B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.
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이 논문에서
요약
초록
엡스타인 바 바이러스에 의한 B 림프구를 in vitro에서 불멸의 세포주로 변형시키는 방법에는 여러 가지가 있습니다. B-LCL의 확립을 위한 강력하고 간단한 전략으로 적혈구 용해법인 새로운 방법을 개발했습니다. 이 방법은 적혈구 제거를 통한 PBMC 분리 절차를 단순화하고, 100%의 성공률로 비교적 짧은 시간 내에 많은 수의 세포로 증식할 수 있는 EBV 불멸 세포주를 확립하기 위해 최소 0.5mL의 전혈을 사용했습니다. 이 방법은 간단하고 신뢰할 수 있으며 시간을 절약하며 많은 수의 임상 샘플을 처리하는 데 적용할 수 있습니다.
서론
휴지 B 세포는 in vitro에서 Epstein-Barr 바이러스(EBV)에 의해 활발하게 증식하는 B 림프구 세포주(B-LCL)로 형질전환될 수 있습니다. B-LCL은 분화 및 발달 과정에서 생식 세포와 유사하며, B-LCL의 체세포 돌연변이 비율은 0.3%1에 불과하여 유전적 및 표현형 변화는 무시할 수 있는 수준이었습니다. 따라서 말초혈액단핵세포(PBMC)의 대리물인 B-LCL은 EBV 관련 질병에 대한 유전체학, 전사체학 및 단백질체학 연구의 진행을 실질적으로 가속화했습니다2,3. 또한, B-LCL은 단클론 항체를 스크리닝하는 데에도 중요한 응용력을 가지고 있습니다4,5.
EBV에 의한 B 림프구의 불멸화를 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 가장 일반적인 시술로는 B 림프구를 분리하고 B95-8 세포주를 사용하여 전염성 EBV를 생성하는 것입니다. 격리에서 변환에 이르기까지 이러한 방법은 세 가지 전략으로 나뉩니다. 림프구는 밀도 구배 원심분리와 EBV 형질전환에 의해 신선한 혈액에서 분리되며, 이 연구에서는 밀도 구배 분리 방법이라고 합니다6-8. 그러나 다른 기술은 신선한 혈액 운송의 어려움을 극복하고 정제된 림프구를 동결하고 후속....
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프로토콜
이 연구는 유전학과 발달 생물학 연구소의 윤리위원회의 승인을하고, 프로토콜은 인간의 복지를위한 제도적 지침을 따른다.
EB 바이러스의 제조 1
- 1 일에, 6 mL의 B95-8 세포 배양 해동 완전 RPMI 1640 매체, 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 항생제 (100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 U / ㎖ 페니실린)이 보충 T25 문화 플라스크. 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 배양 플라스크를 놓습니다.
- 제 2 일에, 현미경으로 세포의 형태를 관찰한다. 그들은 밝고 라운드 때 세포는 좋은 상태를 유지하고 있습니다. 10 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다.
- 하루에 4 일, 10 mL의 신선한 완전한 RPMI 1640 배지를 추가 한 다음 T75 문화 플라스크에 전송할 수 있습니다.
- 하루 8 일, 20 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다.
- 즉, 새로운 배지, 기아를 추가하지 않고 팔일의 세포를 유지한다.
- 날 16 일, 세포를 관찰현미경으로 관찰 하였다. 15 mL의 원심 분리 튜브, 12 ㎖ / 튜브에 세포를 수집한다.
- 1 시간 동안 -80 ℃에서 ....
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결과
변형 과정에서, 세포의 형태 학적 변화는 광학 현미경 (도 2)에 의해 가시화된다. 세포 파편의 두꺼운 층은 적혈구 세포 용해 방법에서 볼 수있는 반면 작은 셀 클러스터는 감염 후 7 일 후, 밀도 구배 분리법 명확하게 볼 수 있었다. 그러나, 임파 세포 클러스터는 30 일 게시물 감염 세포의 단편의 두꺼운 층 아래에 표시된다. 더 자주 변화 매체로, 세포 파편 감소 셀 클러스터는 선명하게 보이는지 및 밀도 구배 분리법에 의해 설립 된 동일한 이미지를 제시한다.
세포주가 성공적으로 확립 된 경우, MTT 분석은 B-LCLS의 실행 가능성을 평가하기 위해 사용되었다. 문헌 17에 따르면, 다른 방법에 의해 확립 된 B-LCLS은 세포 생존 및 (16)을 검출하도록 선택되었다40 배지 블랭크 대조군으로 사용 하.......
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토론
우리는 적혈구 용균 전혈로부터 인간 B 세포를 불멸화하기위한 새로운 방법의 개발을보고하고, B-LCLS은 MTT 분석법으로 평가 하였다 설정된 그것의 세포 생존. 결과 적혈구의 용해 방법에 의해 확립 된 B-LCLS의 세포 생존율은 밀도 구배 분리 방법보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 적혈구 용해 방법의 주요 장점은 간단하고 높은 성공률과 높은 세포 생존과 영구 세포주를 확립하기위한 혈액 (0.5ml를 적게는) 소량을 필요로한다는 것이다.
오직 하나의 간단한 용해 공정 EBV 감염 전에 필요하다. 림프구의 이전 정제하지 않고, 세포 손실 및 세포 손상을 피할 수있다. 밀도 구배 분리 방법의 또 다른 장애물은 용혈이다. 어, 부적절한 온도에서 장기간 보관 후 혈액을 처리하고 운반시 진동은 용혈 될 수 있습니다무형 문화 유산은 크게 림프구의 분리에 영향을 미칠 것이다. 다른 연구는 적혈구 (RBC) 용해의 사용이 (18)와 림프구 아형은 대략 19.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 중국과학원(CZBZX-1)의 전략적 생물 자원 기술 지원 시스템인 중국과학원(KFZD-SW-205)의 주요 프로젝트의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 원심분리기 | Techcomp | CT6T | 원심분리 |
| 자동 세포 카운터 | 카운트스타 | IC 1000 | 세포 계수용 |
| Epoch Microplate 분광광도계 | BioTek Instruments | SN263839 | 흡광도 96 |
| 웰 세포 배양 클러스터 | 측정을 위해 Corning Incorporated | 3599 | 폴리스티렌 플레이트 |
| 24 웰 세포 배양 클러스터 | Corning Incorporated | 3524 | 폴리스티렌 플레이트 |
| 25 cm2 세포 배양 플라스크 | Nest | 707001 | 폴리스티렌& 주의; |
| FBS | Gibco | 10270 | B-LCL 중간 |
| RPMI 중간 1640 | Gibco | 31800-022 | B-LCL 중간 |
| L-글루타민의 구성 요소 | Amresco | 0374 | B-LCLs 중간 |
| 100x 스트렙토마이신 페니실린 용액의 구성 요소 BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | B-LCLs 중간 |
| Ficoll paque plus | 헬스케어 | 17-1440-03 | 림프구 in vitro 분리를 위해 |
| PHA-M | Sigma | L8902 | 림프구 증식을 자극하기 위해 |
| Cyclosporin A | Cayman 화학 | 물질 12088 | T 세포의 세포 독성 효과를 억제하기 위해 |
| 적혈구 용해 완충액 | Tiangen | RT122-01 | 적혈구 용해 MTT |
| Amresco | 0793 | 세포 생존 능력 검출 DMSO | |
| Sigma | D2650 | 동결 세포 용 |
참고문헌
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J.
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재인쇄 및 허가
