쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Summary

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

Abstract

연령 관련 황 반 변성 (AMD) 등 퇴행 성 망막 질환 전세계 돌이킬 수 없는 시력 상실의 주요 원인입니다. AMD는 기능적으로 지원 하 고 해부학 신경 망막 주위 세포의 단층 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 변성에 의해 특징입니다. 비 신생 AMD (건식 AMD)에 대 한 현재 약물 치료는 질병의 진행을 느리게만 겨냥 한 새로운 치료 전략을 식별 하는 연구를 필요로 하는 비전을 복원할 수 없습니다. 건식 AMD를 미래에 치료 건강 한 세포 파악 약속 퇴행 성 RPE 세포를 교체. AMD에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 광범위 한 전 임상 연구 참여 subretinal 사출 기술을 적용 동물 모델의 subretinal 공간으로 줄기 세포 유래 RPE 세포의 이식. 이러한 전 임상 동물 연구에서 가장 자주 사용 하는 접근 어려운 바늘 끝의 직접적인 시각화의 부족에 의해 만들어지고 종종 망막 손상 될 수 있습니다 트랜스 scleral 경로입니다. 유리 체를 통해 다른 접근 바늘 끝 위치의 직접 관찰에 대 한 수 있지만 더 많은 눈 조직 방해로 수술 외상의 높은 위험을 운반. 덜 위험 하 고 재현할 수 수정된 트랜스 scleral 주입 방법 정의 바늘 각도 깊이 사용 하 여 성공적으로 하 고 일관 되 게 쥐 subretinal 공간으로 RPE 세포를 제공 하 고 과도 한 망막 손상을 방지를 개발 했습니다. 이 방식으로 전달 하는 세포는 2 개월 이상에 대 한 외과 의사의 왕 대학 (RCS) 쥐에 효능 되도록 이전 입증 되었습니다. 이 기술은 세포 이식 뿐만 아니라 작은 분자 또는 유전자 요법의 배달을 위해 사용할 수 있습니다.

Introduction

인간의 망막 눈 기능 뒤 가벼운 감각 조직으로 있으며 비전 인식에 중요 한 역할을 한다. 망막 세포 역 기능 또는 세포 죽음 따라서 시력 문제 또는 영구적인 실명을 발생합니다. 변성 또는 망막의 다른 층에 있는 세포의 기능 장애와 관련 된 장애 퇴행 성 망막 질환, 중 AMD는 가장 일반적인 유형 및 선진국 ^{노인에 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인으로 알려져 있습니다. 1,2}. AMD의 병 적인 과정은 관련 RPE 레이어와 차례로 손상의 포토 리셉터 생리학, 신경 망막 위축 및 비전 손실^{3, RPE 지원 기본 Bruch 막 사이 "드루" 축적 된 4,5}. 지금까지, 치료법은 고급 건조 (비 신생) AMD. 재생 의학의 새로운 패러다임으로 줄기 세포 치료의 출현 줄기 세포 유래 건강 한 세포 기능 장애 또는 죽은 RPE 세포 교체의 희망을 제공 합니다. 실제로, 이식의 광범위 한 전 임상 연구 줄기 세포 (예를들면, 인간 배아 줄기 세포)-RPE 퇴행 성 동물 모델에 파생 된 RPE 세포 수행된^6,7, 일부는에 진행 되었습니다 임상 시험^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). 최근, 줄기 세포 인간의 RPE 레이어, 인간의 RPE 줄기 세포 (hRPESCs)에서의 대안 소스 우리의 실험실에 의해 확인 되었다와 amd hRPESC 파생 된 RPE 세포 (hRPESC-RPE) 이식 치료의 임상 연구에서 현재 사용 되 고 ^{10 , 11 , 12 , 13}.

Subretinal 주입 기술은 우리의 그룹을 포함 하 여 여러 그룹에 의해 위에서 언급 한 전 임상 연구에 적용 됩니다. 동물에서 subretinal 주입을 위한 일반적인 방법은 두 가지: 트랜스 vitreal 및 트랜스 scleral. 트랜스-vitreal 접근 앞쪽 눈 침투, 십자가 전체 vitreal 구멍 렌즈에 인접 하 고 침투는 subretinal 도달 하 눈 뒤에 망막 바늘 끝을 직접 관찰할 수 있는 외과 의사의 이점이 있다 공간^14,,1516. 그러나, 그것은 렌즈, 손상의 위험 전달 하 고 바늘을 철회 하는 때 유리 체로 셀의 역류에서 발생할 수 있습니다 (앞쪽에 및 사후), 두 개의 위치에 망막을 방해를 요구 한다. 반면, 트랜스 sclera 접근의 원칙, 망막 및 유리 체의 관련을 방지 하 고 역류 눈을 종료 합니다. 안료 설치류에서 외과 의사 처음 sclera의 침투를 관찰할 수 있다 하지만 안료 맥락 막에 통로, 후 바늘 끝은 더 이상 표시. 직접 관찰 없이 망막 위배 일반적 이며 망막 해 부 및 세포 혈액의 유리 체에 배달 될 수 있습니다. 또한, 눈 표면 곡선 때문에 그것은 매우 어떤 바늘 각도 깊이 트랜스 scleral 주사에 대 한 가장 효과적인 알고 어렵다.

이 시각화 된 문서에서 정보를 가진 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 사출 사이트의 상세한 검사를 수 있는 수술 후 평가의 사용에 의해 트랜스 scleral subretinal 주입 방법을 소개 합니다. 우리의 트랜스 scleral 주입 기술 정의 위치, 각도, 그리고 매우 낮은 수술 외상 및 높은 신뢰성을 주사 바늘에 대 한 깊이 사용 합니다. 여기, 우리가 구체적으로 RCS 쥐, 인간의 AMD의 전 임상 모델의 subretinal 공간으로 hRPESC-RPE 세포의 주입을 보여 줍니다. 이 주입 방법으로 우리가 성공적으로 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐 눈 매우 높은 성공률의 subretinal 공간으로. 세포의 주입 이전¹³주입 후 최소 2 개월 RCS 대뇌의 보존을 발견 했다. 이 절차는 해 현미경 아래 수행 되 고 배우기 쉽습니다. 그것은 두 사람 (한 의사와 보조) 주사를 수행 요구 하 고 각 동물에 대 한 주입의 평균 시간은 5 분 미만 이다. 정의 된 각도 깊이 주사 바늘에 대 한 실험실, 10 월은 성공적인 subretinal 주입을 달성 하기 위해 사용할 수 없습니다에 대 한 가능 하 게. 그것은 높은 재현성 subretinal 액세스를 허용 하 고 세포 이식, 뿐만 아니라 약물 전달 및 유전자 치료에 사용할 수 있습니다.

Protocol

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 뉴욕 주립 대학의 알바 니에 의해 승인 되었습니다.

1. 사전 사출 준비

1. HRPESC-RPE 세포 현 탁 액의 준비
   참고: 모든 다음 단계 살 균 조직 문화 후드에서 수행 됩니다 및 기본적인 살 균 기술 가진 친밀 필요 합니다.
   1. 기본 hRPE 세포 격리 인간 기증자에서 눈 세 50-90 년과 24-잘 접시¹²문화 셀. 통로 1에 셀 cryopreserve, 필요에 따라 해 동 및 문화 통로 2 (P2) 세포 주입에 대 한 4-5 주 (그림 1A).
   2. ¹² 문화 매체 제거 하 고 부드럽게 린스 우물 500 µ L로 두 번 미리 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 칼슘 및 마그네슘 없이 X 1을 예 열 (1 DPBS CMF x) 1을 추가 하 여 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 고 진공을 사용 하 여 그것을 제거 하는 것은 우물에 X DPBS CMF.
   3. 각 우물에 300 µ L 트립 신/DNAse를 추가 합니다. 트립 신/DNAse (4 구 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL 당 DNase) 셀 해리를 37 ° C에서 4 분에 hRPESC-RPE 세포를 품 어.
   4. 그들은 반올림 있는지 현미경 셀을 확인 합니다. 계속 그들은 아직 둥근 하지 경우 트립 신/DNase를 추가 2 분 동안에 세포를 품 어.
   5. 셀 반올림 됩니다, 일단 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 triturate 우물에서 분리 된 세포를 트립 신/DNase 비활성화를 미리 데워 진된 문화 매체의 동일한 볼륨 15 mL 원뿔 튜브로 분리 된 셀을 포함 하는 트립 신/DNase 전송.
   6. 미리 데워 진 1 우물 린스 부드럽게 위아래로 잘;의 가장자리의 주위에 특히 pipetting으로 X DPBS CMF 그런 다음 이전 원뿔 관에 이러한 셀을 추가 합니다.
   7. 286 x g 작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 원뿔 튜브 원심
   8. 제거는 상쾌한 고 1 mL 문화 매체와 셀 resuspend.
   9. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
   10. 작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 대 한 286 x g에서 원심.
   11. 상쾌한을 제거 하 고 셀에 살 균 균형 소금 솔루션 (BSS) 50, 000 셀 / µ L에서 (subretinal 주입 중 1 µ L 볼륨에 50, 000 셀을 제공)을 resuspend.
   12. 1.7 mL microcentrifuge 튜브와 얼음 물 혼합물에 주입 사용까지 최종 세포 현 탁 액 (CS)를 전송 합니다.
2. 셀 인젝터의 준비
   1. 주입 주사기와 인젝터를 밀접 하 게 나사에 메 마른 33-게이지 경사진된 바늘을 삽입 합니다.
   2. 5-6 번 100% 에탄올과 인젝터를 플러시.
   3. 5-6 번 70% 에탄올과 인젝터를 플러시.
   4. 플러시 BSS와 인젝터 5-6 시간.
   5. 인젝터 바늘 메 마른 검은 마커 펜 (그림 1B) 해 현미경 바늘의 팁에서 600 µ m의 위치에 표시 합니다.
   6. 인젝터 주입 micromanipulator 놓습니다.

2. subretinal 주입

1. 외과 영역 및 동물 준비
   1. 그리고 4-5 주 오래 된 RCS 쥐 (60-100 g)를 무게 isoflurane 증기 전달 시스템을 사용 하 여 anesthetize.
      참고: 유도 마 취 5%에서 isoflurane 유량을 유지 합니다. 발을 눌러 마 취의 깊이 확인 하 고 수술 시 마 취 유지 보수에 대 한 2-3% 유량을 줄일 수 있습니다.
   2. 메 마른 외과 영역을 설정 해 현미경의 스테이지 밑,가 열 패드와 멸 균 수술 드 레이프를 놓습니다.
   3. 외과 영역에 쥐를 전송 및 마 취 유지 isoflurane 시스템에 연결 된 코 콘 쥐 장소.
   4. 거 즈와 쥐의 시체를 커버. 전체 마 취를 확인 하는 쥐의 발가락을 꼬집어.
2. 트랜스 scleral subretinal 주사 현미경
   1. 쥐의 unoperated 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 합니다.
   2. 주입, 외과 의사의 오른손 쪽으로 그것의 머리 및 외과 의사를 향해 다시 천장에 직면 하는 왼쪽된 눈과 쥐의 오른쪽 면에 위치.
   3. 작은 위로 눈을 커버 하는 어떤 수염을 잘라 주세요.
   4. 왼쪽된 눈의 시간적 측면에서 눈 세척의 작은 금액을 똑 똑 하 고 눈을 씻어 하 면 주걱으로 비 강 측에 초과 수집 합니다.
   5. 각각의 한 방울을 적용 하 여 주입 후 10 월 시험에 대 한 1 %tropicamide 및 2.5 %phenylephrine (갓 수술 당일 무 균 0.9% 식 염 수에 희석 하 여 10 %phenylephrine 만든)와 학생 같은데요.
   6. 4-6 시간 눈 주위의 피부를 살짝 당겨 눈은 약간 proptosed 지역에서 limbus 후부에 쉽게 액세스할 수 있도록 눈 꺼 풀을 열고.
   7. 눈 세척의 방울을 적용 하 고 눈을 촉촉한 유지.
   8. 부드럽게 (준비 단계 1.1.12) CS를 triturate 하 고 1.2 µ L CS와 인젝터를 로드 합니다. 여분의 0.2 µ L 주입 역류에 대 한 보상 하는 데 사용 됩니다.
      참고: 에 대 한 우리의 측정에 따라 5000-8000 셀 50, 000 셀 / µ L 셀 손실의 약 10-16%에 그의 주사와 역류에 손실 됩니다 및 0.2 µ L CS의 추가이 셀 손실 보상을 주입 했다.
   9. 인젝터는 micromanipulator에 CS로 가득 놓습니다 (또는 그것을 잡고 보조) 세로로 RPE 세포에에서 쉽게 침 몰 경향이.
   10. 눈에 방울 0.5 %proparacaine (지역 국 소 마 취 제)를 적용 하 고 초과 면 주걱으로 제거.
       참고: 이 단계는 각 막 반사를 억제 하 고 깜박이 후속 단계에서 눈을 방지 해야 합니다.
   11. 집게를 사용 하 여를 후부는 limbus 결 막, 눈 nasally, 회전 리프트 "텐트"를 만들려고 결.
   12. 가 위를 사용 하 여 결 막에 작은 개통을 확인 하 고 기본 sclera를 노출 하는 "천막"의 상단을 잘라.
   13. 집게를 사용 하 여 나머지 결 한계는 limbus 옆의 가장자리 회전 눈 nasally 동 공 축 테이블 위쪽 (그림 1C)을 기준으로 약 30도의 각도에서를. 결 막의 지속적인 창과 바늘 삽입 하는 동안 카운터 힘을 제공 하 고 최적의 각도에서 눈을 유지 하기 위해 필요 합니다.
   14. 세포 주입 안내 하는 구멍을 향하도록 팁의 개막과 함께 limbus를 후부 1200-1500 µ m에서 메 마른 경사진된 31 게이지 인슐린 바늘의 끝을 놓습니다.
   15. 그것은 10-15도 sclera (의도 된 주사 사이트에서 가상 평면에 접선) 위에 인슐린 바늘의 각도 조정 합니다. 천천히 sclera 맥락 막 복잡 한 약 500 µ m의 바늘 깊이 침투. 색칠 한 쥐에서 바늘 끝 사라질 것 이다 '' 안료 맥락 막 아래. 여기에서 사용 하는 인슐린 바늘의 브랜드에 대 한 경사에 바늘 끝에서 거리 500 µ m입니다.
   16. 신중 하 게 철수 인슐린 바늘 (혈액의 아주 작은 유출을 볼 수 있습니다).
   17. 과도 한 출혈, 지적 필요한 경우 눈 창 구멍, 취소를 적용할 수 있습니다. 지속적인 출혈 후 창 응용 프로그램 나타냅니다 선박 수 있습니다 손상 되었을.
   18. 오프닝, 그리고는 공 막의 지역 표면에 상대적으로 약 10-15도 각도 직면 하 고 안내 하는 구멍으로 RPE 세포 로드 인젝터 바늘을 안내.
   19. 부드럽게 subretinal 공간에 액세스를 약 500 µ m의 깊이를 안내 하는 구멍에 인젝터 바늘을 삽입 합니다. 검은 펜 마크의 가장자리와 바늘 (그림 1C 및 1d) 안료 맥락 막에 의해 덮여 있다 지점 사이의 100 µ m 여백에 대 한 이어야 한다.
   20. 부드럽게 셀 (약 1.2 µ L)의 적절 한 볼륨을 주입 하는 인젝터 주사기의 플런저를 우울 하 게 보조를 요구 하십시오. 플런저 프레스는 조수로 일부 카운터 힘을 제공 하기 위해 준비가 되어있습니다.
       참고: 도우미와 사전 모의 연습 의사와이 단계는 필요한 경험을 가진 보조를 제공할 수 있습니다.
   21. 시각적으로 펜에 집중 하는 동안 가장자리를 표시, 인젝터 25-30에 대 한 장소에서를 누른 다음 천천히 인젝터를 철회 합니다. 역류의 작은 금액은 일반적으로 관찰 된다.
       참고: 없는 혈 류 관찰 되는 경우 수 있었다 intravitreal 주사. 인감 또는 공 막 엔 아래 작성 하는 셀을 통해 역류 하십시오 경우 주사 너무 얕은 했다.
   22. 3 번에 메 마른 눈 세척과 사출 사이트에서 셀 경과 헹 구 고 면 주걱으로 초과 수집 합니다.
   23. 운영된 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 하 고 10 월 역 이식된 세포의 위치와 subretinal bleb의 크기를 검사 하는 쥐를 전송.

3. 포스트 주입 치료

1. 항 염증 및 통증 진통제 치료
   1. 고통을 감소를 피하 염 분에 0.1 mg/kg 몸 무게에서 buprenorphine 주사.
   2. 염 분에 1.6 mg/kg 몸 무게에서 dexamethasone 염증 제어용 복 주사 (I.P.) 주사.
2. 동물 복구
   1. 체온을 유지 하기 위해 열 램프 아래 복구 케이지를 쥐를 반환 합니다.
   2. 출혈의 징후에 대 한 운영된 눈을 관찰 합니다.
   3. 마 취 나올 수 있도록 쥐를 관찰 합니다.
   4. 신선한 케이지를 복구 된 동물을 반환 하 고 수술 카드 케이지를 플래그 조 난, 안구 출혈, 또는 각 막 불투명도의 어떤 표시 든 지를 위한 매일 모니터링. 문제가 있다면 수 의사를 즉시 통보.

Results

이 문서에서 설명 하는 기술을 사용 하 여, 우리가 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐의 subretinal 공간으로 정확 하 게 위치, 각도, 그리고 조직 (그림 1B-D에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 조절 하 여 ). 즉시 다음 이식, 10 월 시험 사출 사이트와 이식된 세포에 의해 만들어진 subretinal bleb을 수행 했다. 수술 후 10 월 평가 주사 및 망막 손상이 나 출혈에 대 한 모니터링의 품질을 평가 하기 위한 검사 도구 역할을 합니다. 모두 subretinal bleb (그림 2A, C 및 D)과 사출 사이트 (그림 2A , B) 스캔 하는 10 월에서 명확 하 게 볼 수 있었다. Subret...

Discussion

이 기사에서 묘사 된 subretinal 주입 기술은 트랜스 scleral 통로, 인젝터 바늘 신경 망막 손상 또는 유리 구멍을 방해 하지 않고 눈 벽의 바깥 레이어 (sclera-맥락 막-RPE 복잡 한)를 침투를 통해 이다. 대체 트랜스-vitreal 접근 설치류 렌즈 유리 구멍의 대부분을 차지 하는 때문에, 백 내장, 이어지는 렌즈 손상의 잠재적인 위험이 있다. 이 방법에 비해, 우리의 기술 덜 위험 하 고 인젝터 바늘 subretinal 공간을 도달 하는 전체 유리 캐비티를 통해 갈 필요가 없습니다으로 최소한의 외상의 원인. 사실, 우리의 연구에서 10 월 시험 행사, 매우 드문 망막 침투 것 고, 동물에 따라 시험에는 없는 영구적인 망막 분리. 또한, 사출 사이트는 매우 작은 (< 200 µ m 직경에서) 때 33-게이지 인젝터를 사용 하 여 바늘 sclera 맥락 막 RPE 복잡 한 구조적 장애는 매우 제한 된 그래서. 바늘 철회 후 주입 구멍 자체 자동으로 그렇게 스티치 물개 또는 조직 접착제 필요 하다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 트립신-EDTA (1x)	라이프 테크놀로지스	25200-072
DNAse I	시그마	DN-25
1xDulbecco' 칼슘 & 마그네슘 (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
멸균 균형 염 용액 (BSS)	Alcon	00065079550
멸균 안세	Moore Medical	75519
멸균 0.9 % 식염수	Hospira	488810
Proparacaine Hydrochloride 안과 용액 (0.5 %)	Akorn	17478026312
트로피카미드 점안액, USP(1%)	Bausch & Lomb	24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) 주식	Bausch & Lomb	42702010305	이것은 2.5% 페닐에페린
부프레넥	패터슨	433502
덱사메타손	APP 제약	63323051610
100% 에탄올	Thermo Scientific	615090040
70% 에탄올	Ricca Chemical Company	2546.70-5
멸균 GenTeal 윤활제 아이 젤	을 만드는 데 사용됩니다.Novartis	78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE cells	시판되지		세포 분리 및 유지 보수에 대해서는 "Reference #12"를 참조하십시오.
24웰 플레이트	Corning	3526
코니컬 튜브(15 ml)	Sarstedt	62554002
마이크로 원심분리기 캡, O-링 LPS	inc	L233126
캡리스 마이크로 원심분리기 튜브(1.7 ml),	LPS inc	L233041
원심분리기	Eppendorf	5804R
멸균 알코올 닦아내	기McKesson	58-204
멸균 면 팁 애플리케이터	McKesson	24-106-2S
멸균 Weck-Cel 창	Beaver-Visitec International
멸균 수술용 드레이프	McKesson	25-515
거즈	McKesson	16-4242
나노필 주사기(10ul)	세계 정밀 기기	Nanofil
나노필 비스듬한 33게이지 바늘	세계 정밀 기기	NF33BV-2
인슐린 주사기 바늘 31게이지	Becton Dickinson	328418
쥐 이빨 집게	세계 정밀 기기	555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5602
순환수 T 펌프	스트라이커	TP700
가열 패드	Kent Scientific	TPZ-814
동물 마취 시스템	세계 정밀 기기	EZ-7000
밸런스	오하우스	PA1502
스테레오 현미경	Zeiss	Stemi 2000
현미경 광원	Schott	ACE 시리즈
Bioptigen Envisu 스펙트럼 도메인 안과 이미징 시스템	Bioptigen	R2210
멸균 블랙 마커 펜	Viscot Industries	1416S-100
미니어처 측정 스케일	Ted Pella Inc	13623
적외선 바스킹 스포트 램프	EXO-TERRA	PT2144	이것은 수술 후 회복 단계에서 동물을 위한 난방 램프로 사용됩니다.