR 단일 차단 올리고 뉴클레오티드의 첨가는 WTB-PCR 분석 3> 0.5 %의 통상적 인 분석에 대한 WT의 배경에서 약 16 % 돌연변이 대립 유전자의 검출 한계를 증가. 효과는 임상 시험 3 본 위음성의 64 % 감소된다. 에서 MyD88 돌연변이의 존재를 확인하는 것은 중요한 진단 및 예후 IMPL있다ications; 거짓 전반적인 치료와 ...

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공개 사항

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감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 또는 2 mL Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브Eppendorf05-402-25
100% 알코올VWR89370-084조직학 등급; 91.5% 에탄올, 5% 이소프로필 알코올, 4.5% 메틸 알코올
3730XL 시퀀서ABI또는 동급
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881마그네틱 비드 PCR 정제용
알루미늄 밀봉 포일GeneMateT-2451-1PCR 및 냉장 보관용
BigDye Terminator v3.1 주기 염기서열분석 키트Life Technologies4337455양방향 염기서열분석용. 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 시리즈EppendorfA-2-DWP 로터(PCR 플레이트용)
96웰 플레이트용 냉각판EppendorfZ606634
DNAse, RNAse-free, 초순수
dNTP (100 mM)Invitrogen10297-117
DynaMag-96 사이드 스커트 자석Thermo Fisher Scientific12027PCR 정제에 사용됩니다.
에탄올 앱솔루트 SigmaE7023200 proof, 분자생물학
Exiqon 웹사이트 Oligo Toolswww.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µ L)Roche12032937001With10x 집중 PCR 반응 버퍼, 20 mM MgCl2
Gel 전기영동 장치2% 아가로스 젤
GeneRead DNA FFPE 추출 키트 Qiagen180134서열분석 아티팩트를 줄이는 데 필요한 우라실 DNA 글리코실라아제를 함유
Hi-Di 포름아미드ABI4311320염기서열분석을 위해 사용됩니다.
LNA 올리고뉴클레오티드Exiqon5001005'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA 염기)
M13-F 염기서열분석 프라이머ABI5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R 염기서열분석 프라이머ABI5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S ThermocyclerEppendorfE950030020
Microcentrifuge Model 5430EppendorfFA-45-30-11 rotor (1.5/2 mL microcentrifuge tubes용)
NanoDrop 2000 분광광도계Thermo Fisher Scientific
PCR 포워드 프라이머IDT5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR 리버스 프라이머IDT5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR platesGeneMateT-3107-1
피펫터20, 200, 1,000 &마이크로; L
플레이트 격막, 96 웰ABI4315933
QIAamp DNA 미니 키트Qiagen51304BM 흡인 및 말초 혈액용
SeqScape Sortware v3.0ABI4474978염기서열 분석
슬라이드 바구니
아세트산 나트륨 (3 M, pH 5.2) SigmaS7899
멸균 여과 피펫 팁20, 200, 1,000 &마이크로; L
써모믹서 C Eppendorf5382000023
Vortex genieScientific IndustriesSI-0236
세척 reservoir~ 1,000 mL
XyleneVWR89370-088조직학 등급
염기하고 있으며,

참고문헌

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