신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 근육 학 교차로 (NMJ) 기능 모터 신경 및 근육 사이 통신 장애, 노화 등 루 경화 증 (ALS)에서는 질병을 공부 하는 때 중추적인 역할을 한다. 여기 우리가 NMJ 기능 전기 자극의 두 종류를 결합 하 여 측정 하는 데 사용할 수 있는 실험 프로토콜 설명: 근육 막 자극과 자극이 신경을 통해 직접. 이러한 두 가지 다른 stimulations에 근육 응답의 비교 정의 기능 수준, 근육에서 기능 감소로 이어질는 NMJ에 잠재적인 변경 시킬 수 있습니다.
Ex vivo 준비는 잘 통제 연구에 적합. 여기는 근육 기능과 NMJ soleus 좌 골 신경 준비 및 다이어 프 램 인할지 신경 준비의 여러 매개 변수를 측정 하는 집중적인 프로토콜에 설명 합니다. 프로토콜 약 60 분을 지속 하 고는 주문에 의하여 uninterruptedly 실시 트 위치 속도 론 속성, 근육 및 신경 stimulations의 힘-주파수 관계와 두 개의 매개 변수 NMJ 기능, 즉 neurotransmission 실패와 intratetanic 피로 측정 소프트웨어. 이 방법론 soleus과 횡 경 막 근육 신경 준비에 SOD1G93A 유전자 변형 마우스, 편 overexpresses 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) ALS의 실험 모델을 사용 하 여 손해를 검출 하 사용 되었다.
서론
신경 근육 학 교차로 (NMJ) 근육 섬유의 모터 종판 및 터미널 모터 신경 축 삭 사이 연결에 의해 형성 된 화학 시 냅 스 이다. NMJ 근육과 신경 사이 통신 장애, 노화 또는 루 경화 증 (ALS)에서 발생 되는 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 근육과 신경, 의사 소통 양방향 방법1,2로 근육 결함 별도로 NMJ 결함을 측정할 수 있는 그들의 physiopathological 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사실,이 기능 평가 형태학 또는 생 화 확 적인 변경 감소 neurotransmission 신호 기능을 도울 수 있다.
근육 수축 반응 elicited 신경 자극과 같은 근육의 막의 직접 자극에 의해 evoked의 응답에 의해 비교 NMJ 기능의 간접 측정으로 제안 되었습니다. 실제로, 막 자극에 의해 패스 neurotransmission 신호, 이후 두 수축 성 반응의 차이 변화는 NMJ에 관찰 될 수 있습니다. 이 방법은 광범위 하 게 쥐3,,45....
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프로토콜
모든 동물 실험은 로마 라 사피엔자 대학교(Sapienza University of Rome) 조직학 및 의학 배아학 부서의 윤리 위원회 승인을 받았으며, 동물 보호에 관한 이탈리아 법률의 최신 버전에 따라 수행되었습니다.
1. 실험 설정
- 액추에이터/트랜스듀서 1개, 자극기 2개, in-vitro 근육 장치 1개, 준비용 조직 욕조 1개, 흡입 전극 1개, 디지털 오실로스코프 1개, 실체 현미경 1개, 냉광 조명 장치 1개, 데이터 수집 보드 1개, 커넥터 블록 1개 및 개인용 컴퓨터로 구성된 실험 시스템을 설정합니다.
참고: 여기서 제어 소프트웨어는 LabView로 프로그래밍되었으며, 자극의 높은 유연성, 정확성 및 재현성을 보장하도록 설계되었습니다. 각 자극에 대해 사용자는 펄스 폭, 주파수, 지속 시간을 선택할 수 있으며, 자극을 막에 직접 전달할지 또는 신경을 통해 전달할지를 결정할 수 있습니다. 또한 사용자는 각 자극 전의 휴지기 길이를 선택할 수 있습니다.
2. 가자미근 및 횡격막 근육의 NMJ 수축 특성 평가
- 시스템 예열
- Krebs Ringer 완충액....
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결과
우리가 설명 하는 프로토콜은 여러 신경 근육 학 질병 또는 노화 sarcopenia 기능 denervation에 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜 여부 (그리고, 그렇다면, 어떤 수준)를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다 근육 변경 근육 자체 또는 신경 근육 학 전송에서 발생 하는 선택적인 변경 됩니다. 아래 데이터는 우리의 그룹18, 루 경화 증 질병20의 최종 단계에서의 SOD1G93A 유전자 변형 마우스 모델에 의해 이전 작업의 결과입니다. SOD1G93A 유전자 변형 마우스 편 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) overexpresses. 그림 3과 4는 dF/dt 및 tetanic 힘 값 soleus 좌 골 신경 (왼쪽)와 횡 경 막 인할지 신경 (오른쪽) 준비를 보여줍니다. 이러한 결과 근육 자.......
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토론
위에서 설명한 실험 프로토콜에는 측정 하 고 차별 어떤 기능 변경 발생 한 근육에 직접 또는 간접적으로 신경 근육 학 교차로 수준에서의 이상적인 방법을 제공 한다. 이 기술은 NMJ 기능의 간접 측정을 기반으로, 이후 형태학 변화 또는 생 화 확 적인 변화에 어떤 결함 관련 된 경우 설정 하에서 사용할 수 없습니다. 대조적으로, 그것은 어떤 형태 또는 생 화 확 적인 변경 neurotransmission 기능 신호 감소 여부 결정의 효과적인 방법을 제공지 않습니다. 그러나, 힘 측정 완료 근육 목욕에서 제거, 얼룩이, 최적의 길이에 고정, 포함 화합물으로 둘러싸인 고 빠르게 녹는 isopentane에 냉동. 근육 후속 평가-80 ° C에서와 같은 immunohistochemical 및 형태소 분석에 대 한 저장할 수 있습니다.
우리가 여기에서 제안 하는 기술은 결합, 처음으로, NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수를 측정 하는 실험 테스트 프로토콜을 기반으로 합니다.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자의 연구실에서 작업 피코 로마와 텔 레 톤 (no를 부여에 의해 지원 되었다 GGP14066)입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 듀얼 모드 레버 시스템 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 300B | 액추에이터/트랜스듀서 |
| 고출력 바이페이즈 자극기 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 701B | 펄스 자극기 (신경) |
| 고출력 바이페이즈 자극기 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 701C | 펄스 자극기(근육) |
| 체외 근육 장치 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 800A | |
| 준비 티슈 목욕 | Radnoti | 158400 | |
| 단극 흡입 전극 | A-M 시스템 | 573000 | 집에서 만든 참조 |
| 오실로스코프 | Tektronix | TDS2014 | |
| 실체현미경 | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| 수집 보드 | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| 커넥터 블록 | National Instruments | NI 2110 | |
| 개인용 컴퓨터 | AMD Phenom II x4 970 | 프로세서 3.50 Ghz (Windows 7 | |
| 포함) LabView 2012 소프트웨어 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer 중탄산염 버퍼 | 시그마-알드리치 | K4002 | 생리적 완충액 |
| 중탄산나트륨 | 시그마-알드리치 | S5761 | |
| 염화칼슘 CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | 무수, 분말, ≥ 97 % |
| 버퍼 HEPES | 시그마 - 알드리치 | H3375 | ≥ 99.5% (적정) |
| 접시 60mm x 15mm | 팔콘 | 353004 | 폴리스티렌 |
| 실리콘 | 실가드; | 184 실리콘 | 엘라스토머 키트 0.5Kg. |
| 온도조절기 | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| 펌프 | Newa Mini | MN 606 | 수족관 |
| 내열성 열케이블 Lucky | Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| 버킷 | 10 | 폴리프로필렌 | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 아이템 |
| 스프링 가위 - 8mm 블레이드 | Fine Science Tools | 15024-10 | 신경 절제 |
| 날카로운 가위 | 고급 과학 도구 | 14059-11 | 근육 제거 |
| 섬세한 가위 | Wagner | 02.06.32 | 동물 외부 |
| 학생 메스 핸들 #3 | 고급 과학 도구 | 91003-12 | |
| 메스 블레이드 #10 | 파인 사이언스 도구 | 10010-00 | |
| 메스 블레이드 #11 | 파인 사이언스 도구 | 10011-00 | |
| 나일론 와이어 &오슬래시; 0.16mm | 임의 |
참고문헌
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8
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재인쇄 및 허가
