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방법 논문

포스 콜린 유발 장내 Organoids에 붓기 일 :

19.2K 조회수

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DOI:

10.3791/55159

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2017년 2월 11일

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1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 낭포성 섬유증(CF)이 있는 피험자의 배양 조직에서 CFTR 기능 및 CFTR 조절제 반응을 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 생검 유래 장 오가노이드는 cAMP 주도 방식으로 팽창하며, 이는 CF 오가노이드에서 결함이 있는(또는 크게 감소한) 반응이며 CFTR 조절제에 노출되어 회복될 수 있습니다.

초록

최근에 개발된 낭포성 섬유증 막횡단 컨덕턴스 레귤레이터(CFTR) 조절 약물은 낭포성 섬유증(CF)을 앓고 있는 피험자에서 돌연변이 CFTR 채널의 표면 발현 및/또는 기능을 수정합니다. 이러한 약물로부터 혜택을 받을 수 있는 피험자의 식별은 CFTR 돌연변이의 광범위한 이질성뿐만 아니라 개별 약물 효능에 기여하는 기타 알려지지 않은 요인으로 인해 어렵습니다. 여기에서는 개별 CFTR 기능 및 CFTR 조절제에 대한 반응을 시험관 내에서 측정하기위한 간단하고 비교적 빠른 분석법을 설명합니다. 3차원(3D) 상피 오가노이드는 표준 오가노이드 배지의 직장 생검에서 성장합니다. 일단 확립되면 오가노이드는 향후 분석을 위해 바이오 뱅크될 수 있습니다. 분석을 위해 30-80개의 오가노이드를 기저막 매트릭스의 96웰 플레이트에 파종한 다음 약물에 노출시킵니다. 하루 후, 오가노이드는 칼세인 녹색으로 염색되고, 포스콜린 유도 붓기는 37 °C에서 컨 포칼 라이브 셀 현미경 검사법으로 모니터링됩니다. 포스콜린 유도 팽창은 완전히 CFTR 의존적이며 충분히 민감하고 정확하여 서로 다른 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 개인의 약물 반응 사이의 구별을 허용합니다. 체외 팽창 반응은 치료에 대한 임상적 반응과 상관관계가 있습니다. 이 분석법은 CFTR 돌연변이와 무관하게 약물 반응성 개인을 식별하기 위한 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 또한 미래의 CFTR 변조기 개발에 중요한 역할을 할 수 있습니다.

서론

CF는 상피 음이온 채널을 암호화하는 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도도 조정기 (CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다. CF는 전 세계적으로 1 약 85,000명에 영향을 미친다. 2,000 CFTR 돌연변이는 (확인되었다 www.genet.sickkids.on.ca ). 이러한 다양성은 부분적으로 관찰 질환 표현형 (넓은 스펙트럼을 설명 www.CFTR2.org ) 2, 3. CFTR 돌연변이 여섯 클래스 CFTR 단백질 발현과 기능에 미치는 영향에 기초하여 정의된다 : (I)없이 합성 (II) 손상 피킹 (III) 불량 채널 게이팅 (IV)가 변경 컨덕턴스 (V하면) 보통의 수준을 감소 CFTR를 작동하고 (VI) 손상된 세포 표면 안정성 4. 일반적인 CFTR 돌연변이가 잘 연구되어 있지만, CFTR 기능과 임상 적 상태와 관계 poorl 유지Y는 특히 드문 "고아"돌연변이 (의 큰 그룹에 대해 각 레벨에서 이해 www.CFTR2.org ) 1,3.

최근 약물 돌연변이 특정 방식으로 CFTR 단백질을 대상으로 개발되어왔다. CFTR 단백질 표적 약물의 두 클래스는 임상 현재 사용중인 액션의 독특한 모드가 있습니다. 이러한 VX-770과 같은 강화제는 치근단 지역화 돌연변이 CFTR의 개방 가능성을 향상시키고 세포 5에 자신의 추가에 직접 작용한다. 이러한 VX-809과 같은 교정기는 소포체 지역화 잘못 폴딩의 CFTR의 인신 매매를 복원하고 효과 전에 세포가 6 관찰과 사전 배양이 필요합니다. CFTR의 강화제, VX-770과 같은 다른 팔에 관해서는, G551D 돌연변이 7,8 피험자에 등록되었습니다CFTR은 S1251N (9)를 포함하여, 돌연변이를 게이팅; 함께, 이러한 돌연변이는 모든 CF 과목의 5 %에 ​​의해 수행된다. 다른 임상 시험, VX-770, 보의 VX-809과 결합이 폐 기능에 아직 심각한 영향을 제한 한 것으로 나타났다 환자 10 45-50%에 의해 전달되는 F508del 돌연변이에 대한 동형 접합을 대상으로 악화 속도의 감소가 발생했습니다 11.

CF 환자의 나머지 50 % 이내 약물 반응 주체를 식별하는 종래의 임상 비용과 시간을 소모하며, 매우 드문 CFTR 유전자형을 가진 개인 가능하지 않다. 신규 비용 효과적인 개인화 방법 CFTR 돌연변이 임의의 타입을 운반하는 개인 CFTR 조절제의 증가와 일치하는 것이 중요하다. 지금까지 특정 CFTR 돌연변이를 운반하는 환자 그룹의 시험 포함은 시간에 돌연변이 CFTR 유전자 형질 전환을 사용하여 연구에 의해 유도 된챔버들 (5, 6), (12)를 전기 생리 학적 연구에 Ussing 하였다 eterologous 전지 시스템. 때문에 CF 폐 이식편 재료로부터 유도 된 공기 - 액체 계면 분화 기관지 상피 세포에서의 CF 적절한 동물 모델 약물 효능 연구의 부족 약물 개발 13, 14, 15에 사용되었다. 그러나, 폐 절편 조직 및 침습적 제한된 가용성 흔하지 CFTR 돌연변이의 분석을 방해 말기 질환이없는 환자에서 기관지 세포를 수득하고, 개인화 된 방식으로 약물 검사를 방지 할 수있다. 이러한 제한 등 대장 organoids, 비강기도 세포와 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된기도 세포와 같은 "쉽게 접근"조직을 극복하기 위해, 현재 맞춤 약물 치료에 대한 탐구되고있다.

이전에, 우리는 3D organoids (16), (17)의 형태로 어떤 위장 기관에서 배양 상피 줄기 세포에 대한 프로토콜을 설립했다. 인간 대장 / 직장 들면, 배양 조건이 정의 된 것을 포함 성장 인자 (상피 성장 인자 (EGF), 가스트린,이 Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) 및 소량) 소분자 (니코틴 A83-01와 결합 지하실 막 매트릭스 및 SB202190). 이러한 조건에서, 하나의 줄기 세포 또는 소규모 조직 단편 바깥쪽으로 향한 기부 쪽 고도로 편광 된 상피 세포에 의해 형성된 폐쇄, 낭포, 3 차원 구조 속으로 성장한다. 모든 세포 유형은 일반적으로 정상 비율과 위치에 나타납니다. Organoids 주간 기계적 파괴 및 재 도금에 의해 장기간에 걸쳐 확장 될 수있다. 그들은 유전자 표현형과 안정하고 장기간 팽창 바이오 뱅킹 17 있도록 저장 될 수있다. 그들은 의무가 있습니다모든 표준 세포 생물 / 유전자 조작 및 분석 기술은 2D 셀 라인 (18)을 위해 개발.

최근 CFTR 기능이 용이 포스 콜린 - 유도 부종 (FIS) 분석 19 (20) 대장 organoids 측정 할 수 있음을 보여 주었다. 콜레라 독소 대안 포스 콜린 (FSK) 또는에 노출되면 organoids 급속히 그들 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 수준을 증가되는 CFTR 채널 (19)의 개구부에 회전 결과이다. 건강한 사람에서, 또는 잔여 기능과 관련된 CFTR 돌연변이와 과목에서 Organoids는 이후 organoid 루멘, 분비 성 설사의 체외 상당 이온과 물 수송의 결과로 팽창 할 것이다. CFTR 널 개체로부터 유래 organoids으로 나타낸 바와 같이 대장 organoids FIS의 응답은 이전에 완전히 CFTR 의존적 도시 된특정 약리학 CFTR 억제제 (19)의 사용에 의해 찾지. 큰 주제 특정 데이터 세트는 조직 검사를 복용 후 몇 주 내에 유도 될 수있다.

여기에 상세하게 설명 FIS 분석의 경우, organoids는 나이와 제한된 불편 (21)를 얻을 수있다 직장 생검에서 배양한다. Organoids 쉽게 다시 봉인하고 새로운 organoids을 형성 한 지하실에 기계 중단으로 매주 계대 있습니다. FIS 분석을 실행하는 경우, ~이 중단 작은 organoids의 30 ~ 80은 96 웰 플레이트 (19)의 각 웰에 도금되어있다. 분석의 일에서, organoids는 칼 세인 녹색, 그것은 라이브 영상을 용이하게 살아있는 세포 내에서 유지되는 형광 세포 투과성 염료로 염색한다. 그런 다음, 세포 내 cAMP를 제기하여 CFTR을 활성화 FSK는 organoid 부종을 자극하기 위해 추가됩니다. 혀끝의 CFTR에 따라 행동 강화제를 동시에 w 추가포스 콜린 i 번째, CFTR 인신 매매를 복원 보정기 반면 FSK를 추가하기 전에 24 시간을 추가됩니다. organoid 붓기는 포스 콜린을 첨가 할 때마다 포인트에 대한 모든 형광 객체의 전체 면적의 상대적인 증가를 계산하는 자동화 된 이미지 분석에 의해 정량화한다.

3D는 붓기가 챔버 Ussing에서 2D 배양기도 세포에서 기존의 전기 생리 CFTR 판독을 통해 장점과 단점을 제공 organoid. 주요 장점은 부종 검정의 스루풋이다. 세포 배양 배지의 한 유형을 이용하여 분석하고, 숙련 된 기술자는 12 환자 샘플에서 주당 약 1,200 데이터 포인트를 배양 매주 25 organoid 샘플까지 정량화 할 수있다. 우리는 통상적으로 판 당 중복 또는 세중의 측정에 의해 하나의 실험 조건을 입력하고 3 개의 독립적 인 배양 시간 지점에서 이러한 측정을 반복합니다. 총, 약 300-500의화롯불 organoid 구조는 다음 제한 기술 변화와 CFTR 기능의 매우 정확한 측정에 리드 실험 조건에 따라 측정된다. 이 정밀도는 우리가 명확하게 CFTR 변조기에 잔류 기능 및 응답의 차이를 정의 할 수 있습니다 용이 동일 CFTR 돌연변이 19, 22, 23, 24, 25를 들고 환자 사이의 유전 적 배경 효과를 데리러 우리를 할 수 있습니다. 데이터 품질 용이 현미경 이미지에서 평가 될 수있다. FIS가 완전히 CFTR에 의존하지만,이 CFTR 기능에 대한 간접적 인 결과 측정, 유체 수송에 이온 수송의 결합에 의한 그 판독. 이 transepithelial 이온 전류 (26)를 측정 Ussing 실에서 직접 CFTR 기능 측정과 대조. Ussing 챔버 꼭대기 또는 기저 (c)의 선택 자극을 허용ompartments합니다 (organoid 분석이 허용하지 않는); 기저 막을 permeabilizing함으로써, 정점 CFTR 의존성 음이온 분비 선택적 (27)를 측정 할 수있다.

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프로토콜

여기에 설명 된 인체 조직을 사용하는 모든 실험은 대학 의료 센터 위트 레흐트에서 윤리위원회에 의해 승인되었다 (UMCU, TcBio 번호 14-008)를. 조직 수집, 생성, 저장 및 organoids의 사용에 대한 동의는 빌헬미나 어린이 병원 (WKZ) -UMCU에서 환자로부터 얻은 것입니다.

장비 소모품 도구
층류 후드 도 15 및 50 ㎖ 원뿔형 튜브 자이스 혈구 LSM 800 - 이미지를 측정하는 젠 2 (블루 에디션) 소프트웨어
CO 2 배양기 의 microfuge 튜브 마이크로 소프트 엑셀 프로그램
세포 배양 현미경 (조명 / 광학 현미경) 0.22 μm의 필터
원심 분리기 혈청 학적 피펫
롤링 셰이커 마이크로 피펫 필터 팁
인큐베이터 4 ° C 형 방 4 ° C 형 냉장고 크리오 바이알 (cryovial)
컨테이너 냉동 CoolCell 셀
혈청 학적 피펫
Micropippette (1000, 200, 20 μL)
Viaflo 반복 피펫
(라이브 셀) 공 초점 현미경
컴퓨터
액체 질소 탱크
멀티 채널 (200 μL)

문화 1. 준비 시약

참고 : 모든 단계는 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 세포 배양 작업을위한 표준 가이드 라인을 따르고 있습니다. 기저막 매트릭스 좋은 방울의 형성을 용이하게하기 위해, 96, 24의 예열 재고를 유지하고, 37 ° C의 배양기에서 6 웰 플레이트.

  1. 기초 배지 제조
    참고 : 기저 매체 (BM)는 (4- (2-hydroxyethil)로 보충 햄의 영양 혼합물 F-12 (AD-DF) -1piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 글루타민, 페니실린 / 스트렙토 마이신과 고급 둘 베코의 변형 이글 중간에 펜을 의미 / 연쇄상 구균).
    1. 500㎖의 AD-DF 매체 병, 5 내지 200 mM의 글루타민의 ㎖, 1 M HEPES 5 ㎖, 펜 / 패 혈성 용액 5 ㎖ (10,000 U / ㎖, 10,000 μg의 / ㎖)을 추가한다.
    2. 적어도 4 주 동안 4 ° C의 냉장고에 보관 BM.
  2. 이 Wnt-3A 에어컨 중간 준비
    참고 :이 Wnt-3A 에어컨 매체를 만들어 사내 날기g 제조업체의 지시에 따라 세포주의 Wnt-L-3A.
    1. 의 Wnt-3A 에어컨 매체를 수확를 들어, 한 주 동안 세포에 노출 매체를 수집하고 부유 세포를 제거하기 위해 450 XG에서 5 분 정도 스핀 다운.
    2. 0.22 μm의 필터를 통해이 Wnt-3A 에어컨 매체 필터 50 ML 원뿔 튜브에 40 ml의 분취 량으로 나눕니다. 활성의 손실없이 최소 4 개월 동안 4 ° C에 저장합니다.
    3. 인간 배아 신장 (HEK)를 사용하여 TOP / FOP 분석법에서 레 닐라와 리면 FOP-루시페라아제 및 TK- 레 닐라 형질 측정 -293 세포를이 Wnt-3A - 조정 배지의 활성을 테스트하기에 따라 분석 키트를 -luciferase 제조업체의 지침.
      참고 : TOP-루시 페라 제는 야생형 TCF 결합 영역을 포함하는 리포터 플라스미드이다. 의 Wnt-3A 에어컨 매체가 활성화 된 경우, 정식 Wnt 신호가 활성화됩니다. 베타 - 카테닌은 재치를 연결하는 핵으로으로 전위시간 TCF / LEF 전사 인자 및 상기 기판이 첨가 될 때 상대적 루시 페라 제 활성 증가를 유도 루시퍼 라제 리포터의 전사를 활성화시킨다. TCF의 돌연변이 된 루시 페라 제 유전자의 상류 영역이 결합하기 때문에 FOP-루시페라아제를 음성 대조군으로서 사용된다.
  3. 콜론 중간 준비
    참고 : 준비하고 제조업체의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자 및 시약을 희석. 소형 분취에게 피 동결 - 해동 사이클을 사용한다. 기능성 성장 인자 결과 필수적이다.
    1. 1 배 B27, 1.25 mM의 N 아세틸 시스테인, 50 NG / ㎖ hEGF, 5 나노 가스트린, 10 MM의 니코틴, 300 NG / ㎖ hRspo3, 100 NG / ㎖ hNoggin, 500 μM A83-01으로 BM을 보완하여 대장 매체 (CM)를 준비 일차 세포 항균 10 μM SB202190, 100 μg의 / ㎖.
    2. 분취 액에 CM을 나누고 최대 4 개월 동안 -20 ° C에서 그들을 고정. 전체 대장을 준비하는 분취 액을 해동50 % 추가하여 매체 (FCM)가 CM에 매체의 Wnt-3A는-conditoned. 활성의 손실없이 최대 4 ° C에서 7 일 저장 FCM.
    3. 직장 생검에서 organoid 문화의 설립, 50 μg의 / ㎖ 반코마이신, 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신과 FCM을 보완, 10 μM (ρ) 관련 코일 코일 형성 단백질의 세린 / 트레오닌 키나제 억제제 (RhoKi). 단지 문화의 첫 2 ~ 3 일의 경우,이 매체라는 절연 매체 (IM)를 사용합니다.
  4. EDTA 원액 준비
    1. 0.22 μm의 필터로 멸균 초순수 H 2 O에 0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), pH가 8을 준비한다.
  5. 지하실 막 매트릭스의 조작
    1. 제조업체의 권장 사항에 따라 기저막 매트릭스 (BMM)을 준비합니다.
    2. 하룻밤 얼음 해동 BMM.
    3. 15 ML 원뿔 관, 사용 병에서 BMM를 전송하는 경우5 ML의 피펫과 원뿔 튜브는 -20 ° C에서 미리 냉각 된 15 ml의.
    4. 해동 후, 4 ℃의 냉장고에 BMM을 저장하고 사용하기 전에 최소 30 ~ 60 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
      참고 : 순서가 가장 좋은 결과를 얻을 수에서 BMM은 추위와 제대로 지하실 또는 organoids를 삽입하기 전에 혼합해야합니다.

2. CF 환자의 조직 검사에서 대장 Organoids 구축

주 : 조직 수집 후 식염수 얼음 위에 시료를 유지하는 것이 중요하고, 칼슘 이온과 마그네슘 2+ (DPBS) 또는 BM이없는 둘 베코 인산염 완충 식염수. 생검의 신속한 처리가 권장되지만 최대 7 일 동안 얼음에 저장 생검에서 organoid 문화를 구축 할 수 입증했다.

  1. 생검은 15 ML 원뿔 튜브의 아래쪽에 정착하고 뜨는을 제거 할 수 있습니다.
  2. 10 ML의 피펫을 사용하여 상하 조직 검사 및 피펫에 10 ~ 20 회 DPBS의 10 ML을 추가합니다.
    참고 : 피펫은 조직 검사를 피펫 팅 전에 BM으로 미리 습윤 될 필요가있다.
  3. 생검이 바닥에 정착하고 뜨는을 제거 할 수 있습니다.
  4. 상층 액이 깨끗해질 때까지 반복 2.2 및 2.3 ~ 5 번 단계를 반복합니다.
  5. 생검에 admin으로 10 ml의 200 μL의 EDTA (0.5 M)를 추가하고 4 ℃에서 60 ~ 120 분 동안 흔들 튜브 플랫폼에서 튜브를 배치합니다.
    참고 : 배양 시간은 환자마다 다를 수 있습니다. 지하실이 해제되는 경우, DPBS 흐린된다. 지하실는 현미경으로 관찰 될 때 EDTA 배양이 완료 될 수있다.
  6. 지하실 정착하도록 허용합니다. 상층 액을 버린다.
  7. 최대 BM의 2 mL를 취하여 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 추가합니다. 내부가 BM 덮여있는 방식으로 수동으로 새로운 관을 흔들어.
  8. 피펫을 사용하는 것은 BM으로 미리 습윤, 위아래로 10 ~ 20 번 생검과 피펫을 포함하는 튜브에 DPBS 2 ㎖를 추가합니다.
  9. 생검이 정착하고 새에 지하실로 DPBS를 전송하도록 허용단계 27에서 제조 된 BM의이 용액을 함유하는 관.
  10. 더 이상 지하실이 해제되지 않을 때까지 반복 2.8 및 2.9 단계를 반복합니다.
  11. 8 ° C에서 5 분 동안 130 XG에 지하실을 스핀.
  12. 한편, 실온에서 안전 캐비닛 (RT)에 IM을 전송합니다.
  13. 뜨는을 취소하고 지하실 펠렛 단계를 반복 2.11 BM 10 ㎖를 추가합니다.
  14. BM 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 5 ~ 10 μl를 타고 현미경으로 눈으로 지하실의 수를 계산합니다.
  15. 8 ° C에서 5 분 동안 130 XG에 지하실을 스핀.
  16. 상층 액을 제거하고 55 % BMM (V의 IM에 V의 BMM)에서 펠렛을 재현 탁.
    참고 : 지하실은 μL 당 1 토굴에서 55 % BMM의 해당 볼륨에 재현 탁하고 있습니다. 충분한 지하실이 없으면 BMM의 최소 부피는 40 μL이다.
  17. 시드를 들어, 잘 당 피펫 35 μL (24 웰 플레이트에서). 3-5로 BMM의 35 μl를 분할하는 촉진제의 확산을 개선하기 위해 별도로 삭제BMM에 요소 WTH. 거품을 만들지 마십시오.
  18. 놓고 BMM이 응고하는 적어도 20 분 동안 37 ° C에서 거꾸로 인큐베이터에서 접시를 둡니다.
  19. 물론 당 IM 500 μl를 추가하고 CO 2를 37 ° C에서 인큐베이터에 보관 5 %.
  20. 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다. BMM은 그대로 떨어 남겨두고 P1000 피펫 함께 피펫 팅에 의해 기존의 매체를 제거합니다. 조심스럽게하지 직접 BMM 방울에 잘의 측면에서 피펫 팅에 의해 FCM을 추가합니다.
    참고 : 더 지하실이 분리 프로토콜에 출시되지 않은 경우, 상층 액을 원심 분리 BM으로 펠릿을 2 ~ 3 회 세척하고, BMM에서 그것을 재현 탁. 남은 조직을 가지고 면도칼 작은 조각으로 잘라. , 15 ml의 원추형 튜브에 이들을 모아서 이들을 원심 분리하고, 동일한 BMM에이를 재현 탁. 어떤 상피 줄기 세포가 존재하는 경우,이 또한 organoids를 생성합니다.

유지 보수, 냉동 및 용에 대한 콜론 Organoids의 3과 Passagingskolin 유도 붓기 분석 (FIS)

주 : 모든 organoid 문화가 자신의 배로 시간이 있습니다. 일반적으로 대장 CF의 organoids 1 확장 할 수 있습니다 : 3-1 : 5 시간마다 7~10일. 신진 구조가 관찰되는 경우 그것은 좋은 징조입니다. 대장 정상 organoids (그림 2D) 이상 - 대장 CF의 organoids는 작은 낭종 (2C 그림 2A)에 있습니다. 설치 및 유지 보수를 들어, organoids 24 웰 플레이트에서 배양; 냉동 용, 6 웰 플레이트에; 96 웰 만나고 있습니다에서 FIS 분석을위한.

  1. Organoids의 계대
    1. 사용하기 전에 적어도 30 ~ 60 분 동안 얼음에 BMM을 유지합니다.
    2. 사용하기 전에 적어도 1 시간 동안 RT에서 FCM을 유지합니다.
    3. 샘플 이름과 같은 다른 관 한 15 ML 원뿔 튜브 라벨 "씻어."
    4. 조심스럽게 BMM이 저하 방해하지 않고 P1000 피펫을 사용하여 우물에서 매체를 대기음.
    5. 도 1 및 b에 BM의 1 ML을 추가최대 reak BMM은 P1000 피펫을 사용하여 삭제합니다. 샘플 이름을 가진 15 ML 원뿔 관에이 1 ml에 전송합니다.
    6. BM의 또 다른 1 ㎖로 잘 세척과 같은 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
    7. 반복 (한 15 ML 원뿔 튜브에 세척하는 24 웰 플레이트 6 우물까지) 5 개의 우물과 3.1.5와 3.1.6 단계를 반복합니다.
    8. BM 12 ml의에 튜브까지 채 웁니다. 피펫 위로 미리 적셔 5 ml를 피펫을 사용하여 아래로.
    9. 8 ° C에서 5 분 85 XG에 스핀.
    10. 뜨는을 취소하고 펠렛에 BM 1 ㎖를 추가합니다. 같은 P1000 피펫 팁으로, 필터없이 P10 팁을 차지, 아래로 20 회를 피펫합니다. P1000 및 P10 팁을 모두 폐기하십시오.
    11. 5 ml를 피펫으로 BM의 4 ML을 추가 한면에 수직에서 약 70 ° 기울어 진 튜브를 개최합니다. 새로운 P1000 팁을 미리 젖은 및 P1000 (1 ml의 볼륨)에 적극적으로 2 ~ 3 회를 섞는다.
    12. 기울어 진 위치에 유지하면서, 10 개수 w를 신중 최상층 수집로 표시 튜브에 P1000 피펫 및 전송 4 × 1 ml의 i 번째 "씻어."
    13. 기울어 진 튜브의 바닥에 정착 organoids을 준수; 파쇄 organoids 더 큰 덩어리가 바닥에 가라 앉을 것입니다. 원심 분리기 15 ml를 85 XG에 8 ℃에서 5 분 동안 튜브를 "세척".
    14. 뜨는을 취소하고 55 % BMM의 최종 농도로 organoid 펠릿 중간 및 BMM의 필요한 양을 추가합니다. 거품 (그림 3B)을 생성없이 피펫 팅에 의해 아래로 섞는다.
      참고 : 좋은 밀도가 BMM의 10 μL에 25 ~ 30 organoids 시드에 의해 달성된다.
    15. 팔로우는 2.17-2.19 단계를 반복합니다.
  2. 동결에 대한 계대
    1. 사용하기 전에 적어도 30 ~ 60 분 동안 얼음에 BM을 유지합니다. 사용하기 전에 적어도 1 시간 동안 RT에서 FCM을 유지합니다.
    2. RhoKi (단계 1.3.3)로 보충 FCM을 준비합니다.
    3. 냉장고에서 트립신을 가지고 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 실온에서 둡니다.
    4. 단계에 따라 3.1.5-3.1.10.
    5. 가능한 한 많이 뜨는을 제거 30 초 동안 4 트립신 ml의, 그리고 소용돌이를 추가합니다.
    6. 30 초 동안 격렬하게 1 분 소용돌이, 37 ℃의 온수 배스에 튜브를 넣고.
    7. 튜브에서 솔루션을 검사합니다. 그대로 organoids는 현미경으로 여전히 볼 수 있습니다 경우, 단계 3.2.7를 반복합니다.
    8. organoids이 중단되는 경우, 트립신과 피펫 10 회 중화 BM의 8 ml를 추가합니다.
    9. 8 ° C에서 450 XG에 3 분 스핀.
    10. 뜨는을 취소하고 55 % BMM 솔루션에 도달하기 위해 organoids에 중간 BMM의 필요한 양을 추가합니다. 거품을 만드는없이 피펫 팅에 의해 아래로 섞는다.
      참고 : 트립신 후 : 1 비율로 동결 들어, organoids는 1 시드해야합니다.
    11. 종자 ~ 10 μL의 작은 분리 액적들을 생성하는 예열 6 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 250 μL. 37 ° C에서 인큐베이터에서 거꾸로 판을 놓고 떠나BMM은 20 ~ 30 분 동안 응고합니다.
    12. 물론 각 6 웰 플레이트에 신선한 FCM + RhoKi의 2.5 ML을 추가하고 인큐베이터 (그림 3C)에 접시를 전송합니다.
  3. FIS의 분석에 대한 Organoids를 계대
    주 : 24- 웰 플레이트의 4, 6 웰 사이 organoids의 수와 크기에 따라서 96 웰 플레이트의 웰 (27)을 시드 충분하다.
    1. 단계 3.1-3.1.13에서 설명 된대로 organoids을 처리합니다.
    2. 50 % BMM 120 μL에 펠렛을 재현 탁.
    3. 현미경 3 ㎕를 BMM 드롭에 organoids의 수 (30-50)를 확인합니다.
    4. 플레이트를 96 웰 페이트의 각 웰의 중앙에 배치 된 3 μL 한 방울을 이용하여 organoids.
    5. BMM이 응고하는 15 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓고; 추가 단계는 단계 6.1.1에 설명되어 있습니다.

4. 냉동 콜론 CF Organoids

참고 : 오르간OID를가 1~2일 트립신 및 배양 후 아래로 동결 할 준비가, 그래서 organoids는 여전히 해동 후 생존율의 효율성을 증가시키는 작은 것입니다.

  1. BM의 1 ML을 추가하고 BMM은 P1000 피펫을 사용하여 방울 헤어. 15 ML 원뿔 튜브에 전송합니다.
  2. 같은 15 ML 튜브에 BM 및 전송의 또 다른 1 ㎖로 잘 씻으십시오.
  3. 반복 모든 우물 4.1 및 4.2 단계를 반복합니다.
    참고 : 초과 BMM 방지하기 위해는, 6 웰 플레이트의 3 우물 한 15 ML 튜브에 풀됩니다.
  4. 12 차가운 BM ㎖의 피펫 위아래로 5 ML의 피펫으로 organoids를 포함하는 15 ML 튜브를 입력합니다. 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요.
  5. 450 XG에 3 분, 8 ° C에 대한 스핀과 뜨는을 제거합니다.
  6. 제대로 organoids를 재현 탁 위아래 중간 피펫을 동결과 organoids의 펠렛을 디졸브.
    참고 : 동결 매체의 500 μL가 BMM 각각 100 ㎕를 위해 사용된다.
  7. 5 ml의 피펫을 사용하여, 0.5 ml의 전송동결 매체에 재현 탁 organoids는 극저온 튜브를 멸균합니다.
  8. 세포 냉동 컨테이너에 튜브를 전송하고 -80 ° C에 넣어.
  9. 24 시간 후, 액체 질소 저장을 위해 튜브를 전송합니다.

5. 냉동 Organoids에서 문화 구축

참고 : 얼음에 BMM을 해동 얼음에 보관하십시오. BM은 RT에 도달하고, 해동 한 cryovial의 절차를 시작하기 전에 37 ° C에 10 ml의 나누어지는을 따뜻하게 할 수 있습니다.

  1. 아직도 조금 냉동 재료가 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 교반 빠르게 병을 해동.
  2. P1000 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 해동 organoids을 전송합니다.
  3. 상기 튜브의 하단을 진탕하면서 직후 드롭하여 따뜻한 BM 드롭 1 ㎖를 추가한다. 배지 1 ml를 첨가하면 동결 배지 희석 몇 번까지 피펫 팅에 의해 아래로 조심스럽게 혼합한다.
  4. 천천히 (적가)는 원뿔 튜브 접점에 따뜻한 BM의 9를 가하여organoids를 ining. 몇 번 반전.
  5. 85 XG 8 ℃에서 3 분 동안 세포 현탁액을 스핀.
  6. 펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 상층 액을 버린다. RhoKi (단계 1.3.3)로 보충 FCM의 90 μL에서 organoid를 재현 탁. 그런 다음, BMM의 110 μl를 추가합니다.
  7. 작은 분리 방울을 만들고, 미리 예열 24 웰 플레이트의 각 웰에 35 μl를 추가합니다.
  8. 거꾸로 20 ~ 30 분 동안 접시를 떠나 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다.
  9. 각 웰에 RhoKi와 FCM의 500 μl를 추가하고 다시 인큐베이터 (그림 4A - 4C)에 접시를 전송합니다.
  10. organoids가 해동에서 제대로 회복되면, 그래서 BMM 각각 10 μL가 25 ~ 30 organoids이 포함되어 더 BMM에 희석. 이 절차 (도 4d - 4G)를 해동 후 2-3일 할 수 있고 organoid의 적절한 성장을 보장한다.

6. 포스 콜린 유발 붓기로말 (FIS)

주 : FSK 적정은 CFTR 잔류 기능의 측정을 허용한다. CFTR 변조 들어 organoids 주어진 보 (예, VX-809) 및 / 또는 강화제에 노출된다 (예를 들어 VX-770), 유전자형에 따라. VX-770 및 FSK 바로 측정을 시작하기 전에 추가하는 동안 일반적으로, VX-809은 측정 전에 18 ~ 24 시간을 추가됩니다. 일부 변조기 (보정기 / 강화제)를 분석 플레이트의 플라스틱 표면에 결합 할 수 있음을 유의하십시오.

  1. 정량법에 대한 도금
    참고 : VX-809 주식은 20 밀리미터에 분주 및 -80 ° C에 저장됩니다. 해동하면, RT에두고 빛으로부터 보호합니다.
    1. 3.3 절에 설명 된대로 organoids을 처리합니다.
    2. VX-809 보정기를 테스트하면 다음 농도 삼중의 용량 - 반응 곡선을 제조 : 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, 30 μM있다. FCM의 희석을 준비합니다.
    3. 96 웰 플레이트에, 하나 100 μ를 추가, FCM의 각각의 VX-809 농도 100 μL와 FCM의 난 단지와 접시를 품어.
  2. 정량법 측정
    참고 : FSK 10 밀리미터에있는 동안 VX-770 종목이 20 밀리미터로 분주된다 모두 -80 ° C에 저장됩니다. 해동하면 상온에서 떠나 빛으로부터 보호합니다.
    1. 칼 세인 및 DMSO의 유리 병을 가지고 15 분 동안 실온에서 둡니다.
    2. 개봉하면 칼 세인이, 분말로 제공되는 유리 병에 DMSO 5.1 μl를 추가합니다. 그렇지 않으면, 칼 세인의 2.5 μl를 포함하는 이미 재현 탁 칼 세인 유리 병을 사용합니다.
    3. 1.5 ML 튜브에 BM의 580 μL에 칼 세인의 2.5 μl를 추가하고 레이블을 붙입니다.
    4. 각 웰 반복 피펫을 사용하여이 염료 용액 (BM + 칼 세인)의 10 μl를 추가합니다.
    5. 염료가 잘 혼합 될 수 있도록 멀티 채널 회 재현 탁.
    6. 30 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어.
    7. 칼 세인 인큐베이션 동안, FSK 제조 시작VX-770 및 솔루션은 필요한 경우.
    8. VX-770의 강화제를 사용하는 경우 다음과 같은 농도 중으로 용량 - 반응 곡선을 제조 : 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, 30 μM있다. 적정 주파수 변조의 경우, 농도는 0, 0.008, 0.02, 0.05, 0.12, 0.32, 0.8, 2.0 및 5.0 μM. BM의 희석을 준비합니다.
      주 : FSK, VX-770, 또는 둘째 날에 추가 된 다른 약물의 경우, 희석 이미 100 μl를 함유 / 약물 적정 용액을 각 웰에 첨가한다 FSK 100 ㎕, 이후 2 × 최종 농도로 제조되어야 FCM의.
    9. 현미경 실에 FSK 및 VX-770 솔루션을하는 P200 피펫 및 팁을 전송합니다.
    10. FIS 분석을 이미징하는, 자동화 된 단계, 가열 챔버 및 CO 2 유동 구비 한 생균 촬상 공 초점 현미경을 사용한다.
      주 : 다음 단계는 특정 현미경을 참조하십시오. 다른 설정은 다음과 같은 다른 현미경에 제조업체의 적용해야명령.
    11. 판 홀더에 96 웰 플레이트를 넣습니다.
    12. 영상의 공 초점 설정을 입력합니다.
      1. 37 ° C로 실시간 이미징 도구를 미리 설정하고, 5 % CO 2 챔버는 측정 전에 30 분 이상 동안 사전 부화하자.
      2. 알렉사 불소-488 트랙을 선택하기 위해 "스마트 설정"옵션을 사용합니다.
      3. 축소 및 전체 잘 캡처 0.6 배에 5 배 렌즈와 스캔 영역을 설정합니다.
      4. 배경 위에 칼 세인 녹색 표시 organoids의 최적의 검출을 가능하게하는 레이저 파워 검출기 감도를 적응. 핀홀 130 μm의 증가 될 수 있고, 상기 화상 평균화는 2로 설정 될 수있다.
      5. 8의 비트 깊이와 512 X 512 프레임 크기를 설정합니다.
      6. 측정 시간, 주파수 및주기를 설정하는 시계열 옵션을 사용한다.
        참고 : 정기적 인 측정을위한 추천 : 10 분 간격으로 1 시간 : 사이클 = 7 (사이클 1은 T = 0). 감소 된 부종, ORGA의 측정noids는 3 시간까지에 대한 이미지화 할 수 있습니다.
      7. 수동으로 개별 잘 위치를 결정하기 위해 타일 옵션을 사용합니다.
    13. 측정과 같은 순서에 따라, 해당 우물에 FSK 및 / 또는 VX-770 솔루션의 100 μl를 추가합니다. 잘 군데 처음에 솔루션을 추가 시작하고 영상 순서를 계속합니다.
    14. 측정을 시작합니다.
    15. 실험이 종료 된 후, 파일을 저장한다.
  3. FIS 분석 데이터의 분석
    1. 오버 총 organoid 면적의 증가를 계산하는 식별 구조를 알렉사 488 트랙을 묘화하는 모든 구조를 인식하고, 채우고 이미지 분석 소프트웨어 분석 도구를 사용 FIS 분석의 데이터 분석을위한 "organoid 분석"매크로 만들기 다른 시점.
    2. 이미지 분석 프로그램 취득한 이미지 데이터 파일을 연다.
    3. organoid 분석을위한 매크로를 선택합니다.
      4. <리>도 1 시점에 하나의 신호 대 잡음비를 균형 모든 organoid 구조를 인식하고 충전되도록 임계 값을 설정한다.
      1. 모든 구조도 시점 (7)로 인식하는 경우 약간 시점 (7)의 배경 신호가 (특정 임계 실험 사이에 다소 변경 될 수 있습니다) 구조로 인식되지 않도록 임계 값을 수정보고 4-6 우물에서 확인하십시오.
    4. 1000 μm의 2에 인식하고 개체의 최소 영역 크기의 기준을 설정합니다.
    5. 를 눌러 시작 "분석". 분석에 사용되는 소프트웨어에 따라, 약 3 분 소요됩니다.
    6. 웰 당 웰 번호 (표는이 순서로 증가한다) 타임 포인트, 총 면적 : 소프트웨어가 끝나면, "테이블 작성"다음 데이터를 선택 간다.
    7. 스프레드 시트 프로그램에 수출하는 .xlm으로 파일을 저장합니다.
    8. 이 프로그램에서 아 당 지역의 상대적 증가를 계산100 %의 시점 (1)의 영역을 설정하여 L. 시점 조건 당 1-7에서 곡선 (AUC) 아래의 면적을 계산하게하고; 영역 (Y 값)의 하한을 100 %로 설정된다. FSK 약물 적정 (X 축)는 AUC (Y 축)에 대해 도시된다.

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결과

도 1a는 BMM에 포함 된 지하실의 대표 신선한 격리를 보여줍니다. 지하실은 CF 제목의 대장 조직 검사에서 있습니다. 일반적으로, organoid 각 토굴 (- C 그림 1A)에서 생성됩니다. 때문에 CFTR의 기능 장애로, 대장 CF의 organoids의 대부분은 낭포 성 이라기보다는 소형 계획과 buddings (그림 2A - 2B)에 있습니다. 그러나 일부 CF는 낭포 성 모양 (그림 2C), 야생형 organoid 문화 등 (그림 2D)와 몇 organoids이 특히 높은 잔존 기능, 문화를 organoid.

배양을 확장하거나 FIS 분석을...

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토론

여기서 우리는 인간의 대장 organoids의 생성, 확장, 냉동과 해동을위한 완벽한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 인간의 organoid 문화를 몇 시간 전에 17를 설립하지만, 때로는 교육 실습없이 다른 연구소에서 기술을 확립하기 어려운 입증했다. 우리는 이러한 프로토콜은 교육을 대체 할 것으로 예상.

이 Wnt-3A 에어컨 매체 수립하고 organoid 문화 장기적인 유지에 성공하기 위해 가장 중요한 시약 중 하나입니다. 실제로, organoid 문화가 낮은 활동의 Wnt-3A-conditoned 매체에 "충돌"노출 수있는 경우. 이 Wnt-3A 에어컨 매체 내부에서 이루어지기 때문에, 활성 매체를 생성 할 때 고려되어야 여러 측면이있다. 활성의 Wnt-3A는 L 세포 및 소수성의 안정화를 위해 적절한 성장 신호를 제공하는 고품질의 소 태아 혈청 (FBS)을 매체 중에서 제조 할 수있다이 Wnt-3A 분자. 이...

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공개 사항

Hans Clevers는 오가노이드 배양 및 Forskolin 유도 부종 분석에 대한 특허에 대한 발명가입니다. Jeffrey M Beekman은 Forskolin 유발 부종 분석에 대한 특허의 발명가입니다. Sylvia F Boj와 Robert Vries는 오가노이드 기술에 대한 독점 라이선스를 보유하고 있는 Hubrecht Organoid Technology(HUB) 재단에 고용되어 있습니다. 그렇지 않으면 저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 네덜란드의 CF 재단 (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103)는 빌헬미나 아동 병원 연구 기금과 CZ, 및 Zilverenkruis / Achmea의 HIT-CF 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 S. HEIDA 미셸, M. Geerdink, KM 드 겨울 드 그루, 그리고 G. Berkers (소아 호흡기학, 빌헬미나 어린이 병원, UMC 위트레흐트학과), 및 RHJ Houwen (소아 소화기, 빌헬미나의 부서에 감사드립니다 환자 접근과 CF 바이오 뱅크의 발전을 위해 조직 검사를 얻기를위한 어린이 병원, UMC 위트레흐트).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고급 Dulbecco' s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml 써모 피셔 사이언티픽:  Invitrogen#126344°C에 보관됨; C
GlutaMax써모 피셔 사이언티픽:  Invitrogen#350504°C에 보관되었습니다. C
HepesThermo Fisher 과학:  Invitrogen# 15630-0564 °에 저장됨; C
페니실린/스트렙토마이신써모 피셔 사이언티픽:  Invitrogen#15140-122-20°C에 저장되었습니다. C
96 웰 배양 플레이트Cellstar#655180
24 웰 배양 플레이트Cellstar#662160
6 웰 배양 플레이트Cellstar#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)Life Technologies: Gibco#14190-094에 보관; C
둘베코' s 수정된 독수리 미디엄  (DMEM) 500 ml 써모 피셔 사이언티픽:  Invitrogen#31966-021Wnt-3A 컨디셔닝 배지 생산용. 4 °에 저장; C
Fetal Bovine Serum (FBS)Bovogen#SFBS LOT#11113Wnt-3A 컨디셔닝 배지 생산용. -20 °에 저장됨; C
L Wnt3A 세포주ATCC#CRL-2647Wnt-3A Conditioend 매체 생산용.
TOP/FOP 플라스미드Millipore #17-285Wnt 활성 측정용
pTK-RenillaPromega #E2241Wnt 활동 측정용
HEK-293ATCC#CRL-1573Wnt 활동 측정용
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromega #E1910Wnt 활성 Zeocin을 측정하기 위해
 써모 피셔 사이언티픽:  Invitrogen#R250-01Wnt-3A 세포주 선택
B27 보충제용 써모 피셔 사이언티픽:  Invitrogen#17504-044-20 °에 저장되었습니다. C
N-아세틸시스테인시그마 Aldrich#A9165-5G-20°C에 저장했습니다. C
니코틴아미드시그마 알드리치#N0636-20 °에 저장; C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)PrepoTech#AF-100-15-20 °에 저장; C
GastrinSigma Aldrich#G9145-20 °에 저장됨; C
TGFb 유형 I 수용체 억제제 (A83-01) Tocris#2939-20 °에 저장되었습니다. C
Y-27632 이염산염 (RhoKi)Selleckchem#S1049-20°C에 저장; C
p38 MAPK 억제제 (p38i) (SB202190)Sigma Aldrich#S7067-20 °에 저장; C
PrimocinInvivoGen#ant-pm-1-20 °에 저장되었습니다. C
Human Noggin (hNoggin)PrepoTech# 120-10C는 -20 °에 저장되었습니다. C
인간 R-spondin 3 (hRspo-3)R& D Systems#3500-RS/CF는 -20°C에 저장됨; C
VancomycinSigma Aldrich#861987- -250°에 저장되는 250mg; C
GentamycinLife Technologies: -#15710-049; C
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)시그마 알드리치# 4317884 °°C에 저장; C
MatrigelCorning#354230-80 °에 저장됨; C
TryplE 익스프레스 Life Technologies:동결을 위한 트립시니징 오가노이드를 위한#12605-010
MediumLife Technologies:동결을 위한#12648010
Life Technologies: -#C3100MP C
포스콜린R& D Systems#1099-50 mg은 -80 °에 보관됩니다. C
Lumacaftor (VX-809)Selleckchem#s1565-80 °에 저장; C
Ivacaftor (VX-770)Selleckchem#s1144-80 °에 저장;
C시약의 이름/재료용매원료 농도>최종 농도
GlutaMax200 mM2 mM
Hepes1 M10 mM
Penicillin/Streptomycin10K U/ml 10K µ g/ml100 U/ml 100 &마이크로; g/ml
제오신 100 mg/ml 125 &마이크로; g/ml
B27 보충제 100x
1x N-아세틸시스테인MiliQ H2O500 mM
니코틴아미드DPBS1 M10 mM
인간 상피 성장 인자 (hEGF)DPBS 0.1% BSA0.5 mg/ml50 ng/ml
GastrinDPBS100 µ M10 nM
TGFb 유형 I 수용체 억제제 (A83-01) DMSO5 mM500 nM
Y-27632 디하이드로클로라이드 (RhoKi)DMSO10 mM10 &마이크로; M
p38 MAPK 억제제 (p38i) (SB202190)DMSO30 mM10 &마이크로; M
프리모신50 mg/ml 100 &마이크로; g / ml
인간 Noggin (hNoggin)DPBS 0.1 % BSA100 µ g/ml100 ng/ml
인간 R-spondin 3 (hRspo-3)은 로트당 다름300 ng/ml
반코마이신10 mg/ml50 &마이크로; g/ml
겐타마이신10 mg/ml50 &마이크로; g / ml
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)MiliQ H 2 < / sub>O0.5 M2 mM
CalceinDMSO10 µ g/ml3.3 ng/ml
포스콜린DMSO10 mM변수
Lumacaftor (VX-809)DMSO20 mM변수
Ivacaftor (VX-770)DMSO20 mM변수
는 은 은 는 4°C는 는 는 은 20 °에 보관되는 Gibco 회수 세포 배양 Gibco Calcein Gibco20°C에서 보관

참고문헌

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