방법 논문

신경 근육 학 교차로 기능을 측정

DOI:

10.3791/55227

⸱

2017년 8월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.

초록

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신경 근육 학 교차로 (NMJ) 기능 모터 신경 및 근육 사이 통신 장애, 노화 등 루 경화 증 (ALS)에서는 질병을 공부 하는 때 중추적인 역할을 한다. 여기 우리가 NMJ 기능 전기 자극의 두 종류를 결합 하 여 측정 하는 데 사용할 수 있는 실험 프로토콜 설명: 근육 막 자극과 자극이 신경을 통해 직접. 이러한 두 가지 다른 stimulations에 근육 응답의 비교 정의 기능 수준, 근육에서 기능 감소로 이어질는 NMJ에 잠재적인 변경 시킬 수 있습니다.

Ex vivo 준비는 잘 통제 연구에 적합. 여기는 근육 기능과 NMJ soleus 좌 골 신경 준비 및 다이어 프 램 인할지 신경 준비의 여러 매개 변수를 측정 하는 집중적인 프로토콜에 설명 합니다. 프로토콜 약 60 분을 지속 하 고는 주문에 의하여 uninterruptedly 실시 트 위치 속도 론 속성, 근육 및 신경 stimulations의 힘-주파수 관계와 두 개의 매개 변수 NMJ 기능, 즉 neurotransmission 실패와 intratetanic 피로 측정 소프트웨어. 이 방법론 soleus과 횡 경 막 근육 신경 준비에 SOD1G93A 유전자 변형 마우스, 편 overexpresses 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) ALS의 실험 모델을 사용 하 여 손해를 검출 하 사용 되었다.

서론

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신경 근육 학 교차로 (NMJ) 근육 섬유의 모터 종판 및 터미널 모터 신경 축 삭 사이 연결에 의해 형성 된 화학 시 냅 스 이다. NMJ 근육과 신경 사이 통신 장애, 노화 또는 루 경화 증 (ALS)에서 발생 되는 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 근육과 신경, 의사 소통 양방향 방법1,2로 근육 결함 별도로 NMJ 결함을 측정할 수 있는 그들의 physiopathological 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사실,이 기능 평가 형태학 또는 생 화 확 적인 변경 감소 neurotransmission 신호 기능을 도울 수 있다.

근육 수축 반응 elicited 신경 자극과 같은 근육의 막의 직접 자극에 의해 evoked의 응답에 의해 비교 NMJ 기능의 간접 측정으로 제안 되었습니다. 실제로, 막 자극에 의해 패스 neurotransmission 신호, 이후 두 수축 성 반응의 차이 변화는 NMJ에 관찰 될 수 있습니다. 이 방법은 광범위 하 게 쥐3,,45,6,7, 제안 되었고 또한 마우스 모델8,,910,,1112에 정보를 수집 하는 데 사용.

여기, 우리가 자세히 설명 삭제할 soleus 좌 골과 횡 경 막 인할지 준비 두 근육 신경 준비, 즉 테스트 하는 프로시저. 주문 품을 사용 하 여 소프트웨어, 우리 설계 NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수 측정을 결합 하 여 지속적인 테스트 프로토콜 함으로써 근육의 NMJ 손상의 포괄적인 평가 별도로 저조한. 특히, 프로토콜 트 위치 힘, 근육 활동, 힘 주파수 곡선에 대 한 직접 및 신경 stimulations, 모두는 발사와 tetanic 주파수 및 intratetanic 피로7neurotransmission 실패13 측정합니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 로마 사피엔자 대학교의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 이탈리아 동물 보호법의 현행판에 따라 수행되었습니다.

1. 실험적 설정

  1. 액추에이터/변환기 1개, 자극기 2개, 체외 근육 장치 1개, 준비 조직 목욕 1개, 흡입 전극 1개, 디지털 오실로스코프 1개, 실체 현미경 1개, 냉광 조명기 1개, 수집 보드 1개, 커넥터 블록 1개 및 개인용 컴퓨터로 구성된 실험 시스템을 설정합니다.
    참고: 여기서 명령 소프트웨어는 LabView에서 프로그래밍되었으며 자극의 높은 유연성, 정확성 및 반복성을 보장하도록 설계되었습니다. 각 자극에 대해 사용자는 펄스 폭, 주파수, 지속 시간을 선택하고 멤브레인으로 전달되는지 아니면 신경을 통해 전달되는지를 결정할 수 있습니다. 사용자는 각 자극 전의 휴식 시간의 길이를 선택할 수도 있습니다.

2. 가자미근과 횡격막근의 NMJ 수축 특성 평가

  1. 시스템 예열
    1. Krebs Ringer buffer14를 준비하고 장착 장치의 수조와 준비 티슈 수조에 넣습니다. 규소 4ml로 준비한 60mm 접시를 준비 티슈 수조에 놓습니다.
    2. 순환 수조를 켜고 가자미근의 경우 온도를 30°C로, 횡격막 근육의 경우 27°C로 설정합니다.
    3. 95 % O2 - 5 % CO2 혼합물이 두 수조로 흘러 들어가도록합니다.
    4. 액추에이터/트랜스듀서와 두 개의 펄스 자극기를 켜고 전류 값을 멤브레인 자극의 경우 300mA, 신경 자극의 경우 5mA로 설정합니다.
      참고: 300mA 전류 값은 이전에 D-tubocurarine이 solution15에 추가될 때 신경 가지에 큰 수축을 유발하지 않는 것으로 나타났습니다. 5mA 전류 값은 용액을 통해 유도된 막 자극과 겹치지 않고 신경을 통해 근육을 자극하는 데 필요한 전류의 양에 해당합니다. 흡입 전극과 근육 사이의 거리는 신경 길이에 따라 달라지기 때문에 이 전류 값은 아래 설명된 대로 각 실험 전에 신중하게 조정해야 합니다.
  2. 가자미근 및 횡격막 절제
    1. 고통을 최소화하기 위해 경추 탈구로 마우스를 희생하고 다음과 같이 테스트를 위해 즉시 근육을 절제합니다.
    2. 가자미근-좌골 준비, 절제 및 설정
      1. 마우스 다리에 에탄올 70 %를 뿌리고 다리를 덮고있는 피부를 제거합니다.가위로 다리 윗부분을 절개 한 후 피부를 단단히 당깁니다. 아킬레스건을 경골에서 분리한 다음 가위로 아킬레스건을 자릅니다.
      2. 한 쌍의 집게로 힘줄을 단단히 조이고 비복근을 가자미근과 함께 부드럽게 당깁니다. 가자미의 근위 힘줄이 드러나면 아킬레스건을 잡고 가위로 종아리 전체를 자릅니다. 즉시 조직 샘플을 준비 조직 수조에 넣습니다.
      3. 실체현미경 아래에 준비조를 놓고 직경 0.20mm의 스테인리스 스틸 핀을 사용하여 종아리를 실리콘 접시에 고정합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 가자미의 근위 힘줄을 고정하고 부드럽게 당겨 좌골 신경을 노출시킵니다.
      4. 신경 분포가 노출되면(그림 1) 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 신경의 약 5mm를 노출시킵니다. 가위를 사용하여 신경을 잘라냅니다. 집게로 가자미를 근위 힘줄에 단단히 고정하면서 다시 당겨 가위로 아킬레스건을 잘라 절제합니다.
      5. 액추에이터/변환기의 레버 암 구멍을 통해 나일론 와이어를 통과시킵니다. 와이어 끝에 올가미를 만들고 근육이 장착 장치의 욕조에 도달할 때까지 와이어를 뒤로 당기기 전에 아킬레스건을 잡습니다. 고정 클램프 내에 근위 힘줄을 고정하고 레버 암 주위에 나일론 와이어를 묶습니다. 용액에서 근육이 평형을 이루도록 합니다.
      6. 초기 최적 길이(L0)를 결정합니다.
        1. 먼저 근육을 늘려 10mN으로 예압합니다(이 값은 최대 경련력을 보장합니다(경험에 근거함)). 그런 다음 근육을 부드럽게 스트레칭하여 예압을 변경하고 일련의 단일 펄스로 근육을 자극합니다. 최대 트위치 힘을 측정할 때 최적의 길이가 달성됩니다.
    3. Diaphragm-phrenic 준비, 해부 및 설정
      1. 마우스 피부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위로 흉골을 절개하고 피부를 단단히 잡아당겨 횡격막 근육을 덮고 있는 피부를 제거합니다.
      2. 가위로 흉골 아래 복부를 수평으로 자르고 집게로 장과 장기를 부드럽게 제거합니다. 두꺼운 가위를 사용하여 척추를 자릅니다.
      3. 갈비뼈를 흉골 위로 약 1cm 정도 자르고 수평으로 진행합니다. 한 쌍의 집게로 외부 장기를 부드럽게 제거하고 척추를 잘라 횡격막을 포함하는 갈비뼈의 원형 고리를 얻습니다.
      4. Krebs Ringer 버퍼가 들어있는 접시에 제제를 씻은 다음 윗면이 위를 향하고 흉골이 앞을 향하도록 준비 티슈 수조 내부의 실리콘 접시에 넣습니다.
      5. 실체현미경을 사용하여 폐와 나머지 장기를 조심스럽게 제거하십시오. 횡격막 신경이 오른쪽에 보일 것입니다(그림 2A).
      6. 갈비뼈를 다듬어 다이어프램을 따라 약 2mm의 고리를 남깁니다.
      7. 집게를 사용하여 횡격막 중앙 힘줄의 횡격막 중앙 힘줄에 있는 0.20mm 직경의 스테인리스 스틸 핀 하나를 고정하고 동일한 축의 갈비뼈에 다른 핀을 고정하여 관심 있는 다이어프램 스트립을 식별합니다.
      8. 중앙 힘줄에 두 개의 추가 핀을 고정하고 선택한 스트립의 양쪽에 있는 리브에 다른 두 개의 핀을 고정하여 다이어프램을 배치합니다. 필요한 경우 집게를 사용하여 주변 결합 조직에서 횡격막 신경을 청소합니다.
      9. 구부러진 칼날을 사용하여 신경 분포의 양쪽에 있는 횡격막을 잘라 그림 2B와 같이 힘줄-근육-갈비뼈 스트립을 식별합니다.
      10. 액추에이터/변환기의 레버 암 구멍을 통해 나일론 와이어를 통과시킵니다. 와이어 끝에 올가미를 만들고 근육이 장착 장치의 욕조에 도달할 때까지 와이어를 뒤로 당기기 전에 힘줄을 잡습니다.
      11. 고정 클램프 내에 갈비뼈를 고정하고 레버 암에 나일론 와이어를 묶습니다.
      12. 용액에서 근육이 평형을 이루도록 하고 초기 최적 길이(L0)를 결정합니다.
        1. 근육을 스트레칭하여 5mN으로 예압합니다. 근육을 부드럽게 스트레칭하여 예압을 변경하고 일련의 단일 펄스로 근육을 자극합니다. 최대 트위치 힘을 측정할 때 최적의 길이가 달성됩니다.

figure-protocol-1
그림 1 - 가자미근-좌골 신경 준비. 기능 테스트를 위한 외과 수술 중 가자미근-좌골 신경. 좌골 신경통은 한 쌍의 집게를 사용하여 노출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-2
그림 2 - 횡격막-횡격막 신경 준비. 그림은 다이어프램-횡격막 신경 준비 절제술(A)의 단계와 기능 테스트를 위해 장착할 스트립(B)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 근육 수축성과 별도로 NMJ 특성 측정
    1. 신경을 통한 자극에 가장 적합한 전류 강도를 설정하고 흡입 전극을 통해 전달되는 전류 펄스가 수조의 전류 확산에 의해 근육 수축을 유발하지 않는지 확인합니다.
      1. 흡입 전극을 근육 근처에 놓고 신경을 당깁니다. 전류 강도를 부드럽게 높이면서(5mA부터 시작) 일련의 단일 펄스로 근육을 자극합니다. 최적의 전류 값은 트위스트 힘이 최대일 때 결정됩니다.
      2. 전극에서 신경을 밀어내고 몇 번의 단일 펄스를 전달합니다. 근육이 용액을 통한 막 자극과 겹쳐서 수축하지 않도록 하십시오. 다시 신경을 곤두세우세요.
    2. 프로그램을 실행하고 입력 파일을 선택하여 원하는 테스트 프로토콜을 실행합니다.
      참고: 입력 파일에는 전체 프로토콜을 실행하는 데 필요한 모든 자극 매개변수가 포함되어 있습니다. 두 근육에 대해 동일한 프로토콜 구조가 사용되지만, 자극 매개변수는 프로토콜에 따라 다르며, 이는 가자미근 또는 횡격막 근육을 나타냅니다.
      1. 가자미근-좌골 신경 자극(표 1 참조)
        1. 모든 전기 자극에 대해 다음 펄스 폭을 사용하십시오: 좌골 신경 자극의 경우 1.4ms, 직접 가자미 자극의 경우 0.1ms. 전체 프로토콜은 약 65분 동안 지속됩니다.
      2. 횡격막-횡격막 신경 자극(표 2 참조)
        1. 모든 전기 자극에 대해 다음 펄스 폭을 사용하십시오: 횡격막 신경 자극의 경우 1.8ms, 직접 횡격막 자극의 경우 0.2ms. 전체 프로토콜은 약 55분 동안 지속됩니다.
      3. 실험 프로토콜이 끝나면 각각 0.05mm 정확도의 아날로그 캘리퍼와 0.1mg 정확도의 정밀 저울을 사용하여 근육의 길이와 젖은 무게를 측정합니다.
        1. 근육 질량을 최적 섬유 길이(L,f)와 포유류 골격근의 밀도(1.06 mg/mm3)의 곱으로 나누어 단면적(CSA)을 계산합니다16.
          참고: Lf는 L0에 섬유 길이/근육 길이 비율(soleus muscle16의 경우 0.71, 횡격막 muscle17의 경우 1)을 곱하여 얻습니다.
개 분 개 분 개 분 개 명 의 개 의 의 개 의 의 개 의 분 개 의 의 개 의 의 개 의 분 개 의 의 개 명 분 명 의
실험 유형빈도기간반복근육 또는 신경 자극목적
(헤르츠)(들)
경련단일 펄스1근육트위치 힘과 운동학
쉬다30
경련단일 펄스1신경
쉬다30
경련단일 펄스1근육
쉬다30
경련단일 펄스1신경
쉬다120
융합되지 않은 파상풍400.81신경
쉬다180
융합되지 않은 파상풍600.81근육
쉬다180
융합된 파상풍800.81신경
쉬다180
융합되지 않은 파상풍200.81근육
쉬다180
융합되지 않은 파상풍600.81신경
쉬다180
융합된 파상풍800.81근육
쉬다180
융합되지 않은 파상풍200.81신경
쉬다180
융합되지 않은 파상풍400.81근육
쉬다300
피로 패러다임350.81 근육 자극 후 14회 신경 자극, 각각 1.2초의 휴식 시간, 20회 반복신경 전달 부전(NF)
쉬다900
피로 패러다임800.81 근육 자극 후 14회 신경 자극, 각각 1.2초의 휴식 시간, 20회 반복신경전달 실패(NF) 및 인트라테타닉 피로(IF)

표 1 - 가자미근-좌골 신경 자극 프로토콜. 이 표에는 가자미-좌골 신경 준비를 테스트하기 위한 완전한 프로토콜을 형성하는 테스트 순서가 나열되어 있습니다.

개 분 개 분 개 분 개 명 의 개 명 개 개 의 의 개 명 분 개 명 의 개 명 의 개 명 분 개 명 개 개 명 개 개 의 의 개 명 분 호 명 의 호
실험 유형빈도기간반복근육 또는 신경 자극목적
(헤르츠)(들)
경련단일 펄스1근육트위치 힘과 운동학
쉬다30
경련단일 펄스1신경
쉬다30
경련단일 펄스1근육
쉬다30
경련단일 펄스1신경
쉬다120
융합되지 않은 파상풍600.51신경신경 및 근육 자극을 위한 힘/주파수 곡선
쉬다120
융합된 파상풍1000.51근육
쉬다180
융합되지 않은 파상풍400.51신경
쉬다120
융합되지 않은 파상풍200.51근육
쉬다120
융합되지 않은 파상풍800.51신경
쉬다150
융합되지 않은 파상풍800.51근육
쉬다150
융합되지 않은 파상풍200.51신경
쉬다120
융합된 파상풍1000.51근육
쉬다150
융합된 파상풍1000.51신경
쉬다180
융합되지 않은 파상풍600.51근육
쉬다300
피로 패러다임350.331 근육 자극 후 14회 신경 자극, 휴식 시간 각각 0.67초, 20회 반복신경 전달 부전(NF)
쉬다900
피로 패러다임800.331 근육 자극 후 14회 신경 자극, 휴식 시간 각각 0.67초, 20회 반복신경전달 실패(NF) 및 인트라테타닉 피로(IF)

표 2 - 횡격막-횡격막 신경 자극 프로토콜. 이 표에는 횡격막-횡격막 신경 제제를 테스트하기 위한 완전한 프로토콜을 형성하는 테스트 순서가 나열되어 있습니다.

3. 데이터 분석

참고: 프로토콜이 끝나면 다음과 같이 원하는 모든 매개변수를 계산합니다.

  1. 단일 펄스 자극에서
    1. 트위치 힘(mN, 트위치 중에 생성되는 최대 활성 힘)과 특정 트위치 힘(mN/mm2)을 계산합니다. 초기 예압 값을 근육이 생성하는 최대 힘으로 빼서 계산합니다. 특정 트위치 힘을 트위치 힘을 근육 CSA로 나눈 값으로 계산합니다.
    2. 최대 장력까지의 시간(TTP)(ms)을 펄스 방출에서 트위스트 힘까지의 시간으로 계산합니다.
    3. 절반 이완 시간(1/2RT)(ms)을 트위치 힘에서 트위치 힘의 50%까지의 시간으로 계산합니다.
    4. dF/dt(mN/ms)를 수축 단계에서 힘 도함수의 최대값으로 계산합니다.
    5. -dF/dt(mN/ms)를 이완 단계 동안 힘 도함수의 최대값으로 계산합니다.
  2. 펄스 트레인 자극에서
    1. 비융합 하중(mN)과 비융합 하중(mN/mm2)을 계산합니다. 초기 예압 값을 근육이 생성하는 최대 힘으로 빼서 계산합니다. 비융합 힘을 비융합 힘을 근육 CSA.
      로 나눈 값으로 계산합니다. 알림: 융합되지 않은 힘은 테타닉 주파수보다 낮은 주파수로 펄스 트레인 동안 생성되는 최대 활성력입니다.
    2. 파탄력(mN)과 비파탄력(mN/mm2)을 계산하고, 최대 힘은 파탄적 주파수로 전달되는 펄스 트레인 동안 생성된 최대 활성력입니다. 초기 예압 값을 근육이 생성하는 최대 힘으로 빼서 계산합니다. 비파탄력을 파탄력을 근육 CSA로 나눈 값으로 계산합니다.
    3. 힘-주파수 곡선을 계산합니다. 각 자극에 대해 얻은 힘(또는 특정 힘)의 값과 증가하는 자극 빈도에 대한 값을 플롯합니다. 일반적으로 단일 펄스 자극으로 시작하여 파탄 주파수로 끝납니다.
  3. 피로 패러다임에서
    1. 신경 전달 실패(NF)를 다음과 같이 계산합니다.
      figure-protocol-3
      여기서 MF는 근육 자극에 따른 힘 감소이고 F는 근육 자극 후 첫 번째 펄스 트레인에서 측정된 신경 자극에 따른 힘 감소입니다.
    2. 인트라테타닉 피로(IF)를 다음과 같이 계산합니다.
      figure-protocol-4
      여기서Flp는 자극의 마지막 펄스에서 근육이 생성하는 힘이고 Fm은 동일한 펄스 트레인 동안 근육이 생성하는 최대 힘입니다. 신경 자극과 관련하여, 직접 자극 직후 첫 번째 펄스 트레인의 인트라테타닉 피로를 계산합니다.

4. 통계 분석

참고: 신경 및 막 자극에 대한 근육 반응이 동일한 동물 모델 내에서 비교되는지 아니면 2개의 다른 동물 모델 간에 비교되는지에 따라 통계 분석 모델을 선택해야 합니다18,19.

  1. 직접 및 간접 자극에 대한 근육 반응만 비교하는 경우 TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt에 대한 스튜던트 t 테스트를 사용하십시오. 2가지 다른 마우스 균주에서 얻은 근육 제제를 비교하는 경우 자극 유형과 마우스 변형을 고정 요인으로 하는 2-way ANOVA를 사용합니다. 2원 분산 분석에서 유의한 결과가 반환되면 여러 비교 테스트를 사용하여 통계적 차이를 검색합니다.
  2. 힘-주파수 곡선(직접 및 간접 자극에 대한 근육 반응만 비교하는 경우)의 경우 자극 유형과 자극 빈도를 고정 요인으로 하는 2-way ANOVA를 사용합니다. 필요한 경우 여러 비교 테스트를 사용합니다.
    1. 2가지 다른 마우스 균주에서 얻은 근육 제제를 비교하는 경우 자극 유형, 자극 빈도 및 마우스 변형을 고정 요인으로 하는 3-way ANOVA를 사용합니다.
      1. 3원 분산 분석이 동물 변형 요인 및 자극 유형의 유의한 효과를 생성하는 경우 2원 분산 분석을 사용하여 한 번에 두 그룹 간의 유의한 차이를 식별합니다. 예를 들어, 막 자극에 대한 두 그룹의 근육 반응 간의 차이 또는 한 그룹 내에서 직접 및 간접 자극에 대한 근육 반응 간의 차이를 평가할 수 있습니다.
  3. 인트라테타닉 피로
    참고: 이 프로토콜은 대조군 마우스에서도 신경 자극에 대한 반응으로 피로를 유발하도록 설계되었기 때문에 이 매개변수는 2개의 마우스 균주 간의 차이를 조사하는 데만 사용할 수 있으며 단일 그룹 내의 통계 분석은 항상 상당한 차이를 산출합니다.
    1. 두 그룹을 비교하려면 자극 유형, 시간, 마우스 변형률을 고정 요인으로 하는 3-way ANOVA를 사용하십시오. 3원 분산 분석이 동물 변형 요인 및 자극 유형의 유의한 효과를 산출하는 경우 2원 분산 분석을 사용하여 힘-빈도 곡선과 같이 한 번에 두 그룹 간의 유의한 차이를 식별합니다.
  4. 신경전달 실패의 경우, 동물 변형률과 시간을 고정 요인으로 하는 2-way ANOVA를 사용합니다. 유의미한 결과가 반환되면 여러 비교 테스트를 사용하여 통계적 차이를 검색합니다.
    참고: 이 매개변수는 각 마우스 변형에 대해 하나의 값만 반환하기 때문에 다른 마우스 모델을 비교할 수 있습니다.
  5. 근육 무게, 길이 및 CSA의 경우 스튜던트 t 검정을 사용하여 서로 다른 동물 모델의 근육-신경 제제를 비교할 때 차이점을 조사합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리가 설명 하는 프로토콜은 여러 신경 근육 학 질병 또는 노화 sarcopenia 기능 denervation에 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜 여부 (그리고, 그렇다면, 어떤 수준)를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다 근육 변경 근육 자체 또는 신경 근육 학 전송에서 발생 하는 선택적인 변경 됩니다. 아래 데이터는 우리의 그룹18, 루 경화 증 질병20의 최종 단계에서의 SOD1G93A 유전자 변형 마우스 모델에 의해 이전 작업의 결과입니다. SOD1G93A 유전자 변형 마우스 편 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) overexpresses. 그림 3과 4는 dF/dt 및 tetanic 힘 값 soleus 좌 골 신경 (왼쪽)와 횡 경 막 인할지 신경 (오른쪽) 준비를 보여줍니다. 이러한 결과 근육 자...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위에서 설명한 실험 프로토콜에는 측정 하 고 차별 어떤 기능 변경 발생 한 근육에 직접 또는 간접적으로 신경 근육 학 교차로 수준에서의 이상적인 방법을 제공 한다. 이 기술은 NMJ 기능의 간접 측정을 기반으로, 이후 형태학 변화 또는 생 화 확 적인 변화에 어떤 결함 관련 된 경우 설정 하에서 사용할 수 없습니다. 대조적으로, 그것은 어떤 형태 또는 생 화 확 적인 변경 neurotransmission 기능 신호 감소 여부 결정의 효과적인 방법을 제공지 않습니다. 그러나, 힘 측정 완료 근육 목욕에서 제거, 얼룩이, 최적의 길이에 고정, 포함 화합물으로 둘러싸인 고 빠르게 녹는 isopentane에 냉동. 근육 후속 평가-80 ° C에서와 같은 immunohistochemical 및 형태소 분석에 대 한 저장할 수 있습니다.

우리가 여기에서 제안 하는 기술은 결합, 처음으로, NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수를 측정 하는 실험 테스트 프로토콜을 기반으로 합니다...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자의 연구실에서 작업 피코 로마와 텔 레 톤 (no를 부여에 의해 지원 되었다 GGP14066)입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
듀얼 모드 레버 시스템 오로라 사이언티픽 Inc.300B액추에이터/트랜스듀서
고출력 바이페이즈 자극기 오로라 사이언티픽 Inc.701B펄스 자극기 (신경)
고출력 바이페이즈 자극기 오로라 사이언티픽 Inc.701C펄스 자극기(근육)
체외 근육 장치 오로라 사이언티픽 Inc.800A
준비 티슈 목욕Radnoti158400
단극 흡입 전극A-M 시스템573000집에서 만든 참조 
오실로스코프 TektronixTDS2014
실체현미경NikonSMZ 800
Cold light illuminator Photonic OpticsPL 3000
수집 보드National InstrumentsNI PCIe-6353
커넥터 블록National InstrumentsNI 2110
개인용 컴퓨터AMD Phenom II x4 970프로세서 3.50 Ghz (Windows 7
포함) LabView 2012 소프트웨어National Instruments
Krebs-Ringer 중탄산염 버퍼 시그마-알드리치K4002 생리적 완충액
중탄산나트륨시그마-알드리치S5761 
염화칼슘 CaCl2Sigma-AldrichC4901무수, 분말, ≥ 97 %
버퍼 HEPES시그마 - 알드리치H3375≥ 99.5% (적정)
접시 60mm x 15mm팔콘353004폴리스티렌
실리콘실가드;184 실리콘 엘라스토머 키트  0.5Kg.
온도조절기DennerleDigitalDuomat 1200
펌프Newa MiniMN 606수족관
내열성 열케이블 LuckyReptile61403-150/60Hz 50W
버킷10폴리프로필렌
O2 + 5%CO2siadMix gas
#5 Forceps Fine Science Tools11252-202 아이템
스프링 가위 - 8mm 블레이드Fine Science Tools15024-10신경 절제
날카로운 가위 고급 과학 도구 14059-11근육 제거
섬세한 가위Wagner02.06.32동물 외부
학생 메스 핸들 #3고급 과학 도구 91003-12 
메스 블레이드 #10파인 사이언스 도구 10010-00
메스 블레이드 #11파인 사이언스 도구 10011-00
나일론 와이어 &오슬래시; 0.16mm임의
리터

참고문헌

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Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

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