해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

Summary

우리는 튜브웜인 Hydroides elegans의 석회화를 관찰하고 최초의 석회화된 물질을 찾고 특성화하는 데 유용한 다양한 현미경 방법의 사용을 보여줍니다. 생체 현미경과 전자 현미경을 함께 사용하여 생체 광물화 연구에 중요한 기능 및 재료 정보를 제공합니다.

Abstract

탄산칼슘의 생물학적 생산의 첫 번째 사건을 특성화하려면 현미경 접근 방식의 조합이 필요합니다. 첫째, 세포 내 pH 분포와 칼슘 이온은 시간 경과에 따른 실시간 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 추가 전자 현미경 연구를 위해 관심 기능이 있는 수명 단계와 조직을 식별할 수 있습니다. 생애 단계와 관심 조직은 일반적으로 pH 및 Ca 신호가 더 높습니다.

여기에서는 H. elegans를 사용하여 주사 전자 현미경(SEM)의 생물학적 표본에서 탄산칼슘 구조의 존재를 특성화하고, 에너지 분산 X선 분광법(EDS)을 사용하여 원소 조성을 시각화하고, 전자 후방 산란 회절(EBSD)을 사용하여 결정 구조의 존재를 확인하고, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 물질의 구성 및 구조를 분석합니다. 이 프로토콜에서는 집속 이온 빔(FIB)을 사용하여 TEM 분석에 적합한 치수로 샘플을 분리합니다. FIB는 현장 특정적 기법이므로 이전 기법의 정보를 사용하여 Ca 신호가 가장 높은 관심 영역을 식별하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

생체 광물 형성 작용 (biomineralization)은 정교하게 정렬 ^한 무기물의 제조 결과 세포 활성 모음 브릿지 복잡한 일련의 이벤트이다. 문제는 동적 세포 프로세스 및 광학 및 전자 현미경 방법의 조합을 이용하여 복잡한 구조를 모두 무기물을 특성화한다. 세포 내 pH를 상승, 따라서, 증가 된 pH를 갖는 생활 단계를 식별하는 석회화 ^{2, 3이} 발생 될 가능성이있는 시간을 계시, _CaCO3를 결정의 형성을 선호한다.

가족 Serpulidae에서 tubeworms 바다 ⁴ 공통 calcifiers 있습니다. 그것은 특히의 생물 연료 ^{5, 6,} 또한 해양 연구를위한 인기있는 무척추 동물 모델이다. 본 연구에서는, 무기질 구획 석회화 과정 두리NG의 생체 광물 형성 작용 (biomineralization)이 관찰된다. 변형의 빠른 처리 탄산 칼슘 구조물 ^{(7, 8)의} 출현을 포함한다.

우리는 tubeworm 인에서 수행 할 수있는 방법을 내부 pH를 측정 보여, 삶의 단계 및 석회화에 대한 중요한 조직은 어떻게 선별 할 수있다. 관심의 수명 단계가 식별 된 후에, 석회화에 대한 책임이있는 조직을 전자 현미경 법을 사용하여 더 높은 해상도로 특징 지어 질 수있다. 형광 현미경을 사용하여, 우리는 변성 유도 후 나타나는 탄산 칼슘에 필요한 시간을 결정한다. 삶의 유사한 단계 이후 원소 조성 분포에 대한 SEM-EDS 가시화하고, 증착 된 무기물 개의 상이한 전자 현미경 방법, 구체적으로는 SEM-EBSD 및 FIB-TEM을 사용하여 분석 하였다.

Protocol

1. 라이프 스테이지 검사 및 라이브 영상과 관심의 조직

1. 이전에보고 된 방법 ^{6, 7, 9에} 따른 역량 배양 해양 유충. 10 μM SNARF-1 오전 하룻밤에 여과 해수와 mL의 밀도 당 5 유충에 tubeworm 인 애벌레를 품어. 광 표백제에서 형광 프로브를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮고 용기.
2. 해부 현미경을 사용하여 유충을 관찰한다. 변형에 대한 준비가 관할 tubeworm 인 유충은 순방향 대신에 원을 그리 수영됩니다.
3. 60 μm의 메쉬에 관할 유충을 전송합니다. 액체를 유지하기 위해 좋은 밀봉을 제공하는 페트리 접시에 메쉬를 누릅니다. 빠르게 유충을 유지, 해제 및 형광 염료를 포함하는 해수를 폐기 할 수있는 봉인을 해제.
4. 복용, 두 번 여과 인공 해수 (FASW)와 유충을 씻으십시오그 과정에서 애벌레를 건조하지 않도록주의.
5. 변태 과정의 관찰 ^10-4 M의 이소 부틸 (IBMX)를 포함 FASW의 5 mL의 10 얇은 유리 바닥 요리 유충 (20)에 배치합니다.
6. 그리고 애벌레의 DIC 이미지 :; SNARF-1 신호를 검출하기 위해 (예 25분의 510 엠 35분의 640 채널 2 예 25분의 510 엠 30분의 580 채널 1) 필터 큐브를 삽입합니다.
7. 살아있는 동물의 명확한 이미지가 캡처되어 있는지 확인하기 위해 셔터 시간 (100-300 밀리 초)만큼 빠르게 최적화, 다음의 20 배 목표 아래 metamorphosing 애벌레를 놓습니다.
8. 세 채널 Z 스택 캡처 1 ㎛의 거리를 설정하고, 채널들 ​​간의 더 나은 상관을 가능하게 할 Z- 방향의 다음 층으로 이동하기 전에 세 가지 채널에 대한 각각의 층을 묘화하는 살아있는 동물을 묘화 할 때.
9. 현미경 소프트웨어에서 TIF 파일로 모든 채널 및 레이어 내보내기 그레이 스케일 이미지 : 파일 | 수출 | 파일 형식 TIF | 스타트.
10. ImageJ에 사용 메신저포트 채널마다 화상 서열 파일 | 가져 오기 | 이미지 시퀀스.
    1. 채널 1 λ ₁ ^안에 가져 오려면, 이미지 3 증가를 시작 입력 : 4.
    2. 채널 2 λ ₂ ^그들을 가져 오려면, 이미지 (4) 증가를 시작 입력 : 4.
11. 픽셀 각 층 픽셀 λ ₁ ^그들에 의해 λ ₂ ^그들을 나누어 합성 이미지를 생성 (공정 | 이미지 계산기 ... | 이미지 파일 640 nm의 "분할"이미지 파일 580 ㎚), 즉 580분의 640 nm의 비율.
12. 선택 이미지 | 조회 테이블 | 16 색.
13. 분석 선택 | 도구 | 교정 바.
14. 가장 이질성을 함유하는 층을 식별, 다른 레이어를 검사합니다. 이것은 내부의 pH 분포에 대한 가장 유용한 정보를 제공합니다.
15. 580분의 640 nm의 비율과의 pH 사이의 관계를 이용하여, 내부의 pH의 분포를 시각화하는 플롯 프로파일을 구성.

2. 내부의 pH의 교정

1. 10 μM SNARF-오전 1시 약 20 애벌레의 하룻밤 염색 한 후, 50 μM의 nigericin 및 교정 150 밀리미터의 KCl을 만들기 위해 nigericin과의 KCl의 재고 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
2. 5.9 주변의 pH가 달성 될 때까지 묽은 수산화 나트륨 또는 HCl로 교정 AFSW의 pH를 조정합니다. 정확한 pH 값을합니다. 해수 기초하여 보정 된 유리 전극 pH 미터로 측정 산도 2- 아미노 -2- 히드 록시 메틸 -1,3- 프로판 디올 (트리스) 및 2- 아미노 피리딘 ^(9).
3. 640 nm의 580 nm에서 신호 강도의 측정을 위해 건조하고 깨끗한 접시에 알려진 산도와 액체와 함께 하나의 스테인드 tubeworm 인 유충을 전송합니다.
4. 반복 2.2과 5.9에서 9.9에 이르기까지 네 더 산도 점 2.3 단계를 반복합니다. 이들은 생리 관련 값들의 범위를 나타낸다.
5. 신호가 동물의 몸 전체에 균일 한 표시하기 위해 확인합니다. 이 세포 내 pH가 전자했음을 나타냅니다환경 해수 quilibrated.
6. 이미지 다섯 가지 해수의 pH 환경에서 tubeworm 인 유충, 즉, λ ₂ ^EXC 및 λ ₁ ^EXC, 640 nm에서 "회색 값"으로 580 nm에서 나타난 강도를 기록한다.

비례 영상 데이터의 3. 분석

1. 오 임의의 위치에서 또는 스프레드 시트에 대한 관심의 영역에서 측정 된 회색 값을 입력합니다.
2. 다섯 점 교정이 세포 내 산도를 나타내는 선형 관계를 보여 주었다 확인 (예를 들어, Y = 0.30x 같은 식 - 1.47, Y = 회색 값, X = 산도, R² = 0.934).
3. 단계 1.13의 측정 580분의 640 nm의 강도 비를 이용하여 식 세포 내 pH 값을 계산한다.

4. 샘플 보존, 탈수 및 전자 현미경을 위해 설치

1. 4 % 파라 포름 알데히드와 관심의 삶의 단계를 유지. 본 연구에서는,, 부착 후 tubeworms 2-4 일 해결 분석까지 정착액에 동물을 유지합니다.
2. 흄 후드에서 작업하는 탈수 과정에서의 조직의 수축을 최소화하기 위해 30 분 동안 1 % 오스뮴 테트 록 사이드 수용액 시험편 후 고정한다.
3. 5 분, 5 분, 95 % 에탄올을 5 분간, 85 % 에탄올을 5 분간, 70 % 에탄올, 50 % 에탄올을, 회 5 분간 마지막 무수 에탄올 : 채점 에탄올 시리즈 시험편 탈수.
4. 액체가 완전히 증발 할 수 있도록 시편에 에탄올과 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 1 용액 : 흄 후드에서 작업, 1을 추가합니다.
5. 흄 후드에서, 액체가 완전히 증발 할 수 있도록 표본 100 % HMDS를 추가한다.
6. 다이아몬드 나이프를 사용하여, 몇 tubeworms 주변 배양 접시 몇 컷 소개한다. 에 뚜껑, 접시를 깰 알루미늄 그루터기에 접시 바닥을 잡으십시오.
7. 해부 현미경, 손상되지 tubeworm 인을 포함하는 골절 조각을 찾아.
8. 알루미늄 그루터기에 실버 페인트를 적용하고 조심스럽게 그루터기에 조각을 고정합니다. 대전 줄일 플라스틱 조각의 에지 주위 페인트.

5. SEM-EDS를 사용하여 칼슘 풍부한 지역 찾기

1. 샘플 홀더에 시편 스텁을 고정합니다.
2. 현미경 구비 게이지에 대해 전체 조립체의 높이를 측정 시료가 기준 높이에있을 때까지 로킹 와셔를 풀고 소식을 회전시켜 높이를 조정하거나, 기록 된 높이를 입력한다.
3. 현미경 교환 챔버로 공기를 인정 오픈 챔버 도어를 스윙. 교환로드의 끝에 샘플 홀더를 밀어 넣습니다. 그리고 가까이 챔버 대피.
4. 게이트 밸브를 열고 현미경 실으로의 교환로드를 밀어 넣습니다. 완전히 현미경 단계에 샘플 홀더를 장착 할 때의 교환로드를 끝까지 밀어 넣습니다. 교환 막대를 제거하고 게이트 밸브를 닫습니다.
5. 입력 t그는 치수를 샘플링하고 전자 칼럼 아래에 샘플을 배치하는 홈 위치로 무대를 보냅니다.
6. 부사장-SEM 모드에서 20 ~ 30 파에 챔버 진공 레벨을 설정합니다. 20 kV의에 전자 가속 전압을 설정하고에 높은 전압을 설정합니다.
7. 10mm의 샘플 작동 거리 스테이지 상향한다. 라이브 피드를 획득하고 표본을 찾습니다. 점수차를 조정하여 이미지를 최적화하고 필요에 초점을 맞 춥니 다.
8. SEM을-EDS 프로그램을 열고 EDS-SEM 모드 옵션을 선택합니다. EDS가 맵을 실행할 수있는 메뉴 옵션을 선택합니다.
9. SEM-EDS 프로그램 속도 측정기를 통해 모니터로 변경 집광 렌즈와 조리개 설정 (3)의 프로세스시 ~ 30 %의 데드 타임을 달성했다. 빔 설정을 변경 한 후 빔과 조리개 정렬 절차를 실행합니다.
10. 하나의 유기체가보기의 전체 필드를 채우도록 배율을 선택합니다. 드리프트 보정 옵션을 활성화하고 SEM-EDS 프로그램에서 이미지를 캡처합니다.
11. 엄마 획득유기체가 50 ~ 100 ms의 체류 시간을 사용하여,보기의 전체 필드를 채우는 페이지의 데이터입니다. 데이터가 유기체 (약 15 분) 내에서 칼슘의 독특한 현지화가 표시 될 때까지지도를 실행합니다.
12. 포인트 - 정량화 된 데이터를 얻기 위해, 6 행의 처리 시간을 변경하고 ~ 30 %의 불감 시간을 취득하는 전자 프로브를 조정한다. 정렬 단계를 실행하고 필요에 따라 이미지를 최적화 할 수 있습니다.
13. SEM을-EDS 프로그램의 포인트와 ID 옵션을 선택하고 다른 이미지를 획득. 단일 포인트 도구를 사용하여 비교를 위해 EDS지도에 풍부한 칼슘뿐만 아니라 칼슘 결핍 영역 등장 영역을 클릭합니다. 30 s의 라이브 시간 동안 각 지점을 스캔합니다.

6. 사용 칼슘 풍부한 지역의 결정학 정보를 확인 SEM을-EBSD

1. 플랫 표본 스텁에서 관심의 플라스틱 조각 함유 시료를 제거하고 실버 전도성 접착제를 사용하여 45 ° 사전 기울어 진 그루터기의 경 사진면에 부착합니다.
2. 샘플 시간에 스텁 스크류나이 샘플 홀더의 앞쪽으로 위치 (표본)와 스텁의 각진 얼굴. 교환 챔버를 사용하여 현미경의 챔버에 샘플 홀더를 삽입한다.
3. 20 kV의 전압을 가속 챔버 (30) 아빠에 진공 전자를 설정합니다. 전자 칼럼 아래에 샘플을 보내 전자빔을 시료 표면을 정상으로부터 약 70 °를 배치하도록 스테이지 25 ° 기울. 에 높은 전압을 설정합니다.
4. ~ 18mm의 작업 거리를 무대에 올립니다. 무대를 이동하고 표본을 찾기 위해 트랙볼을 사용합니다. 관심의 특정 기능을 프레임에 배율을 높일 수 있습니다. 빔을 정렬하고 필요에 따라 이미지를 최적화 할 수 있습니다.
5. EBSD 모드에서 SEM-EDS 프로그램을 엽니 다. 관심의 단계로 선택 방해석과 아라고 나이트. 154mm의 거리에서 EBSD 카메라를 삽입합니다. 1 × 1 비닝 (binning)와 100 밀리 프레임 시간으로 카메라 조건을 설정합니다. 고속 빔 래스터를 사용하여 배경을 취득.
   참고 : 다른 프레임 속도전자 프로브에 따라 요구 될 수있다; 약 90 %의 신호를 달성하기위한 프로브 나 카메라의 프레임 레이트를 조정한다.
6. SEM을-EDS 프로그램에서 이미지를 캡처합니다. 현장 분석 도구를 사용하여 그 시점에 빔을 스캔 할 이미지 곳을 클릭합니다. 어떤 키쿠치 패턴이 발견 될 경우 확인하기 위해 카메라 창을 준수하십시오.
7. 키쿠치 밴드가 존재하는지 확인하기 위해 각 지점에서 카메라 창을 관찰하고, 잠재적 인 석회화 사이트를 스캔 할 이미지의 다른 영역을 클릭합니다. 패턴이 존재하는 데이터베이스에서 선택된 위상과 일치하는 경우, 그들은 자동적으로 인덱싱된다.

7. TEM 샘플 준비 FIB-SEM을 사용하여

1. 도전 층을 만드는 코팅을 백금 또는 유사한 재료로 제조 된 SEM 시료 스퍼터.
   1. 스퍼터 코터의 하우징으로 이전, 고정, 탈수 및 장착 된 표본을 놓고 아래로 챔버를 펌핑 시작 전원을 켭니다.
   2. 진공 챔버가 40 mTorr로 이하를 판독하면에 가스 스위치를 켜는 200 mTorr 이하의 챔버 압력에 도달하는 아르곤 가스의 유량을 증가시킨다. 80 mTorr 이하의 최종 챔버 압력을 달성하기 위해 가스 유량을 조정한다.
   3. 상기 전압 스위치를 켜고, 15 mA의 전류에 도달하는 전압을 증가시킨다. 이온 조사 손상으로부터 시료 표면을 보호하는 두꺼운 층 (~ 60 nm의)를 만들 수있는 확장 된 시간 (~ 10 분)의 타이머와 코트를 설정합니다. 안정한 15mA 전류를 유지하는 전압을 조절한다.
   4. 일단 파워 다운 진공을 해제하고 샘플을 제거하는 코터를 마쳤다.
2. 악기 샘플 홀더의 M4 나사 포스트에 코팅 샘플을 스퍼터, 제조의 기반을 조입니다. 꽉 손까지 조여 잠금 너트를 푼 다음, 어셈블리의 높이를 변경하려면 샘플 홀더 게시물을 돌립니다. 레이저 높이 게이지를 사용하여 표준 supplie 제공의 (비디오에 표시된 = 0.04 인치) 1mm 내에 있도록 높이 조절악기와 D.
3. FIB-SEM 모든 건 밸브를 닫은 다음 eucentric 무대 에어 록에 공기를 인정한다. 압력이 환경과 등화되면, 공기가 열려 잠 밀어 교환로드의 접지 단자에 샘플 홀더를 부착합니다. "잠금"위치로 교환로드의 끝 부분에있는 손잡이를 돌립니다. 공기 잠금 장치를 닫고 공기 락 챔버 대피.
4. eucentric 스테이지 에어 록은 진공 압력이 FIB-SEM 챔버의 일치 된 후, 게이트 밸브를 개방하여 교환로드에 밀어 샘플을 삽입한다. 악기 eucentric 단계에서 샘플 홀더를 장착 할 때의 교환로드를 끝까지 밀어 후 "잠금 해제"위치로 교환 막대를 회전합니다. 다시 밖으로 교환 막대 슬라이드 게이트 밸브를 닫습니다.
5. 이온 빔 열 아래 샘플의 위치를 ​​무대로 이동합니다. 게이트 밸브를 열고 FIB의 라이브 이온에 의한 이차 전자 이미지를 획득. 저배율과를 사용하여빠른 래스터 스캔은 이온의 손상을 최소화합니다. 정상 관찰 빔의 초점을 재설정하고 샘플의 초점이 될 때까지 단계의 Z 높이를 올립니다. 이때 시료는 이온 및 전자 모두에 빔이 동일한 위치에 집중된다 크로스 점 위치에있다.
6. 주사 전자 현미경으로부터 이차 전자 이미지를 사용하여, 주변의 시험편을 이동 트랙볼을 이용하여 시편에서 관심 영역을 찾아. 관심 분야는 이전에 EDS 매핑에 의해 결정 칼슘이 풍부한 영역입니다. 윈도우의 프레임 라인에 대한 관심의 기능을 얻을 필요에 따라 단계를 돌립니다.
7. FIB 창 인터페이스에서 추가로 2 배 디지털 줌 배율 1000 배 시편의 빠른 스냅 샷을 캡처하고 관심 영역에 걸쳐 ~ 8 μm의 × 2 μm의 증착 템플릿을 그립니다. 성막 상자의 배율 크기는 다양한 크기의 기능을 수용하기 위하여 조절 될 수있다. 40 kV로를 이용하여 탄소를 증착하는 스퍼터 조건을 설정5 분 동안 0.5 μS의 체류 시간을 사용하여, 0.09 nA의 빔.
8. 탄소 증착 후에, ~ 2-3 ㎛의 텅스텐 캡을 생성하기 위해 5 분 동안 40 kV로, 0.7 nA의 빔 및 입금하여 텅스텐을 증착하기 위해 증착 조건을 변경.
9. 관찰 빔을 사용하여 FIB 스냅 샷을 캡처 텅스텐 캡 주위에 네 개의 상자의 패턴을 그립니다 microsampling 스퍼터 도구를 사용합니다. 약 15 ㎛의 수 상하 박스 집합 X는 8㎛; 우측 박스 (10) ㎛의 X는 5㎛ 및 좌측 박스는 6㎛ × 5 ㎛의 또는 충분히 큰 관심의 영역을 둘러싸고있다.
   1. 40 kV로, 19 nA의 빔 50 μS 각 상자 3-4 스캔 프레임들의 지속 시간을 이용하여 절단하는 제조 조건을 수정한다. 이어서, 패턴을 제조. 보호 C 및 W 층으로 제조, 관심 영역, 후 상부, 하부 및 우측에 인접한 물질을 제거하여, 섬과 유사한 것이다.
10. SAMP를 넣어 58 ° 무대를 기울제작 : 전자 칼럼 및 이온 열을 가파른 각도로 정상 표면. FIB를 사용하여 샘플 "섬"의 뒷면을 찾아 1000 배의 배율 2-4X 디지털 줌에서 스냅 샷을 캡처합니다.
11. 그것이 눈에 보이는 곳의 맨 끝에 "섬"샘플의 뒷면의 하단에 걸쳐 ~ 15 μm의 × 2 μm의 스퍼터 패턴을 그립니다. 빔이 샘플의 하단을 절단했다 3 분 또는까지 4 nA의 빔을 이용하여 상자를 제조 "섬."
12. eucentric 단계를 (다시 제로) 현재 위치에서 -58 °를 기울이십시오. FIB 인터페이스에서 "프로브에서"링크를 클릭 텅스텐 microsampling 프로브를 삽입합니다. 무대 제어판에 "MS"를 선택하고 시편의 맨 위에 프로브를 이동하려면 트랙볼을 사용합니다.
13. 1 KX의 배율에서 FIB의 생중계를 획득 팁 직접 microsample의 텅스텐 캡의 오른쪽 위가되도록 프로브를 위치. 라이브를 관찰하면서전자 현미경에서 SE의 이미지, 접촉 텅스텐 캡까지 탐침을 낮출 스테이지 패널의 Z 조절 노브를 사용한다. 접촉이 이루어진 후에 부저가 울립니다.
14. 1000 배 및 2 배 디지털 줌 배율 : 40 kV의 0.01 nA의 빔을 사용하여 FIB를 이용하여 스냅 샷을 캡처. 그것은 microsample의 텅스텐 캡을 접촉 한 프로브의 팁을 통해 2 μm의 × 2 μm의 상자를 그립니다 증착 도구를 사용합니다.
    1. 2 분 0.5 μS의 드웰 시간, 40 kV로, 0.09 nA의 빔을 이용하여 텅스텐을 증착 조건을 설정한다. 이어서, 패턴을 제조.
15. (그것이 여전히 샘플의 부피에 연결된다) "팔"는 microsample의 좌단에 걸쳐, 2㎛ ~ × 5 ㎛의 스퍼터 패턴을 그린다. 40 kV의를 사용하여 패턴을 제작, 0.7 nA의 빔, 신호음이 microsample가 대량 샘플에서 분리되었음을 나타냅니다 2 분, 또는 때까지.
16. 첨부 microsample까지로 프로브를 마련하기 위해 Z 컨트롤 노브를 사용하여그 다음 프로브를 철회, 벌크 샘플을 지 웁니다. 홈 또는 Exchange 위치 중 하나에 eucentric 단계를 보냅니다.
17. 측면 입구 홀더에 구리 반 그리드 놓고 사이드 입구 스테이지 퍼지 챔버 내로로드 홀더. 챔버 대피 측면 항목 홀더를 삽입합니다. FIB 위치로 홀더를 설정합니다.
18. 를 눌러 스테이지 제어 패널의 측면과 FIB 모니터보기에 반 그리드를 가지고 트랙볼을 사용합니다. 반 그리드의 영역을 청소하고 초점 표면을 가져 오기 위하여 Z 노브를 사용하여 이동합니다.
19. 를 눌러 프로브에서 무대 제어판에 프로브를 눌러 MS를 삽입하고 반 그리드를 통해 microsample의 위치를 ​​트랙볼 및 Z 노브를 사용합니다. microsample 접촉 그리드 때까지 프로브를 낮 춥니 다.
20. 1000 배 확대 (2 배 줌)의 FIB에 이미지를 캡처합니다. 증착 도구를 사용하고 microsample의 하부에 걸쳐 ~ 10 μm의 × 3 μm의 패턴을 그립니다. 40 kV의 0.7 nA의 빔 예금 텅스텐, 드웰 t 사용3 분 동안 0.5 μS의 IME.
21. 스퍼터 도구를 사용하여 프로브의 팁을 통해 작은 1 ㎛ × 3 μm의 패턴을 그립니다. 거리 microsample로부터 프로브 잘라 3 ms의 체류 시간에서 40 kV의 0.7 nA의 빔을 이용하여 패턴을 제조. 한 번 무료로 프로브를 후퇴.
22. 상자 사이의 ~ 1 μm의 간격을두고, 5000 배 배율에서의 FIB 이미지를 캡처하고 microsample의 상단과 하단에 두 개의 스퍼터 패턴 7 μm의 × 4 μm의를 그립니다. microsample의 좌우 측면을 절단하지 않도록 패턴 중심. microsample의 중심을 향해 래스터 방향 설정, 2 분 동안 40 kV로, 4 나트륨 빔 3 μS의 전환 시간을 이용하여 두 패턴을 제조.
23. 5000 배의 FIB 관찰 빔을 이용하여 다른 화상을 촬영할. ~ 6.5 μm의이 × 1 μm의, ~의 간격을두고 서로 가까워 이동 이전 스퍼터 상자의 크기를 조정 0.5 μm의 및 40 kV의 0.7 nA의 빔을 사용하여 제작.
24. 사이드 진입 단계 0.5 °와 모자를 기울다른 FIB 이미지를 진짜야. 6 ㎛ 폭의 스퍼터 상자의 크기를 조정합니다. microsample의 상단 측을 통해 정상 패턴을 놓고 40 kV의 0.7 nA의 빔을 사용하여 제작. -0.5 °를 기울와 microsample의 하부 스퍼터 패턴과 바닥면 반복합니다.
25. 또 ~ 0.5 ㎛의 패턴에 의해 폭을 감소시킨다. 0.5 °를 기울여 40 kV로, 0.09 nA의 빔을 사용하여 microsample의 상단면을 스퍼터. -0.5 ° 경사에서 아래쪽으로 반복합니다.
26. 무대 2.2 °를 기울여 10000에 FIB 이미지를 획득. 5 μm의 폭에 스퍼터 패턴의 크기를 조정하고 5 kV로, 0.03 nA의에 빔 조건을 변경합니다. 오른쪽 상단 모서리까지의 microsample의 상부를 통해 상부 패턴을 배치하고, 제조. -2.2 °를 기울여 아래쪽과 바닥 패턴으로 반복합니다.
27. microsample는 전자 투명 (~ 100 nm의 두께)이 될 때까지 5 kV의 밀링 단계를 반복합니다. 일단, 가까운 gunvalves 완료 및 측면 항목 홀더를 제거합니다.

8. O투과 전자 현미경에 선정 된 지역 회절 패턴을 btaining

1. 분석을위한 장비를 준비하려면 채우기 모두 듀어는 액체 질소로 플라스크 300 kV의에 가속 전압을 설정합니다.
2. FIB를 이용하여 시료 준비 후에, FIB-SEM의 사이드 입구 홀더를 분리하고 홀더의 길이가 300 kV의 TEM의 일치하도록 핀의 위치를 ​​조정한다. 정확한 관측 위치로 상기 홀더의 팁을 회전시켜 다시 표준 TEM 홀더에 비교하여 정확한 샘플 배향을 보장한다.
   1. 또한, 표준 TEM 홀더에 FIB-SEM 홀더와 장소에서 부착 된 박편으로 반 그리드를 제거합니다.
3. TEM에의 교환 챔버로 샘플 홀더를 넣고 챔버 대피. 공기가 교환 챔버로 인정 될 때마다 악기 총 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 교환 챔버가 아래로 펌핑되면 경보 음이 울립니다. 샘플 홀더 시계 방향으로 회전하고 VACU을 허용음 최초의 정지 위치에있는 샘플 홀더를 당겨.
4. 악기 진공 복구 할 수 있도록 허용하고 총 밸브를 엽니 다. 초점을 다시 약 10000의 배율로 확대합니다.
5. 형광면의 중심으로 빔을 이동하도록 정렬 노브를 사용. 계약 및 빔을 확장하여 모든 빔 운동이 동심 있는지 확인하십시오. 필요에 따라 콘덴서 비점 수차에 대한 조정합니다.
6. 시계 반대 방향으로 샘플 홀더를 회전 진공 완전히 컬럼에 홀더를 당겨 할 수 있습니다. 탐색 및 샘플을 찾을 스테이지 이동 손잡이를 사용합니다.
7. 샘플에 배율을 증가 샘플의 초점이 될 때까지 Z-높이를 조정합니다. 필요에 따라 광학 접안 렌즈를 사용합니다.
8. 카메라를 삽입하고 형광체 화면을 제거합니다. 카메라를 oversaturating 방지하기 위해 필요에 따라 빔을 확장합니다. 초점과 카메라 매개 변수를 조정 한 후 이미지를 캡처 수집을 시작합니다.
9. 회절 패턴은 제 1 중심 취득관심있는 기능입니다. 목적 조리개를 제거하고 회절 조리개를 삽입합니다.
10. 조작부에서 DIFF 버튼으로 회절 렌즈 모드로 변경하고, 빔을 축소 할 DIFF 조절 노브를 사용한다.
11. 카메라 또는 레코딩 형광체 스크린에서 회절 패턴의 중심을 방지하기 위해 필요에 감쇠기를 삽입한다. 패턴의 이미지를 캡쳐하는 카메라의 획득을 시작한다.

Results

다음은 tubeworm 인의 변형시의 석회화 과정의 일부 관측은 다음과 같습니다. 도 1은 칼라 영역 근처의 pH 값은 변형 후 다른 조직에 비해 높다는 것을 보여준다. 그림 2I는 칼슘의 균일 한 분포, 더 큰 석회화 이벤트가 시작되지 않은 제안과 tubeworm 인을 보여줍니다; 도 2ii 관심 시점 초월 석회화 시사 장기간 석회화 한 tubeworm 인을 나타내고; 그림 2iii는 광물에 대한 책임이있는 조직을 이해하기 위해 추가 분석을 위해 선택한 관심의 석회화 단계와 tubeworm 인을 보여줍니다. 도 3은 높은 pH 값 칼 세인 염색 및 SEM-EDX 매핑 모두에서 높은 칼슘 이온 신호와 상관 관계를 나타낸다. 이러한 관찰로부터, 주목 수명 단계에서 조직을 하이에서 조사한더 현지화 된 기술, SEM-EBSD...

Discussion

라이브 광학 영상은 다세포 생물의 세포 이벤트를 관찰하는데 유용한 방법이다. 여기서, 내부 pH 및 칼슘 이온 지표 광물 부위에서의 이온 플럭스를 측정하기 위해 사용되었다. 이 지역에서는 활성 이온 펌프는 석회화 ^{2, 3을} 사용하도록 pH와 ^칼슘 농도를 상승시킬 필요합니다. 유기체 공부 형광 분자를 도포 할 때 사용되는 농도는 무시할만한 독성을 가지며, 생리적으로 적절한 방식으로 수행 유기체있게 보장하는 것이 중요하다. 하부 염색 농도를 독성이 적은 것, 통상보다 긴 시간 염색 ^(10)에 결합된다. 이 염색 기간 산소 결핍 및 폐기물의 축적을 최소화 배양 시간 동안 유충의 저농도를 유지하는 것이 중요하다.

이전 지역화를 포함하는의 FIB / TEM 방법을 추구하는관심 지역, 삶의 무대와 SEM-EDS와 SEM-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
헥사메틸디실라잔	전자 현미경 과학	16700(EM)
오스뮴 테트록사이드 2% 수용액	전자 현미경 과학	19192
IBMX 3-이소부틸-1-메틸크산틴	ThermoFisher Scientific	PHZ1124
니제리신, 유리산	ThermoFisher Scientific	N7143-5MG
35mm 직경 접시, 구멍 크기 27mm, 유리 No.0, 비코팅	ThermoFisher Scientific	D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, 아세톡시메틸 에스테르, 아세테이트	ThermoFisher Scientific	C-1271
BDH 염화칼륨, ACS 등급	VWR	BDH0258-500G
파라포름알데히드 시약 등급, 결정질	Sigma	P6148
1M 부피 분석용 염산	Wako Pure Chemical 공업 주식회사	083-01095
용적 분석용 0.05m 수산화나트륨 용액	와코 퓨어 케미컬 공업 주식회사	199-02185
칼세인	시그마	C0875
FASW	이와키 주식회사	Rei-sea Marine
Mixed Cellulose 에스테르 멤브레인; 직경 47mm, 0.45 &마이크로; m	ADVANTEC	A045A047A
에탄올	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	051-00476
DOE (1994)의 SOP06에 의한	완충
염화나트륨	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	191-01665
염화칼	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	163-03545
염화 마그네슘 육수화물	와코 순수 화학 공업	135-00165
염화 칼슘	와코 순수 화학 공업	039-00475
황산	나트륨 와코 순수 화학 공업	197-03345
염산	와코 순수 화학 공업	089-08415
2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올(트리스)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	207-06275
2-아미노피리딘	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	011-02775
Orion 5-star Plus pH meter	Thermo Scientific
PrpHecT ROSS 마이크로 조합 pH 전극 8220BNWP	Thermo Scientific
Axiovision, 버전 4.6, Axio Observer Z1	Zeiss
ImageJ	NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500	Hitachi
SU6600 VPSEM	Hitachi
NB5000 집중 이온 및 전자 빔 (FIB-SEM) 시스템	Hitachi