방법 논문

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

DOI:

10.3791/55191

⸱

2017년 1월 14일

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

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B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.

초록

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엡스타인 바 바이러스에 의한 B 림프구를 in vitro에서 불멸의 세포주로 변형시키는 방법에는 여러 가지가 있습니다. B-LCL의 확립을 위한 강력하고 간단한 전략으로 적혈구 용해법인 새로운 방법을 개발했습니다. 이 방법은 적혈구 제거를 통한 PBMC 분리 절차를 단순화하고, 100%의 성공률로 비교적 짧은 시간 내에 많은 수의 세포로 증식할 수 있는 EBV 불멸 세포주를 확립하기 위해 최소 0.5mL의 전혈을 사용했습니다. 이 방법은 간단하고 신뢰할 수 있으며 시간을 절약하며 많은 수의 임상 샘플을 처리하는 데 적용할 수 있습니다.

서론

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휴지 B 세포는 in vitro에서 Epstein-Barr 바이러스(EBV)에 의해 활발하게 증식하는 B 림프구 세포주(B-LCL)로 형질전환될 수 있습니다. B-LCL은 분화 및 발달 과정에서 생식 세포와 유사하며, B-LCL의 체세포 돌연변이 비율은 0.3%1에 불과하여 유전적 및 표현형 변화는 무시할 수 있는 수준이었습니다. 따라서 말초혈액단핵세포(PBMC)의 대리물인 B-LCL은 EBV 관련 질병에 대한 유전체학, 전사체학 및 단백질체학 연구의 진행을 실질적으로 가속화했습니다2,3. 또한, B-LCL은 단클론 항체를 스크리닝하는 데에도 중요한 응용력을 가지고 있습니다4,5.

EBV에 의한 B 림프구의 불멸화를 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 가장 일반적인 시술로는 B 림프구를 분리하고 B95-8 세포주를 사용하여 전염성 EBV를 생성하는 것입니다. 격리에서 변환에 이르기까지 이러한 방법은 세 가지 전략으로 나뉩니다. 림프구는 밀도 구배 원심분리와 EBV 형질전환에 의해 신선한 혈액에서 분리되며, 이 연구에서는 밀도 구배 분리 방법이라고 합니다6-8. 그러나 다른 기술은 신선한 혈액 운송의 어려움을 극복하고 정제된 림프구를 동결하고 후속 해동 및 EBV 감염9-11을 수행하는 절차를 사용합니다. 냉동 보존된 전혈은 B 림프구의 분리 및 형질전환에도 사용할 수 있습니다12,13. B 림프구를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 외에도 일부 연구자들은 자기 세포 분류기를 사용하여 B 림프구를 선택합니다12. 그러나 자기 분리는 비용이 많이 들고 복잡하며 시간이 많이 소요되는 과정입니다. 이러한 방법은 높은 성공률로 B 림프구를 불멸화하는 데 유용하지만, 많은 수의 임상 샘플을 처리해야 하고 혈액 양이 상대적으로 적기 때문에 영구적인 세포주를 확립하기 위한 더 간단한 방법이 필요합니다.

덜 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 EBV 감염 및 B-LCL 확립을 위한 핵 세포의 공급원으로 전혈을 사용하는 것입니다. 이러한 방법은 분리 절차를 생략하여 기술을 단순화합니다. 신선한 14 또는 냉동15,16의 소량의 전혈만이 세포주를 얻기에 충분합니다. 불행히도, 문서15,16 및 몇 가지 검증 테스트의 성공 여부에는 큰 차이가 있습니다. 더욱이, 변형된 군체는 큰 오염 불순물 때문에 현미경으로 거의 인식되지 않습니다. 따라서 보다 신뢰할 수 있는 변환 방법이 필요합니다.

위의 고려 사항을 바탕으로 당사는 림프구의 사전 정제 없이 B-LCL을 확립하는 새로운 방법을 개발했으며, 이를 적혈구 용해법이라고 명명했습니다. 이 방법은 편리하고 시간을 절약하며 많은 수의 샘플에 적용할 수 있습니다. 0.5mL의 전혈만으로도 B-LCL을 얻을 수 있었고, 이는 유아와 노인의 건강에 큰 해를 끼치지 않고 쉽게 얻을 수 있었습니다.

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프로토콜

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이 연구는 유전학과 발달 생물학 연구소의 윤리위원회의 승인을하고, 프로토콜은 인간의 복지를위한 제도적 지침을 따른다.

EB 바이러스의 제조 1

  1. 1 일에, 6 mL의 B95-8 세포 배양 해동 완전 RPMI 1640 매체, 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 항생제 (100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 U / ㎖ 페니실린)이 보충 T25 문화 플라스크. 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 배양 플라스크를 놓습니다.
  2. 제 2 일에, 현미경으로 세포의 형태를 관찰한다. 그들은 밝고 라운드 때 세포는 좋은 상태를 유지하고 있습니다. 10 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다.
  3. 하루에 4 일, 10 mL의 신선한 완전한 RPMI 1640 배지를 추가 한 다음 T75 문화 플라스크에 전송할 수 있습니다.
  4. 하루 8 일, 20 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다.
  5. 즉, 새로운 배지, 기아를 추가하지 않고 팔일의 세포를 유지한다.
  6. 날 16 일, 세포를 관찰현미경으로 관찰 하였다. 15 mL의 원심 분리 튜브, 12 ㎖ / 튜브에 세포를 수집한다.
  7. 1 시간 동안 -80 ℃에서 냉동 보존은-하고 빠르게 37 ℃에서 해동. 바이러스 입자가 세포로부터 해제 될 때까지 3 번 반복합니다.
  8. 실온에서 10 분 동안 240 × g으로 원심 분리기.
  9. -80 ° C에서 0.22 μm의 필터, 나누어지는 12 ㎖ / 튜브 및 저장소를 통해 뜨는을 필터링합니다.

적혈구 용해 버퍼와 전혈 2. 치료

  1. 15 ㎖의 튜브에 EDTA · K 2 항 응고 0.5 mL의 전혈을 추가합니다.
  2. 전혈에 (사용 전 0.22 μm의 필터로 여과하고, 실온에서 해동 된) 1 mL의 적혈구 용해 완충액을 넣어 잘 섞는다. 4 분 동안 실온에서 혼합물을 놓는다. 정지 반응에 신속 7 ㎖의 1X PBS - 그럼 5를 추가합니다.
  3. 실온에서 5 분 동안 240 × g으로 원심 분리기. 백혈구는 튜브의 바닥에 침전된다.
  4. 상층 액을 버리고, 7 mL의 1640 기본 배지를 추가하여 침전을 씻는다. 실온에서 240 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. 두 번 반복합니다.
  5. (20 % 소 태아 혈청 및 10 μg의 / ㎖의 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)를 함유하는 RPMI 1640 배지) 300 μL 변환 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.

3. EBV 감염

  1. 세포 현탁액에 20 μg의 / ML의 시클로 스포린 A의 60 μL (CSA)를 추가합니다.
  2. 빠르게 37 ° C에서 EBV의 나누어지는을 녹여. 세포 현탁액 240 μL EBV를 추가합니다.
  3. 잘 혼합하고 잘 당 96 웰 플레이트에 200 μL를 세포 현탁액을 배치합니다. 증발을 방지 96 웰 플레이트의 주위에 모든 웰에 200 μL 1X PBS를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.

B-LCLS 4. 확장 및 냉동 보존

  1. EBV 감염 후 첫 달 동안 일주일에 한 번 매체의 절반을 변경합니다. 만 두꺼운 라예세포 조각의 r은 7 일 (그림 2)에서 현미경으로 볼 수 있습니다. EBV 감염 한 달 후에 임파 세포 클러스터는 현미경 (도 2)하에 세포 단편의 두꺼운 층 아래에 표시된다.
  2. 셀 클러스터는 누가 뭐라고해도 현미경 (그림 2)에서 볼 수 있습니다 때까지 3 일마다 배지의 절반을 변경합니다. 일반적으로이 과정은 10 ~ 20 일이 소요됩니다.
  3. 혼합 후, 세포를 피펫 팅하고 24 웰 플레이트에 옮긴다. 이 노란색으로 변하면서 완전한 RPMI 1640 배양액의 양을 두 배로. 이 과정은 세포의 성장 속도에 의존한다.
  4. 이어서, T25 배양 용 플라스크에 세포를 옮긴다. 15ml의 - 매체의 부피가 10로 확장 전까지는 노랑색으로 배양액 부피를 두배.
  5. 동결하기 전에 매체 24 시간을 변경합니다. 240 × g에서 5 분 동안 원심 분리기 세포 현탁액. FR 10 × 106 / ㎖ - (5)의 농도로 세포 계수기와 함께 동결 세포 개수90 % FBS와 10 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)를 함유하기 Ozen 원액. -80 ° C에 분당 1 ℃의 속도로 고정 후 액체 질소에 직접 전송합니다.

5. 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석 17

  1. 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지 1640와 B-LCLS 단일 세포 현탁액을 제조. 잘 위에 96 웰 플레이트 당 종자 3 × 104 세포, 잘 당 100 μL.
  2. 16 시간 - 12 37 ° C에서 CO 2 배양기 5 %에서 접시를 놓습니다.
  3. 세포가 성장하는 우물에 MTT (5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 37 ℃에서 4 시간 동안 빛에 가까이하지 말 것.
  4. 168 × g으로 10 분 동안 원심 분리기 세포 판.
  5. 상층 액을 제거하고 잘 당 100 μL DMSO를 추가합니다.
    참고 :주의해야합니다. 바늘 모양의 염료 결정을 만지지 마십시오.
  6. 완전 결정을 용해 저속으로 10 분 동안 플레이트를 흔들어.
  7. 570 nm의에 의해에서 측정 흡수마이크로 플레이트 분광 광도계.

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결과

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변형 과정에서, 세포의 형태 학적 변화는 광학 현미경 (도 2)에 의해 가시화된다. 세포 파편의 두꺼운 층은 적혈구 세포 용해 방법에서 볼 수있는 반면 작은 셀 클러스터는 감염 후 7 일 후, 밀도 구배 분리법 명확하게 볼 수 있었다. 그러나, 임파 세포 클러스터는 30 일 게시물 감염 세포의 단편의 두꺼운 층 아래에 ​​표시된다. 더 자주 변화 매체로, 세포 파편 감소 셀 클러스터는 선명하게 보이는지 및 밀도 구배 분리법에 의해 설립 된 동일한 이미지를 제시한다.

세포주가 성공적으로 확립 된 경우, MTT 분석은 B-LCLS의 실행 가능성을 평가하기 위해 사용되었다. 문헌 17에 따르면, 다른 방법에 의해 확립 된 B-LCLS은 세포 생존 및 (16)을 검출하도록 선택되었다40 배지 블랭크 대조군으로 사용 하...

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토론

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우리는 적혈구 용균 전혈로부터 인간 B 세포를 불멸화하기위한 새로운 방법의 개발을보고하고, B-LCLS은 MTT 분석법으로 평가 하였다 설정된 그것의 세포 생존. 결과 적혈구의 용해 방법에 의해 확립 된 B-LCLS의 세포 생존율은 밀도 구배 분리 방법보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 적혈구 용해 방법의 주요 장점은 간단하고 높은 성공률과 높은 세포 생존과 영구 세포주를 확립하기위한 혈액 (0.5ml를 적게는) 소량을 필요로한다는 것이다.

오직 하나의 간단한 용해 공정 EBV 감염 전에 필요하다. 림프구의 이전 정제하지 않고, 세포 손실 및 세포 손상을 피할 수있다. 밀도 구배 분리 방법의 또 다른 장애물은 용혈이다. 어, 부적절한 온도에서 장기간 보관 후 혈액을 처리하고 운반시 진동은 용혈 될 수 있습니다무형 문화 유산은 크게 림프구의 분리에 영향을 미칠 것이다. 다른 연구는 적혈구 (RBC) 용해의 사용이 (18)와 림프구 아형은 대략 19...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 중국과학원(CZBZX-1)의 전략적 생물 자원 기술 지원 시스템인 중국과학원(KFZD-SW-205)의 주요 프로젝트의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
원심분리기TechcompCT6T원심분리
자동 세포 카운터 카운트스타  IC 1000 세포 계수용 
Epoch Microplate 분광광도계BioTek InstrumentsSN263839흡광도 96
웰 세포 배양 클러스터측정을 위해 Corning Incorporated3599폴리스티렌 플레이트
24 웰 세포 배양 클러스터Corning Incorporated3524폴리스티렌 플레이트
25 cm2 세포 배양 플라스크Nest707001폴리스티렌& 주의;
FBSGibco10270B-LCL 중간
RPMI 중간 1640Gibco31800-022B-LCL 중간
L-글루타민의 구성 요소   Amresco0374B-LCLs 중간
100x 스트렙토마이신 페니실린 용액의 구성 요소 BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309B-LCLs 중간
Ficoll paque plus  헬스케어17-1440-03림프구 in vitro 분리를 위해
PHA-MSigmaL8902림프구 증식을 자극하기 위해
Cyclosporin ACayman  화학물질 12088T 세포의 세포 독성 효과를 억제하기 위해
적혈구 용해 완충액TiangenRT122-01적혈구 용해 MTT
Amresco0793세포 생존 능력 검출 DMSO
SigmaD2650동결 세포 용
GE의 구성 요소

참고문헌

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