연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

요약

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

초록

연골 엔지니어링은 기본 조직과 유사한 체외 기능 임플란트를 만드는 어려움으로 인해 도전 남아있다. 최근자가 교체의 개발을위한 탐구 접근 방법은 연골 세포로 줄기 세포의 분화를 포함한다. 이 연골, 필요한 줄기 세포의 압축 정도를 시작하려면; 따라서, 우리는 세포 어 트랙터로 소형화 자장 소스를 사용, 두꺼운 발판과 발판이없는 내 모두 자기 응축 세포의 가능성을 보여 주었다. 이 자기 방식도 집계 융합을 안내하고 비계가없는 조직 구축하는 데 사용 된, 3 차원 (3D)은 크기가 몇 mm를 어떤 조직이. 강화 된 크기를 갖는 외에, 자기 구동에 의해 형성된 융합 조직 콜라겐 II의 발현의 상당한 증가를 제공하고, 유사한 경향 aggrecan 발현이 관찰되었다. 네이티브 연골은 힘 t 하였다으로모자의 3 차원 구조에 영향을 동적 숙성도 수행 하였다. 기계적인 자극을 제공하는 생물 반응기에서는 21 일 동안 배양하여 자기 시드 지지체를 이용 하였다. 생물 반응기의 성숙은 크게 cellularized 지지체에 연골을 개선; 이러한 조건에서 얻어진 세포 외 기질은 콜라겐 II 및 aggrecan 풍부 하였다. 이 작업은 개선 된 연골 세포 분화, 양쪽 발판없고 내의 다당류 골격 용 생물 반응기에 표시된 줄기 세포의 자기 축합 동적 숙성 혁신적인 전위를 설명.

서론

자기 나노 입자는 이미 자기 공명 영상 (MRI)을위한 조영제로 병원에서 사용하고 있으며, 자신의 치료 응용 프로그램을 확대 유지. 예를 들어, 최근 표지 세포 주입 ^{1, 2, 3의} 정의 된 부위에서 외부 자기장을 이용하여 생체 내에서 조작 될 수 있고, 지시 된 수 및 / 또는 유지하는 것이 밝혀졌다. 재생 의학, 그들은 혈관 조직 ^{5, 6, 7,} 골 ^8, 연골 ^(9)를 포함하여 체외 ⁴ 조직 조직, 엔지니어링 할 수 있습니다.

관절 연골이 손상이 발생할 때 매우 제한된 세포 외 기질 성분의 수리를, 무혈성 환경 내에 침지된다. 이러한 이유로, researc 위해H는 현재 결함 부위에 이식 할 수 유리질 연골 대체의 기술에 집중된다. 다른 연골

프로토콜

마그네틱 장치 1. 건설

주 : 세포 접종에 사용하는 장치는 애플리케이션에 따라서 변경 (도 1). 자기 팁 (지름 750 μm의) 매우 얇아 야하므로 응집체를 형성하는 셀의 수는 2.5 × ¹⁰⁵ / 집합으로 제한된다. 1.8 / ^㎠ 7mm 두께 발판 종자, 자석은 크게 (직경 3mm)이어야하고, 지지체의 세공을 세포 이동을 보장한다.

1. 골재 형성을위한 미세 자석 장치의 구성 (도 1a)
   1. 알루미늄 판을 통해 0.8 mm의 드릴로 미세 구멍 (직경 3cm, 6 mm 두께)을 만든다.
   2. 플레이트의 각 구멍에 자기 팁 (지름 750 μm의)을 삽입한다.
   3. 포화 자화를 보장하는 영구 네오디뮴 자석, 이상이 디스크를 넣습니다.
2. 비계 파종위한 장치의 건설 ( 도 1b)
   1. 2.4 cm ² 제곱에 하드 컷 폴리스티렌.
   2. 1.6 cm ^(2)의 면적에 걸쳐 동일한 간격으로 9 개 작은 자석 (직경 3mm, 길이 6mm)을 _{삽입한다.}
   3. 영구 네....

결과

우선, 골재를 개별적으로 2.5 × ^{105 개} 표지 줄기 세포를 (도 2A)을 증착에 의해 미소 자석을 사용하여 형성 될 수있다. 이 하나의 집합체 (~ 크기가 0.8 mm)는 다음 순차적으로, 자기 유도 융합에 더 큰 구조 덕분에 융합 될 수있다. 예를 들어, 연골 성숙의 8 일째에, 집계는 이중선을 형성하는 한 쌍의 접촉에 넣고; 네 쌍둥이 2 이중선을 병합하여 11 일째에 조립 하였다; 마지막으로, 15 일째에, (4) 네 쌍둥이 4 × ¹⁰⁶ 세포 (~ 사이즈 4mm) (도 2B)의 합계와, 초기에 형성된 응집물 (16)을 포함하는 3 차원 구조물을 형성하기 위해 융합 하였다. 둘째, 동일한 자력 기술은 발판 내의 세포 집합체를 형성하기 위해 사용되어왔다. 지지체는 자기 소자를 통해 접종 하였다 조밀 (도 2c 정확한 마이크로 자석 .......

토론

여기에 제시된 기술은 자성 나노 입자의 국제화에 의존하기 때문에 그들이 세포 내 지역화하면 첫째, 하나의 중요한 문제는 나노 입자의 결과이다. 이는 철 나노 입자 잠재 독성 또는 노광 ^{(19), (22)의} 크기, 코팅, 및 시간에 따라 손상 분화 능력을 트리거 할 수 있다는 사실이다. 캡슐화 철 나노 입자의 형태 magnetoferritin 생물학적 자성 나노 입자 ^{(24) (23)을} 사용하고, 또는 단순 시트르산 코팅 적절한 농도로 사용 된 ¹⁸ 그러나, 몇몇 연구는 세포 생리학에 영향을 보이지 않고있다. 또한, 산화철 나노 입자 (MSC와 연골 용)이 논문에서 설명 된 것과 유사한 조건에서 사용될 때, 최근 증명 그 nanoparti의 신속하고 거의 전체 저하사이클 사용은 세포의 설립 및 MS.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
산화철 (마그헤마이트) 나노 미립자 (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	C. Mé에 의해 제작 및 제공됨; nager	평균 직경 8.1 nm 및 음의 표면 전하
다당류 Pullulan/Dextran 스캐폴드	LIOAD - University Nantes	제작 및 C. Le Visage에 의해 제공	알칼리성 조건에서 풀루란/덱스트란의 75:25 혼합물로 준비(10  M NaOH)입니다. 다공성: 185-205  &마이크로; m; 두께: 7  밀리미터; 표면적: 1.8  cm2입니다.
TisXell 재생 시스템	QuinXell Technologies	QX900-002	이축 생물반응기에는 500 mL 배양실이 있습니다.
비계용 케이지: Histosette II M492	VWR	720-0909
중간엽 줄기 세포 (MSC)	Lonza	PT-2501	세 가지 독립적 인 배치가 사용되었습니다
MSCGM BulletKit 매체	Lonza	PT-3001	완전한 배지의 경우 제공된 BulletKit (혈청, 글루타민 및 항생제 포함)
Glutamax I	Life Technologies	31966-021	피루브산 나트륨 없음, HEPES 없음
RPMI 매체 1640, 글루타민 없음	Life Technologies	31870-025	나트륨 피루브산 없음, CaCl 없이 HEPES
PBS2 MgCl2	없음 Life Technologies	14190-094
0.05% 트립신-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
페니실린 (10,000  U/mL) / 스트렙토마이신(10,000  &마이크로; g/mL)Life	Technologies	15140-122
ITS 프리믹스 범용 배양 보조제(20x)	Corning	354352
피루브산 나트륨 용액 100mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	증류수에 농축 용액(25mM)을 즉석으로 준비합니다
L-Proline	Sigma	P5607	증류수에 희석된 175mM 원액을 준비하고 4 에서 보관하십시오. &데그; C
Dexamethasone	Sigma	D4902	에탄올에 희석 된 1 mM 재고 용액을 100 % 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오. &데그; C
TGF-베타 3 단백질 10  &마이크로; g	Interchim	30R-AT028
트라이-소듐 시트레이트	VWR	33615.268	1  M 원액을 증류수에 희석하여 4 에 보관하십시오. &데그;
C Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA 추출 키트	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
랜덤 입문서 - Hexamer	Promega	C1181	500 &마이크로; g/mL: 희석한 1/2을 사용하고 1 & 마이크로를 넣습니다. 샘플당 L
리보뉴클레아제 억제제	Promega	N2511	40 U/µ의 재조합 RNA; L : 1 µ를 넣으십시오. L per sample
PCR 뉴클레오티드 dNTP 믹스 (10  mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
포르말린 용액 10% 중성 완충	시그마	HT5012
OCT 용액	VWR	361603E
이소펜탄	시그마	M32631
톨루이딘 블루 O	VWR	1.15930.0025
에탄올 절대	VWR	20821.310
톨루엔	VWR	1.08323.1000
마운팅 매체 Pertex	Histolab	840
RPLP0 qPCR 용 프라이머	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'qPCR
용 아그레칸 프라이머	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACACGATGCCTTT-5'qPCR
용 콜라겐 II 프라이머	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'

을 과 함께 MSCGM 배지 DMEM에 추가하십시오 .