여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.
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방법 논문
공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매
이 논문에서
요약
초록
라이브 셀 이미징 동시에 안지오텐신 II (중앙 II) 자극 다음 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK) 세포에서 안지오텐신 1a 형의 (1A의 R AT) 수용체 및 세포 내 구획의 시간 경과 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. HEK 세포를 일시적으로 플라스미드 DNA 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 태그 (1A)의 R AT 함유 형질. 리소좀은 빨간색 형광 염료로 식별됩니다. 라이브 셀 이미지는 중앙 II 자극 후 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 포착 시간이 지남에 따라 세 가지 차원 (3D, 복셀)에서 소프트웨어로 분석된다. 라이브 세포 이미징 수용체 피킹으로 조사 할 수 있으며 정착과 관련된 교란을 방지하고, 특히, EGFP 태그가 막 수용체의 손실 또는 artefactual 변위. 각 셀은 시간을 추적 같이 따라서, 수용체의 세포 내 지역화 묘화하고 측정 할 수있다. 이미지는 sufficientl을 취득해야합니다Y는 빠른 속도로 빠른 소포의 움직임을 촬영합니다. 그러나, 빠른 속도로 영상을 수집 된 광자의 수는 감소된다. 절충안은 이미징 속도를 얻기 위해 같은 복셀 사이즈 촬상 파라미터의 선택에서 이루어져야한다. 라이브 세포 이미징의 중요한 응용 프로그램 이름하지만 몇 가지로 단백질 인신 매매, 이동, 증식, 세포주기, 세포 사멸, 자식 작용 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 역학을 공부한다.
서론
전반적인 목표는 수용체 작용제 치료 후 시간과 특정 세포 내 소기관과 수용체의 colocalization을의 공간에서 정량적 증거를 획득하는 것입니다. 따라서, 여기에 즉시 목표 경과 촛점 리소좀의 이미지와 인간 배아 신장 세포에서 수용체 (HEK) 정량적으로 수용체의 전달을 측정하기 위하여 3 차원의 화상 데이터를 형질 다음이어서 조립 분석 걸친 트랜스를 캡처하는 리소좀. 횡단 수용체가 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에 의해 규제되는 방법을 결정하는 데 도움이 수용체 리간드에 의해 활성화되면 세포 내 이입 동안 리소좀 또는 다른 세포 소기관이있는 횡단 수용체의 동시 인신 매매를 조사.
1A AT R 주로 HEK293 촬영 한 대부분 있지만, 모델 전지 시스템의 중앙 II로 처리 다음 리소좀 저하 될 것으로 추정된다리간드, 앙 II의 대량 리소좀 2, 3, 4, 5의 열화 상태 eptors 주로 세포막 나중에 재활용 multivesicular 재활....
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프로토콜
첫날
1. 셀 시드
- 완전한 둘 베코의 변형 이글 중간 (DMEM)을 준비합니다. 소 태아 혈청 (10 %)으로 보충 된 완전 DMEM으로 500 mL로 DMEM 450 mL의 소 태아 혈청을 50 ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 ㎖, L- 글루타민 5 mL를 추가, 페니실린 / 스트렙토 마이신 1 % 및 L- 글루타민 (1 %).
- 종자 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 통과 번호 6-11 / 50,000에서 잘 완전한 DMEM의 8 잘 챔버의 coverglass 시스템입니다.
- 24 시간 동안 5 % CO 2와 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 챔버 슬라이드를 유지한다.
둘째 날
2. 리포좀 형질
- 갓 바이오 안전성 수준이 캐비닛과 함께 멸균 조건을 사용하여 1A의 R-GFP 플라스미드 및 리포좀 솔루션 AT합니다.
- 정광을 달성하기 위해 감소 된 혈청 미디어의 178 μL 900 NG에 플라스미드 DNA의 2 μL를 희석 / μL는 원액약 10 NG / μL의 플라스미드 DNA의 이온.
- ....
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결과
이 실험의 대표 세트에, HEK 세포를 N2 및 pEGFP-13 플라스미드로 클로닝 (1A R-GFP AT) 안지오텐신 계 1A 수용체 구성 (E1,2,3-AT 1A는 R)로 형질 감염시켰다. HEK의 시간 경과 이미지 획득 및 동영상 (라이브 셀 이미징 1 라이브 셀 이미징이 동영상 참조)로 연주 하였다. 영화와 스틸 리간드 자극 후 1A AT R-EGFPs는 세포막에 주로 국부 것을 보여 주지만, 중앙 II 첨가 밝은 소체를 형성하는 2.5 분 내에 내부화 될 이들 수용체와 나중에 시간이 크다 소체에 클러스터링 핵 주변 영역 (도 4B, 5, 6A, 라이브 셀 이미징 2).
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토론
여기에 제시된 예비 실험은 24 분의 비교적 짧은 시간 과정 동안, 리소좀에 AT의 1A R-GFP의 전달에는 상당한 변화가 발생하지 않았 음을 보여줍니다. 일반적으로 리소좀에 내면화 수용체의 전달은 빠르면 15 ~ 20 분으로 발생할 수 있습니다. 이 실험은 1A의 R AT 내면화의 대부분이 큰, 핵 주변 엔도 좀을 대상으로 가설과 일치한다. R은 리소좀에 도착 1A AT 적어도 일부는 리 등에 의해 입증되었다 증거. , 중앙 II 처리 후 5 분 및 30 분에서 세포를 비교하여 30 AT 1A는 R과 램프 1 상당한 colocalization을 발견하지만 5 분 6 사람들.
이 논문은 세포 준비, 이미징 및 분석 단계에 대한 자세한 설명을 제공하고이 고급 이미징 기술에 많은 고유의 함정에 대해 설명합니다. 이 방법은 아래.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 논문에 제시된 연구 작업은 캐서린 샌드버그에 부여 R01 HL121456-01A1에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 미국의 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 P30-CA051008에 의해 자금 지원 조지 타운 대학 의료 센터에서 현미경 및 이미지 공유 자원 (MISR)에 라이카 SP8 AOBS의 가용성에 의해 추가로 지원되었다. 우리는 기꺼이 라이카 SP8 영상 피터 존슨 안내, 칼 자이스 현미경 LLC의 알마 아놀드가 제공하는 영상 지원과 조지 타운 대학의 토마스 Coate, 생물학과의 실험실에서 자이스 혈구 LSM880의 사용을 인정합니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 안지오텐신 II (Ang II) | 시그마-알드리치 | A9525 | |
| Dulbecco의 변형 독수리 매체 (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | 37 °에서 따뜻한; 사용 전 C 수조 |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | 웜 인 37 ° C 사용 전 수조 |
| 페니실린 스트렙토마이신 (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | 37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조 |
| L-글루타민 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | 37°C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조 |
| 인간 배아 신장(HEK)-293 세포 | 미국형 배양 컬렉션(ATCC) | CRL-1573 | 통로 번호 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II 챔버 1.5 독일 커버 글라스 시스템 | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 ° 씨 |
| Opti-MEM, 감소 세럼 중간 | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | 웜 37 ° 사용 전 C 수조 |
| PBS 10배 | Fisher BioReagents | BP3994 | 웜 37 ° 사용 전 C 수조 |
| Dulbecco의 Modified Eagle 매체(DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | 37°C에서 웜; 사용 전 C 수조 |
| LysoTracker Red DND-99 | 분자 프로브 -ThermoFisher Scientific | L7528 | -20 °C에서 어두운 곳에 부분 따옴표를 보관하십시오. 씨 . |
| Volocity Ver. 6.3 이미지 분석 소프트웨어 | PerkinElmer | 시각화 및 정량 분석 모듈 | 이미지 스택의 3D 이미지 분석용 |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | 이미지 수집용 |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | 이미지 수집용 |
참고문헌
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K.
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재인쇄 및 허가
