형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Matthew McKenzie; Sze C. Lim; Michael R. Duchen

doi:10.3791/55166

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방법 논문

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

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DOI:

10.3791/55166

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2017년 1월 24일

Matthew McKenzie¹^,² , Sze C. Lim¹ , Michael R. Duchen³

¹Centre for Genetic Diseases, Hudson Institute of Medical Research, ²The Department of Molecular and Translational Sciences, Monash University, ³Department of Physiology, University College London

이 논문에서

요약

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 ^{2 +} 세포 내 신호 전달 수 ^{(2 +} 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ _Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 ^칼슘 흡수 및 ΔΨ _분하는 방법을 설명합니다.

초록

외에도 ATP를 생성하는 자신의 중요한 역할에서, 미토콘드리아는 ^(칼슘) 단단히 세포 내 ^칼슘 농도를 조절하는 버퍼 지역 칼슘 역할을합니다. 이렇게하려면 미토콘드리아는 ^칼슘을 격리한다 그들의 내막 (ΔΨ _분)에 걸쳐 전기 잠재력을 활용합니다. 미토콘드리아에 칼슘 ^이온의 유입은 산화 적 인산화 (OXPHOS) 착체를 통해 전자 전달을 증가 시트르산 사이클의 세 속도 제한게나 제를 자극한다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ _분을 유지한다.

우리는 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 ^칼슘 흡수 및 ΔΨ의 _m 여기하는 방법을 설명합니다. 세포를 permeabilizing, 미토콘드리아 칼슘에 의해 ²⁺ 수형광 염료를 사용하여 테트라 메틸 ΔΨ _m의 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 측정을, 형광 ^칼슘 지표 FLUO-4 AM을 사용하여 측정 될 수있다. 이 시스템의 이점은 형광 염료 사이의 아주 작은 스펙트럼 오버랩 동시에 정확한 미토콘드리아의 Ca ²⁺ 및 측정 ΔΨ의 _m을 수 있다는 것이다. ^칼슘 분취의 순차 첨가를 사용하여 미토콘드리아 ^칼슘 흡수를 모니터 할 수 있으며, ^{칼슘 미토콘드리아} 막 투과성 전이 및 ΔΨ의 손실을 유도하는 농도 결정 _해요.

서론

미토콘드리아는 지역 ^칼슘 버퍼 ^1로 작용하여 세포 내 ^칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을한다. 칼슘은 ^{2 +,} 칼슘 ^{2 +} uniporter 통해 미토콘드리아 내막 (ΔΨ _분) ^2에서 존재하는 전기 화학적 구배에 의해 구동되는 과정을 미토콘드리아로 들어갑니다. 일단 미토콘드리아 매트릭스 내부, ^칼슘은 구연산 사이클 ^(3)의 세 가지 속도 제한 탈수소 효소를 자극하여 산화 적 인산화를 활성화 할 수 있습니다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ _분을 유지한다. 미토콘드리아 내의 칼슘 ^이온 농도가 매우 높아지면, 미토콘드리아 투과성 천이 ΔΨ의 _m의 손실의 결과로, 초기화 될 수 있으며, cessatio산화 적 인산화 n 및 ⁴ 경로 ^신호 세포사의 유도.

미토콘드리아는 세포 칼슘의 공간 버퍼링에서 ....