이 프로토콜은 낭포성 섬유증(CF)이 있는 피험자의 배양 조직에서 CFTR 기능 및 CFTR 조절제 반응을 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 생검 유래 장 오가노이드는 cAMP 주도 방식으로 팽창하며, 이는 CF 오가노이드에서 결함이 있는(또는 크게 감소한) 반응이며 CFTR 조절제에 노출되어 회복될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
최근에 개발된 낭포성 섬유증 막횡단 컨덕턴스 레귤레이터(CFTR) 조절 약물은 낭포성 섬유증(CF)을 앓고 있는 피험자에서 돌연변이 CFTR 채널의 표면 발현 및/또는 기능을 수정합니다. 이러한 약물로부터 혜택을 받을 수 있는 피험자의 식별은 CFTR 돌연변이의 광범위한 이질성뿐만 아니라 개별 약물 효능에 기여하는 기타 알려지지 않은 요인으로 인해 어렵습니다. 여기에서는 개별 CFTR 기능 및 CFTR 조절제에 대한 반응을 시험관 내에서 측정하기위한 간단하고 비교적 빠른 분석법을 설명합니다. 3차원(3D) 상피 오가노이드는 표준 오가노이드 배지의 직장 생검에서 성장합니다. 일단 확립되면 오가노이드는 향후 분석을 위해 바이오 뱅크될 수 있습니다. 분석을 위해 30-80개의 오가노이드를 기저막 매트릭스의 96웰 플레이트에 파종한 다음 약물에 노출시킵니다. 하루 후, 오가노이드는 칼세인 녹색으로 염색되고, 포스콜린 유도 붓기는 37 °C에서 컨 포칼 라이브 셀 현미경 검사법으로 모니터링됩니다. 포스콜린 유도 팽창은 완전히 CFTR 의존적이며 충분히 민감하고 정확하여 서로 다른 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 개인의 약물 반응 사이의 구별을 허용합니다. 체외 팽창 반응은 치료에 대한 임상적 반응과 상관관계가 있습니다. 이 분석법은 CFTR 돌연변이와 무관하게 약물 반응성 개인을 식별하기 위한 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 또한 미래의 CFTR 변조기 개발에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
서론
CF는 상피 음이온 채널을 암호화하는 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도도 조정기 (CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다. CF는 전 세계적으로 1 약 85,000명에 영향을 미친다. 2,000 CFTR 돌연변이는 (확인되었다 www.genet.sickkids.on.ca ). 이러한 다양성은 부분적으로 관찰 질환 표현형 (넓은 스펙트럼을 설명 www.CFTR2.org ) 2, 3. CFTR 돌연변이 여섯 클래스 CFTR 단백질 발현과 기능에 미치는 영향에 기초하여 정의된다 : (I)없이 합성 (II) 손상 피킹 (III) 불량 채널 게이팅 (IV)가 변경 컨덕턴스 (V하면) 보통의 수준을 감소 CFTR를 작동하고 (VI) 손상된 세포 표면 안정성 4. 일반적인 CFTR 돌연변이가 잘 연구되어 있지만, CFTR 기능과 임상 적 상태와 관계 poorl 유지Y는 특히 드문 "고아"돌연변이 (의 큰 그룹에 대해 각 레벨에서 이해
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프로토콜
여기에 설명 된 인체 조직을 사용하는 모든 실험은 대학 의료 센터 위트 레흐트에서 윤리위원회에 의해 승인되었다 (UMCU, TcBio 번호 14-008)를. 조직 수집, 생성, 저장 및 organoids의 사용에 대한 동의는 빌헬미나 어린이 병원 (WKZ) -UMCU에서 환자로부터 얻은 것입니다.
| 장비 | 소모품 | 도구 |
| 층류 후드 | 도 15 및 50 ㎖ 원뿔형 튜브 | 자이스 혈구 LSM 800 - 이미지를 측정하는 젠 2 (블루 에디션) 소프트웨어 |
| CO 2 배양기 | 의 microfuge 튜브 | 마이크로 소프트 엑셀 프로그램 |
| 세포 배양 현미경 (조명 / 광학 현미경) | 0.22 μm의 필터 | |
| 원심 분리기 | 혈청 학적 .... |
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결과
도 1a는 BMM에 포함 된 지하실의 대표 신선한 격리를 보여줍니다. 지하실은 CF 제목의 대장 조직 검사에서 있습니다. 일반적으로, organoid 각 토굴 (- C 그림 1A)에서 생성됩니다. 때문에 CFTR의 기능 장애로, 대장 CF의 organoids의 대부분은 낭포 성 이라기보다는 소형 계획과 buddings (그림 2A - 2B)에 있습니다. 그러나 일부 CF는 낭포 성 모양 (그림 2C), 야생형 organoid 문화 등 (그림 2D)와 몇 organoids이 특히 높은 잔존 기능, 문화를 organoid.
배양을 확장하거나 FIS 분석을.......
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토론
여기서 우리는 인간의 대장 organoids의 생성, 확장, 냉동과 해동을위한 완벽한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 인간의 organoid 문화를 몇 시간 전에 17를 설립하지만, 때로는 교육 실습없이 다른 연구소에서 기술을 확립하기 어려운 입증했다. 우리는 이러한 프로토콜은 교육을 대체 할 것으로 예상.
이 Wnt-3A 에어컨 매체 수립하고 organoid 문화 장기적인 유지에 성공하기 위해 가장 중요한 시약 중 하나입니다. 실제로, organoid 문화가 낮은 활동의 Wnt-3A-conditoned 매체에 "충돌"노출 수있는 경우. 이 Wnt-3A 에어컨 매체 내부에서 이루어지기 때문에, 활성 매체를 생성 할 때 고려되어야 여러 측면이있다. 활성의 Wnt-3A는 L 세포 및 소수성의 안정화를 위해 적절한 성장 신호를 제공하는 고품질의 소 태아 혈청 (FBS)을 매체 중에서 제조 할 수있다이 Wnt-3A 분자. 이.......
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공개 사항
Hans Clevers는 오가노이드 배양 및 Forskolin 유도 부종 분석에 대한 특허에 대한 발명가입니다. Jeffrey M Beekman은 Forskolin 유발 부종 분석에 대한 특허의 발명가입니다. Sylvia F Boj와 Robert Vries는 오가노이드 기술에 대한 독점 라이선스를 보유하고 있는 Hubrecht Organoid Technology(HUB) 재단에 고용되어 있습니다. 그렇지 않으면 저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 네덜란드의 CF 재단 (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103)는 빌헬미나 아동 병원 연구 기금과 CZ, 및 Zilverenkruis / Achmea의 HIT-CF 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 S. HEIDA 미셸, M. Geerdink, KM 드 겨울 드 그루, 그리고 G. Berkers (소아 호흡기학, 빌헬미나 어린이 병원, UMC 위트레흐트학과), 및 RHJ Houwen (소아 소화기, 빌헬미나의 부서에 감사드립니다 환자 접근과 CF 바이오 뱅크의 발전을 위해 조직 검사를 얻기를위한 어린이 병원, UMC 위트레흐트).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 고급 Dulbecco' s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml | 써모 피셔 사이언티픽: Invitrogen | #12634 | 4°C에 보관됨; C |
| GlutaMax | 써모 피셔 사이언티픽: Invitrogen | #35050 | 4°C에 보관되었습니다. C |
| Hepes | Thermo Fisher 과학: Invitrogen | # 15630-056 | 4 °에 저장됨; C |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 써모 피셔 사이언티픽: Invitrogen | #15140-122 | -20°C에 저장되었습니다. C |
| 96 웰 배양 플레이트 | Cellstar | #655180 | |
| 24 웰 배양 플레이트 | Cellstar | #662160 | |
| 6 웰 배양 플레이트 | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | 에 보관; C |
| 둘베코' s 수정된 독수리 미디엄 (DMEM) 500 ml | 써모 피셔 사이언티픽: Invitrogen | #31966-021 | Wnt-3A 컨디셔닝 배지 생산용. 4 °에 저장; C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | Wnt-3A 컨디셔닝 배지 생산용. -20 °에 저장됨; C |
| L Wnt3A 세포주 | ATCC | #CRL-2647 | Wnt-3A Conditioend 매체 생산용. |
| TOP/FOP 플라스미드 | Millipore | #17-285 | Wnt 활성 측정용 |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | Wnt 활동 측정용 |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | Wnt 활동 측정용 |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | Wnt 활성 Zeocin을 측정하기 위해 |
| 써모 피셔 사이언티픽: Invitrogen | #R250-01 | Wnt-3A 세포주 선택 | |
| B27 보충제용 | 써모 피셔 사이언티픽: Invitrogen | #17504-044 | -20 °에 저장되었습니다. C |
| N-아세틸시스테인 | 시그마 Aldrich | #A9165-5G | -20°C에 저장했습니다. C |
| 니코틴아미드 | 시그마 알드리치 | #N0636 | -20 °에 저장; C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | -20 °에 저장; C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | -20 °에 저장됨; C |
| TGFb 유형 I 수용체 억제제 (A83-01) | Tocris | #2939 | -20 °에 저장되었습니다. C |
| Y-27632 이염산염 (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | -20°C에 저장; C |
| p38 MAPK 억제제 (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | -20 °에 저장; C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | -20 °에 저장되었습니다. C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | # 120-10C | 는 -20 °에 저장되었습니다. C |
| 인간 R-spondin 3 (hRspo-3) | R& D Systems | #3500-RS/CF | 는 -20°C에 저장됨; C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- -250 | °에 저장되는 250mg; C |
| Gentamycin | Life Technologies: - | #15710-049 | ; C |
| 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) | 시그마 알드리치 | # 431788 | 4 °°C에 저장; C |
| Matrigel | Corning | #354230 | -80 °에 저장됨; C |
| TryplE 익스프레스 | Life Technologies: | 동결을 위한 트립시니징 오가노이드를 위한 | #12605-010 |
| Medium | Life Technologies: | 동결을 위한 | #12648010 |
| Life Technologies: - | #C3100MP | C | |
| 포스콜린 | R& D Systems | #1099-50 mg | 은 -80 °에 보관됩니다. C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | -80 °에 저장; C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | -80 °에 저장; |
| C시약의 이름/재료 | 용매 | 원료 농도 | >최종 농도 |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µ g/ml | 100 U/ml 100 &마이크로; g/ml | |
| 제오신 | 100 mg/ml | 125 &마이크로; g/ml | |
| B27 보충제 | 100x | ||
| 1x N-아세틸시스테인 | MiliQ H2O | 500 mM | |
| 니코틴아미드 | DPBS | 1 M | 10 mM |
| 인간 상피 성장 인자 (hEGF) | DPBS 0.1% BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µ M | 10 nM |
| TGFb 유형 I 수용체 억제제 (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 디하이드로클로라이드 (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 &마이크로; M |
| p38 MAPK 억제제 (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 &마이크로; M |
| 프리모신 | 50 mg/ml | 100 &마이크로; g / ml | |
| 인간 Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1 % BSA | 100 µ g/ml | 100 ng/ml |
| 인간 R-spondin 3 (hRspo-3) | 은 로트당 다름 | 300 ng/ml | |
| 반코마이신 | 10 mg/ml | 50 &마이크로; g/ml | |
| 겐타마이신 | 10 mg/ml | 50 &마이크로; g / ml | |
| 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) | MiliQ H 2 < / sub>O | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µ g/ml | 3.3 ng/ml |
| 포스콜린 | DMSO | 10 mM | 변수 |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | 변수 |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | 변수 |
참고문헌
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- ....
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재인쇄 및 허가
