이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

6.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55183

⸱

2017년 2월 9일

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Tulane University

이 논문에서

요약

혈관 형성은 생리학적으로 관련된 환경에서 조사해야 하는 다세포, 다중 시스템 상호 작용을 포함합니다. 이 연구의 목적은 혈관 형성 중 온전한 미세혈관 네트워크의 타임 랩스 비교를 수행하는 쥐 장간막 배양 모델의 능력을 입증하는 것입니다.

초록

혈관 신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장과 같이 정의, 내피 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 면역 세포 및 림프관 및 신경과 조정을 포함한다. 멀티 셀, 멀티 시스템의 상호 작용은 생리 학적으로 관련 환경에서 혈관 신생의 조사를 필요로한다. 시험관 내 세포 배양 모델의 사용은 기계적인 통계를 제공 한 상태 즉, 일반적인 비판은 미세 혈관 네트워크와 연관된 복잡성 요점을 되풀이하지 않는다는 것이다. 이 프로토콜의 목적은 전 배양 된 쥐 장간막 조직에서 혈관 신생을 자극 한 후 그대로 미세 혈관 망의 경과 비교를 할 수있는 능력을 입증하는 것이다. 배양 된 조직은 계층 구조를 유지하는 미세 혈관 네트워크를 포함한다. 면역 표지 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 혈관과 림프관의 존재를 확인한다. 안에ddition는 BSI-렉틴과 조직을 라벨은 이전과 증가 된 모세 혈관의 발아 및 혈관 밀도를 특징으로 혈청 성장 인자의 자극 후 로컬 네트워크 영역의 시간 경과 비교를 할 수 있습니다. 일반적인 세포 배양 모델에 비해,이 방법은 생리 학적으로 관련 미세 혈관 내피 세포 네트워크의 계통 연구 및 조직 특이 적 혈관 형성 약물 평가하는 툴을 제공한다.

서론

미세 혈관 망의 성장 및 리모델링 조직 기능의 공통 분모, 상처 치유, 및 여러 병리이며 주요 공정은 기존의 1, 2에서 새로운 혈관의 성장으로 정의 혈관이다. 새로운 혈관을 엔지니어링 또는 혈관 신생에 관여하는 세포 역학의 중요성을 이해 혈관 기초 요법을 설계 조직 중요하다. 그러나이 프로세스는 복잡하다. 이것은 미세 혈관 망의 특정 위치에서 변화 여러 종류의 세포 (즉, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 대식 세포, 줄기 세포) 및 여러 시스템 (림프 네트워크, 신경 네트워크)을 포함 할 수있다. 시험관 내 혈관 신생 모델 (3)에 관련된 다른 셀들 간의 관계를 검사에 엄청난 공헌하지만, 생리 학적 관련성 파묻혀 인해 훼손 될 수있다 제한된 복잡하고 밀접 생체 시나리오를 반영하지 않는다는 사실을 r에. 이러한 한계의 3 차원 배양 시스템을 극복하기 위해 3, 생체 조직의 모델 (4), 마이크로 유체 시스템의 5, 6, 최근 개발되어 소개되었다 7 계산 모델. 그러나, 미세 혈관 손상 네트워크 생체의 혈관 신생을 조사하는 저속 기능이 모델에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 복잡성의 수준과 혈관 신생 연구를위한 새로운 시간 경과 모델의 설립은 혈관 신생을 조절하는 기본 메커니즘을 이해하는 귀중한 도구를 제공하고 치료법을 개선 할 수 있습니다.

손상되지 않은 미세 혈관 네트워크를 통해 혈관 신생의 생체 조사를 가능하게하는 잠재적 인 모델은 쥐 장간막 문화 모델> 8. 최근 연구에서, 우리는 혈액과 림프 미세 혈관 네트워크는 문화 후 가능한 남아 있음을 증명하고있다. 더 중요한 것은, 래트 장간막 배양 모델은 기능적 주연 세포 - 내피 세포 상호 작용, 혈액 및 림프관 내피 세포 연결, 저속 촬상을 조사하는데 사용될 수있다. 본 연구의 목적은 시간 경과 영상 법을위한 우리의 프로토콜을 제공하는 것이다. 우리의 대표적인 결과는 혈청과 혈관의 자극 후 생존을 유지하고 조직 특이 적 혈관 반응뿐만 아니라 내피 세포 추적 연구를 정량화이 방법을 사용 예제를 제공하는 여러 세포 유형을 문서화합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물 실험 및 절차는 튤 레인 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 수술 절차 설정

  1. 오토 클레이브 기기, 수술 소모품 및 수술 이전에 문화 용품. 각각의 쥐에 대한 외과 용품은 다음과 같습니다 : 1 드레이프, 사전 절단 구멍 1 드레이프 (0.5 X 1.5) 중앙에, 거즈 패드, 1 흡수 underpad. 수술 도구는 다음과 같습니다 숫자 10 블레이드 1 메스, 핀셋 2 쌍, 미세 가위를. 1 드레이프, 핀셋 1 쌍, 폴리 카보네이트 필터를 6 웰 플레이트 삽입을 준비 : 문화 용품 등이 있습니다.
  2. 플렉시 글라스 플랫폼 외과 단, 70 % 에탄올 외과 탁상 공간 소독. 멸균 그릇에 사용할 때까지 수술 단계를 유지합니다.
    1. 100 밀리미터 배양 접시의 중앙에 구멍에서 1 약 2 드릴링하여 수술 단계를 만듭니다. 다음, 부드럽게 사포를 사용어떤 날카로운 모서리 및 조직에 대한 제기 표면을 생성하기 위해 구멍의 가장자리에 실리콘 접착제의 레이어를 추가합니다.
    2. 대안 적으로, CAD 소프트웨어를 사용하여 수술 단계를 설계 및 3-D 인쇄 (도 1)로 만든다.
  3. 아래로 멸균 흡수 underpad를 놓고 그 위에 플렉시 글라스 플랫폼을 배치합니다. 흡수성 underpad 옆에 가열 패드에, 미리 잘라 구멍없이 드레이프를 놓습니다.
  4. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 사전 따뜻한 매체 및 37 ℃로 식염수. 다음 수술 설치에 50 ML 원뿔 튜브 가열 패드와 장소 식염수 꼭대기 별도의 배양 접시에 장소 미디어와 PBS.
  5. 모든 패키지는 모든 재료의 멸균 처리를 보장하기 위해 수술의 시작 이전에 개방되어 있는지 확인합니다. 이 절차에 사용되는 일반적인 도구의 전체 목록이 나열되어 특정 외과 재료 및 도구의 표.

2. Mesentery를 조직 수확

  1. 사용 성인 남성의 Wistar 쥐 (350 ± 25g 6 - 생후 8 주). 다른 균주와 쥐의 나이는 대체 할 수 있습니다.
  2. 케타민 (80 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏ 체중)의 근육 내 주사를 통해 쥐를 마취. 쥐가 반사 응답을 확인하기 위해 발가락 사이에 집어 마취하에 확인; 아무도이 없어야합니다. 이 단말기 절차에 대한 선제 진통제는 필요하지 않습니다.
  3. 복부를 면도와 제모 크림을 사용하여 나머지 머리를 제거합니다. 포비돈 - 요오드 다음 70 % 이소 프로필 알코올로 두 번 복부 피부를 닦아주십시오. 와이프를 들어 외과 수술 부위의 중심에서 시작해야하며, 이전에 멸균 거즈 또는 멸균 면봉 동일한 조각으로 세정 된 영역이 겹치지로서 원형 방식으로 제조 된 영역의 외부로 이동한다. 그런 다음 무균 수술 설정에 동물을 전송하고 플렉시 글라스 작은지면 위에 배치형태.
  4. 흉골 아래에서 일을 시작 장내에서 1.25 절개에 - 메스 블레이드를 사용하여, 0.75에서합니다. 창자 또는 장간막 (피부 1 층, 결합 조직의 1 층 및 근육의 1 층)에 구멍 않도록주의하십시오.
  5. 절개를 통해 사전 컷 구멍이있는 드레이프를 놓고 드레이프 위에 무균 수술 단계를 배치합니다. 절개와 열 정렬합니다 확인하십시오. 찾아 수술 단계의 개구부를 통해 회장을 끌어 멸균 면봉 어플리케이터를 사용합니다.
  6. 면봉 어플리케이터를 사용하여 스테이지를 통해 8 장간막 창 및 창 (그림 1)을 만지지 않도록주의 - 6 당깁니다. 조직은 일반적으로 맹장 근처부터 소장 회장 영역으로부터 수확된다. 솔루션을 물방울에 멸균 주사기를 사용하여 필요에 따라 가온 멸균 생리 식염수와 습기에 노출 조직을 유지합니다.
  7. 펜토 바르 비탈 나트륨의 심장 내 주사를 통해 쥐 (쥐 당 0.2 ml)에 안락사. 저를 제거하기 전에senteric 창, 쥐가 마음을 palpating에 의해 안락사되어 있는지 확인합니다; 맥박이 없어야합니다.
  8. 창을 절단하는 지방 패드 및 미세 가위를 잡기 위해 핀셋을 사용하여 원하는 장간막 조직을 제거합니다. 창 주위에 지방 (2mm)의 테두리를 남겨주세요. 미디어에 한 번 따뜻하게 멸균 PBS에 한 번 조직을 씻으십시오.
  9. 복강에 표면화 회장을 돌아 제도적 지침에 따라 동물 폐기하십시오.

타임 랩스 연구 3. 장간막 조직 문화

  1. 멸균 층류 후드로 전송 멸균 문화 용품 (1.1 절 참조) 조직.
  2. 폴리 카보네이트 필터 멤브레인 위에 각 조직을 전송하는 핀셋을 사용합니다. 지방 패드로 잡아 조직은 혈관의 손상을 방지합니다.
  3. 빠르게 창을 만지지 않도록 조심하면서, 지방 패드를 사용하여 조직을 확산. 6 웰 플레이트의 바닥에 티슈로 삽입 전환과 미디어의 3 ㎖ (그림 1 커버 ). 이 절차에 사용되는 일반 용지 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 (PenStrep) 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 가진 최소 필수 매체 (MEM)를 포함한다. 미디어 혈관 형성을 자극하는 다른 혈청 및 / 또는 성장 인자를 보충 할 수있다.
  4. 최대 5 일 동안 표준 보육 환경의 각 조직과 문화 (5 % CO 2, 37 ° C) 3.3 - 반복 3.2 단계를 반복합니다.

장간막 조직 4. 타임 랩스 영상

  1. 촬상 당일 공액 BSI 렉틴과 각 웰에 용지를 보충하고, 30 분 동안 표준 배양 조건 하에서 배양한다. 렉틴이없는 미디어로 두 번 조직을 씻으십시오. BSI-렉틴의 얼룩은 문화에서 최대 3 일 동안 장간막 조직에 계속 표시됩니다.
  2. 현미경 스테이지에 접시를 전송합니다. 자신의 형태와 네트워크 구조를 기반으로 혈액과 림프 혈관을 확인합니다.
  3. 각 조직에서 원하는 네트워크 영역을 찾아 이미지를 가져 가라. 이미징에주의하십시오같은 지역을 보장하기 위해 위치 이후의 이미지 캡처됩니다. 전동 무대를 사용하는 경우, 좌표를 문서화합니다.
  4. 인큐베이터에 조직을 돌려 원하는 끝 지점까지 문화를 계속합니다. 반복 4.1 단계 - 4.3 원하는 실험 시점에 따라 필요.

5. 조직 Immunolabeling

  1. BSI-렉틴 라벨
    1. 미디어 두 린스 다음 미디어 1시 40분 FITC - 복합 렉틴 (6 웰 플레이트에 웰 당 2.5 mL의 항체 용액) 37 ° C에서 30 분 동안 조직을 품어. 린스를 들어, 미디어를 추가 한 다음 즉시 교체하십시오.
  2. 라이브 / 죽은 라벨링
    1. 1 37 ° C에서 10 분 동안 조직을 품어 : 500 2 MM의 에티 디움 호모 다이머-1 및 1 : 미디어 두 린스 다음 미디어 500 1 ㎜의 칼 세인의 AM (6 웰 플레이트에 웰 당 2.5 mL의 항체 용액).
  3. BSI-렉틴 / NG2 라벨
    1. 현미경에 확산 조직 하락전자 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    2. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    3. 100 토끼 폴리 클로 날 항체 NG2 5 % 정상 염소 혈청 (NGS) 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직을 배양한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    4. 이차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : 100 염소 항 - 토끼 항체 CY2 공역 (GAR-CY2) 5 %를 NGS. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    5. PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어. 린스를 들어, PBS를 추가 한 다음 즉시 교체하십시오.
    6. 슬라이드를 마운트하려면, 위에 50:50 PBS와 조직과 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 커버. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.
  4. LYVE-1 / PECAM 라벨
    1. 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    2. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    3. 200 마우스 모노클 비오틴 CD31 항체와 1 : 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 (100) 토끼 폴리 클로 날 LYVE-1 항체를 PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) + 5 % NGS . PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    4. 500 CY3 접합 스트렙 타비 딘 항체 및 1 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100-GAR CY2 차 항체의 표지의 경우, 1 일 실온에서 시간 동안 조직을 배양한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    5. 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 슬라이드, 커버 조직을 탑재하고 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.
  5. BrdU의 / BSI-렉틴 라벨링
    1. 미디어에 1 ㎎ / ㎖ BrdU의 추가 및 BrdU의 솔루션으로 조직 미디어를 교체합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 품어.
    2. 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    3. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    4. 37 ° C에서 1 시간 동안 2 M 염산으로 조직 DNA 변성. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)에 조직을 씻으십시오.
    5. PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 모노클로 날 마우스 항 BrdU의 : 차 항체의 표지의 경우, (1)과 실온에서 1 시간 동안 조직을 배양한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    6. 이차 항체 라벨링 1 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : 100 염소 항 - 마우스 Cy3가 접합 된 항체를 PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS의 (GAM-Cy3에 참조). PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
      7. PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어.
    7. 상단에 슬라이드, 커버 조직 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 마운트합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.
  6. BSI-렉틴 / CD11b를 라벨링
    1. 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    2. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    3. 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 마우스 항 래트는 CD11b. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    4. 이차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 GAM-Cy3에. PBS로 조직을 씻으십시오+ 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분).
    5. PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어.
    6. 상단에 슬라이드, 커버 조직 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 마운트합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

문화 3 일 후, 조직은 쥐 장간막 문화 모델 (그림 2A)의 미세 혈관의 가능성을 입증하는 라이브 / 죽은 생존 / 세포 독성 키트와 함께 표시 하였다. 장간막에 존재하는 세포의 대부분은 미세 혈관 내피 세포에서 세그먼트의 위치에 기초하여 식별 된 배양 가능한 남았다. 내피 세포의 증식은 렉틴 / BrdU의 라벨링 (도 2D)에 의하여 확인 하였다. 따라서 혈관 평활근 세포와 주연 세포 존재 NG2 라벨링 (도 2B)로 확인되었다. LYVE1 및 PECAM에 대한 라벨링은 림프 및 혈액 미세 혈관 네트워크를 분기 파악하고 혈액 내피 세포 표현형 (그림 2C) 대 림프 유지 확인했다.

이 모델의 시간 경과 기능은 microv...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 프로토콜은 미세 혈관 망 성장 저속 촬상 용 생체 도구 래트 장간막 배양 모델을 사용하는 방법을 설명합니다. 우리 실험실에서 이전 작업은 1 우리의 모델) 혈관 신생 (8), 2) 림프관 8, 3) 주연 세포 - 내피 세포 상호 작용 8, 4) 항 혈관 약물 검사 (9)의 사용을 설립했다. 여러 시점에서 배양 된 쥐 장간막 조직을 이미징 능력은 조직 - 특이 적 성장 반응과 여러 가지 혈관 신생 자극 중에 세포 - 세포 상호 작용의 추적을 평가하기위한 정량적 인 분석을 제공한다. 혈관 신생 동안에 내피 세포의 증가 된 증식 및 혈관 주위 세포의 존재는 이전 연구와 일치 8 배양 래트 장간막 조직에서 혈관 신생 동안 여러 종류의 세포들 사이의 동적 상호 작용을 확인.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 5-P20GM103629 to WLM과 Tulane Center for Aging의 지원을 받았습니다. 프로토콜 텍스트 편집에 도움을 주신 Matthew Nice에게 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
드레이프카디널 헬스401212 "x 12" Bio-Shield 정기 살균 랩
메스 핸들Roboz 수술 기구RS-9843메스 핸들, #3; 고체; 4" 길이
멸균 수술용 칼날신시내티 외과0110스테인리스 스틸; 크기 10
배양 접시 (60mm)Thermo Scientific130181 10 / 슬리브
Graefe 집게 (곡선 핀셋)Roboz 수술RS-5135마이크로 해부 집게; 톱니 모양의; 약간의 곡선; 0.8mm 팁 너비; 4" 길이
Graefe Forcep (직선 핀셋)Roboz 수술 기구RS-5130마이크로 해부 집게; 톱니 모양, 직선; 0.8mm 팁 너비; 4 "길이
Noyes 마이크로 가위Roboz 수술RS-5677Noyes 마이크로 해부 스프링 가위;
곧고 날카롭고 뭉툭한 점; 13mm 절삭날; 0.25 mm 팁 너비, 4 1/2" 전체 길이
거즈 패드FisherBrand13-761-52비멸균 면 거즈 스폰지; 4" x 4" 12-Ply
면-팁 애플리케이터FisherBrand23-400-1246" 길이; 나무로 되는 갱구; 일회용으로만
사용 가능한 6-웰 플레이트Fisher Scientific08-772-49저증발 뚜껑이 있는 평평한 바닥; 폴리스 티 렌; 비발열성
멸균 주사기 5mLFisher Scientific14-829-45Luer-Lok 팁
멸균 그릇Medical Action Industries Inc.0123232온스 필 파우치; 파랑; 멸균 일회용
6웰 플레이트 인서트(CellCrown 인서트)SIGMAZ681792-3EA6웰 플레이트 인서트; 비멸균
폴리카보네이트 필터 멤브레인SIGMATMTP04700Isopore 멤브레인 필터; 폴 리 탄산염; 친수성; 5.0  &마이크로; 남, 47  mm, White Plain
NameCompany카탈로그 번호Comments/Description
BeuthanasiaSchering-Plough Animal Health Corp. Union (MWI Veterinary Supply에서 주문)MWI #: 011168활성 성분: 100 mL당, 390 mg 펜토바르비탈 나트륨, 50 mg 페니토인 나트륨 
케타민포트 닷지 동물 건강 (MWI 수의학 공급에서 주문)MWI # : 000680Kateset 100 mg / mL
XylazineLLOYD. Inc. (MWI 수의학 공급에서 주문)MWI # : 000680Anased 100 mg / mL
식염수박스터2F7122
PBSInvitrogen14040-133
MEMInvitrogen11095080
PenStrepInvitrogen15140-122
FBSInvitrogen16000-044
BSAJackson ImmunoResearch001-000-162
사포닌 SIGMAS7900-100G
이소프로필 알코올Fisher ScientificS25372
포비돈-요오드피연산자82-226
염산SIGMA320331
메탄올Fisher Scientific67-56-1
글리세롤Fisher Scientific56-81-5
FITC-접합 LectinSIGMAL9381-2MG
Anti-NG2 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 항체SIGMAAB5320
PECAM (CD31) 항체BD Biosciences555026
LYVE-1 항체AngioBio Co.11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated AntibodyJackson ImmunoResearch111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated AntibodyJackson ImmunoResearch115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated AntibodyJackson ImmunoResearch016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity KitInvitrogenL3224
일반 염소 세럼 Jackson ImmunoResearch005-000-121
5-Bromo-2'-DeoxyuridineSIGMAB5002
단클론 마우스 항-브로모데옥시우리딘                                              클론 Bu20aDakoM074401-8
마우스 안티-랫 CD11b AbD 세로텍MCA275R
기구 기구

참고문헌

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582(2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108(2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7(2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

BSI
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.