Method Article

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

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심근세포는 세포내복제(endoreduplication, karyokinesis와 cytokinesis 없이 DNA 합성을 계속하는 것) 및 acytokinetic mitosis(karyokinesis이지만 cytokinesis는 없음)와 같은 세포주기의 변화에 취약합니다. 이러한 비정형 세포주기 변이는 세포 분열보다는 배수성 및 다핵 세포를 초래합니다. 따라서 심장 회전율과 재생을 결정하기 위해서는 심근세포 핵, 세포당 핵 수 및 세포주기 상태를 정확하게 식별하는 것이 매우 중요합니다. 이는 티미딘 유사체 Ki-67, PCNA 또는 pHH3와 같은 세포주기 활성을 식별하기 위한 핵 마커를 사용하는 데 특히 그렇습니다. 여기에서는 심근세포와 그 핵성을 인식하고 세포주기 활성을 결정하는 방법을 제시합니다. 자사는 심근세포 핵의 명백한 식별을 위해 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스군과 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 CAG-eGFP-아닐린 마우스군이라는 두 가지 발표된 형질전환 시스템을 사용합니다. 이 두 시스템을 함께 사용하면 심장 재생 및 가소성에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

Introduction

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심근 핵 및 세포주기 상태의 정확한 식별은 심근 회전율 및 재생의 판정을위한 매우 중요하다. 이것은 세포주기 활동을 식별하기위한 예컨대 pHH3, 기 - (67) 또는 티미 딘 유사체 핵 마커의 사용에 특히 그러하다. 성인 포유 동물 심근 세포의 증식 능력은 (1), 증식 분석의 결과에 중요한 차이를 만들 수있는 심근 핵의 확산 마커에 대한 긍정적 인 핵의 잘못된 식별 매우 작은 때문이다. 또한, 심근 배수체 및 다핵 세포가 아닌 세포 분열 될 같은 endoreduplication acytokinetic과 같은 유사 분열 세포주기의 변동,되기 쉽다. 이를 위해, 일반적인 세포주기 마커에 대한 항체 염색의 해석은 모든 경우에 결정적인 아니다.

여기, 우리는 직선 forwa을위한 방법을 제시 RD 마우스 심근의 인식과 핵의 명확한 식별하여 출생 후의 성인 단계에서 기본 절연 세포와 두께의 조직 절편에서의 nuclearity. 그 목적을 위해, Myh6 프로모터 (Myh6-H2B-MCH)의 제어하에 인간 히스톤 H2B mCherry과의 융합 단백질의 심근 특이 식 트랜스 제닉 마우스는 2 라인을 사용 하였다. eGFP는-anillin 융합 단백질의 ....

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Protocol

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동물을 포함하는이 프로토콜의 모든 절차는 본 대학의 윤리적 기준에 따라되었고 과학적인 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 지침 2010 유럽 의회 / 63 / EU의 가이드 라인을 준수.

출생 후 심근 세포의 세포주기 활동의 체외 시각화 1.

  1. 출생 후 심근 해리
    1. 사전 실험 준비
      1. 배양 배지 (IMDM, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % 비 필수 아미노산, 0.1 % β 메르 캅토 에탄올)을 준비한다; 매체 (1) : 2 % FCS를 추가; 매체 (2) : 20 % FCS를 추가합니다.
      2. 코트를 96 웰 배양 접시 (반 성장 면적 : 15mm 2) PBS 용액에서 0.1 % 젤라틴.
    2. 심장의 해부
      1. PBS의 15 mL의 페트리 접시를 준비하고 얼음에 보관합니다. 마른 유리 구슬 살균기에서 그들을 넣어 두 족집게와 작은 가위를 소독.
      2. 잘린 신생아 형질 전환 마우스 (CAG-eGFP는-anillin / Myh6-H2B-MCH)를 희생. , 흉부를 열고 Ehler 등의 알에 설명 된대로 마음을 해부하다. 2013 년 (J 비스 특급; (....

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Results

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시험 관내에서 출생 후의 심근 두 번 형질 전환 Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP는-anillin 쥐의 심근 세포의 세포주기 활동에 대한 siRNA를 /의 miRNAs의 효과를 분석하기 위해 출생 후 하루 3 (P3)에 격리하고, 형질 세포주기 활성 유도 miR199 5 P27의 siRNA 및 siRNA를 Fzr1있다. 음성 대조군 (도 1a)와 비교 miR199- (도 1b)와 siRNA를 p27- (도 1C)의 이미지가 심근 세포주기 활성의 유도 표시 형질. Fzr1 억제가 형질 감염된 세포의 핵에서 eGFP는-anillin 융합 단백질의 축적 Fzr1의 손실에 이르게 같이 eGFP는-anillin 마우스 모델에서 Fzr1에 대한 siRNA가이 APC의 억제로 연결, 형질 컨트롤로서 사용될 수있다 F.......

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Discussion

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심근 세포가 세포주기를 다시 입력 및 손상 후 조직의 항상성 동안 나눌 수 있는지 논란이있다. 심근의 기본 회전율의 값은 1 % (1) 80 % (7) 사이의 범위에 제시되어있다. 40 % - 7 또한 심장 병변 후 세포주기 활성의 유도 및 새로운 심근 세포의 생성은 0.0083 %, 8 및 25 사이의 값과, 경계 존에보고되었다. 이러한 불일치는 부분적 학적 섹션 9 및 세포 분열 중에 매우 도전적인 프로세스를 심장 핵을 식별하기 위해 다른 실험적 방법에 의해 설명 될 수있다. 심근 세포가 세포주기의 변동하는 경향으로는 배수체 및 다핵 세포 이어질 endoreduplication acytokinetic 및 유사 분열에서 세포 분열 확실한 구별하기 매우 중요하다. 에 대한세포 분열의 식별은, 이러한 수축 링 midb.......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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기술 지원을 제공해 주신 S. Grünberg(독일 본)와 P. Freitag(독일 본)에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10cm 페트리 접시Sarstedt821472
100 µ m 세포 여과기Becton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ 주입 캐뉼라, StericanBraun, Melsungen4657519
20 게이지 바늘Becton Dickinson GmbH301300
24웰 플레이트Becton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-메틸-부탄Carl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% 포름알데히드 용액AppliChem GmbH A0936,1000
3방향 마개B. 브라운 메디컬 Inc.16494C
50 mL 주사기B. Braun Medical Inc.8728810F
70% 에탄올Otto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibodyJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
세포 배양 마이크로플레이트, 96 Well, 절반 영역Greiner bio-one675986
Collagenase BRoche11088815001
컨포칼 현미경 Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
당나귀 혈청Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
EDTA시그마-알드리치E4884
태아 송아지 혈청PromoCell, 하이델베르크
포름알데히드 용액(4%)PanReac AppliChemA3697
돼지 피부의 젤라틴, A형시그마-알드리치, 스타인하임G2500
유리 커버슬립VWR631-0146
포도당Sigma-AldrichG7021
Heidelberger 확장 튜브IMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond 현미경 슬라이드Marienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
인슐린 주사기Becton Dickinson GmbH300334
Iscove' s 수정됨둘베코' s 매체 (IMDM)Gibco/Life Technologies, 다름슈타트21980-032
KClSigma-AldrichP9333
라미닌코닝354221
레이저 스캐닝 Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, 다름슈타트13778075
마우스 IgG Cy5 (당나귀)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
마이크로 원심분리기 튜브Sarstedt72690
미니 셰이커VWR12620-940
mirVana miRNA 모방, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
생검 금형Sakura Finetek/ VWR4565
M-슬라이드 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
음성 control(scrambled RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
신생아 심장 해리 키트Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
비필수 아미노산, NEAAGibco/Life Technologies, 다름스타드11140-035
Opti-MEM, 환원 혈청 매체Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
페니실린/스트렙토마이신Gibco/Life Technologies, 다름슈타트15140-122
인산염 완충 식염수(PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
DABCO®, 퇴색 방지Sigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, 다름슈타트AM9780
샘플 용기Vitlab80731
혈청 피펫Greiner607180
소프트웨어 NIS 요소Nikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. 화합물Sakura Finetek / VWR25608-930
ToPro3 요오드화물 (642/661)분자 프로브/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeledVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
α-actinin 항체Sigma-AldrichA7811
β-MercaptoethanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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