쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

요약

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

초록

연령 관련 황 반 변성 (AMD) 등 퇴행 성 망막 질환 전세계 돌이킬 수 없는 시력 상실의 주요 원인입니다. AMD는 기능적으로 지원 하 고 해부학 신경 망막 주위 세포의 단층 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 변성에 의해 특징입니다. 비 신생 AMD (건식 AMD)에 대 한 현재 약물 치료는 질병의 진행을 느리게만 겨냥 한 새로운 치료 전략을 식별 하는 연구를 필요로 하는 비전을 복원할 수 없습니다. 건식 AMD를 미래에 치료 건강 한 세포 파악 약속 퇴행 성 RPE 세포를 교체. AMD에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 광범위 한 전 임상 연구 참여 subretinal 사출 기술을 적용 동물 모델의 subretinal 공간으로 줄기 세포 유래 RPE 세포의 이식. 이러한 전 임상 동물 연구에서 가장 자주 사용 하는 접근 어려운 바늘 끝의 직접적인 시각화의 부족에 의해 만들어지고 종종 망막 손상 될 수 있습니다 트랜스 scleral 경로입니다. 유리 체를 통해 다른 접근 바늘 끝 위치의 직접 관찰에 대 한 수 있지만 더 많은 눈 조직 방해로 수술 외상의 높은 위험을 운반. 덜 위험 하 고 재현할 수 수정된 트랜스 scleral 주입 방법 정의 바늘 각도 깊이 사용 하 여 성공적으로 하 고 일관 되 게 쥐 subretinal 공간으로 RPE 세포를 제공 하 고 과도 한 망막 손상을 방지를 개발 했습니다. 이 방식으로 전달 하는 세포는 2 개월 이상에 대 한 외과 의사의 왕 대학 (RCS) 쥐에 효능 되도록 이전 입증 되었습니다. 이 기술은 세포 이식 뿐만 아니라 작은 분자 또는 유전자 요법의 배달을 위해 사용할 수 있습니다.

서론

인간의 망막 눈 기능 뒤 가벼운 감각 조직으로 있으며 비전 인식에 중요 한 역할을 한다. 망막 세포 역 기능 또는 세포 죽음 따라서 시력 문제 또는 영구적인 실명을 발생합니다. 변성 또는 망막의 다른 층에 있는 세포의 기능 장애와 관련 된 장애 퇴행 성 망막 질환, 중 AMD는 가장 일반적인 유형 및 선진국 ^{노인에 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인으로 알려져 있습니다. 1,2}. AMD의 병 적인 과정은 관련 RPE 레이어와 차례로 손상의 포토 리셉터 생리학, 신경 망막 위축 및 비전 손실^{3, RPE 지원 기본 Bruch 막 사이 "드루" 축적 된 4,5}. 지금까지, 치료법은 고급 건조 (비 신생) AMD. 재생 의학의 새로운 패러다임으로 줄기 세포 치료의 출현 줄기 세포 유래 건강 한 세포 기능 장애 또는 죽은 RPE 세포 교체의 희망을 제공 합니다. 실제로, 이식의 광범위 한 전 임상 연구 줄기 세포 (예를들면, 인간 배아 줄기 세포)-RPE 퇴행 성 동물 모델에 파생 된 RPE 세포 수행된

프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 뉴욕 주립 대학의 알바 니에 의해 승인 되었습니다.

1. 사전 사출 준비

1. HRPESC-RPE 세포 현 탁 액의 준비
   참고: 모든 다음 단계 살 균 조직 문화 후드에서 수행 됩니다 및 기본적인 살 균 기술 가진 친밀 필요 합니다.
   1. 기본 hRPE 세포 격리 인간 기증자에서 눈 세 50-90 년과 24-잘 접시¹²문화 셀. 통로 1에 셀 cryopreserve, 필요에 따라 해 동 및 문화 통로 2 (P2) 세포 주입에 대 한 4-5 주 (그림 1A).
   2. ¹² 문화 매체 제거 하 고 부드럽게 린스 우물 500 µ L로 두 번 미리 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 칼슘 및 마그네슘 없이 X 1을 예 열 (1 DPBS CMF x) 1을 추가 하 여 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 고 진공을 사용 하 여 그것을 제거 하는 것은 우물에 X DPBS CMF.
   3. 각 우물에 300 µ L 트립 신/DNAse를 추가 합니다. 트립 신/....

결과

이 문서에서 설명 하는 기술을 사용 하 여, 우리가 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐의 subretinal 공간으로 정확 하 게 위치, 각도, 그리고 조직 (그림 1B-D에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 조절 하 여 ). 즉시 다음 이식, 10 월 시험 사출 사이트와 이식된 세포에 의해 만들어진 subretinal bleb을 수행 했다. 수술 후 10 월 평가 주사 및 망막 손상이 나 출혈에 대 한 모니터링의 품질을 평가 하기 위한 검사 도구 역할을 합니다. 모두 subretinal bleb (그림 2A, C 및 D)과 사출 사이트 (그림 2A , B) 스캔 하는 10 월에서 명확 하 게 볼 수 있었다. Subret.......

토론

이 기사에서 묘사 된 subretinal 주입 기술은 트랜스 scleral 통로, 인젝터 바늘 신경 망막 손상 또는 유리 구멍을 방해 하지 않고 눈 벽의 바깥 레이어 (sclera-맥락 막-RPE 복잡 한)를 침투를 통해 이다. 대체 트랜스-vitreal 접근 설치류 렌즈 유리 구멍의 대부분을 차지 하는 때문에, 백 내장, 이어지는 렌즈 손상의 잠재적인 위험이 있다. 이 방법에 비해, 우리의 기술 덜 위험 하 고 인젝터 바늘 subretinal 공간을 도달 하는 전체 유리 캐비티를 통해 갈 필요가 없습니다으로 최소한의 외상의 원인. 사실, 우리의 연구에서 10 월 시험 행사, 매우 드문 망막 침투 것 고, 동물에 따라 시험에는 없는 영구적인 망막 분리. 또한, 사출 사이트는 매우 작은 (< 200 µ m 직경에서) 때 33-게이지 인젝터를 사용 하 여 바늘 sclera 맥락 막 RPE 복잡 한 구조적 장애는 매우 제한 된 그래서. 바늘 철회 후 주입 구멍 자체 자동으로 그렇게 스티치 물개 또는 조직 접착제 필요 하다.

<.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신-EDTA (1x)	라이프 테크놀로지스	25200-072
DNAse I	시그마	DN-25
1xDulbecco' 칼슘 & 마그네슘 (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
멸균 균형 염 용액 (BSS)	Alcon	00065079550
멸균 안세	Moore Medical	75519
멸균 0.9 % 식염수	Hospira	488810
Proparacaine Hydrochloride 안과 용액 (0.5 %)	Akorn	17478026312
트로피카미드 점안액, USP(1%)	Bausch & Lomb	24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) 주식	Bausch & Lomb	42702010305	이것은 2.5% 페닐에페린
부프레넥	패터슨	433502
덱사메타손	APP 제약	63323051610
100% 에탄올	Thermo Scientific	615090040
70% 에탄올	Ricca Chemical Company	2546.70-5
멸균 GenTeal 윤활제 아이 젤	을 만드는 데 사용됩니다.Novartis	78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE cells	시판되지		세포 분리 및 유지 보수에 대해서는 "Reference #12"를 참조하십시오.
24웰 플레이트	Corning	3526
코니컬 튜브(15 ml)	Sarstedt	62554002
마이크로 원심분리기 캡, O-링 LPS	inc	L233126
캡리스 마이크로 원심분리기 튜브(1.7 ml),	LPS inc	L233041
원심분리기	Eppendorf	5804R
멸균 알코올 닦아내	기McKesson	58-204
멸균 면 팁 애플리케이터	McKesson	24-106-2S
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거즈	McKesson	16-4242
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