Method Article

신경 근육 학 교차로 기능을 측정

DOI:

10.3791/55227

⸱

August 6th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

In This Article

Summary

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신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.

Abstract

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신경 근육 학 교차로 (NMJ) 기능 모터 신경 및 근육 사이 통신 장애, 노화 등 루 경화 증 (ALS)에서는 질병을 공부 하는 때 중추적인 역할을 한다. 여기 우리가 NMJ 기능 전기 자극의 두 종류를 결합 하 여 측정 하는 데 사용할 수 있는 실험 프로토콜 설명: 근육 막 자극과 자극이 신경을 통해 직접. 이러한 두 가지 다른 stimulations에 근육 응답의 비교 정의 기능 수준, 근육에서 기능 감소로 이어질는 NMJ에 잠재적인 변경 시킬 수 있습니다.

Ex vivo 준비는 잘 통제 연구에 적합. 여기는 근육 기능과 NMJ soleus 좌 골 신경 준비 및 다이어 프 램 인할지 신경 준비의 여러 매개 변수를 측정 하는 집중적인 프로토콜에 설명 합니다. 프로토콜 약 60 분을 지속 하 고는 주문에 의하여 uninterruptedly 실시 트 위치 속도 론 속성, 근육 및 신경 stimulations의 힘-주파수 관계와 두 개의 매개 변수 NMJ 기능, 즉 neurotransmission 실패와 intratetanic 피로 측정 소프트웨어. 이 방법론 soleus과 횡 경 막 근육 신경 준비에 SOD1G93A 유전자 변형 마우스, 편 overexpresses 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) ALS의 실험 모델을 사용 하 여 손해를 검출 하 사용 되었다.

Introduction

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신경 근육 학 교차로 (NMJ) 근육 섬유의 모터 종판 및 터미널 모터 신경 축 삭 사이 연결에 의해 형성 된 화학 시 냅 스 이다. NMJ 근육과 신경 사이 통신 장애, 노화 또는 루 경화 증 (ALS)에서 발생 되는 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 근육과 신경, 의사 소통 양방향 방법1,2로 근육 결함 별도로 NMJ 결함을 측정할 수 있는 그들의 physiopathological 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사실,이 기능 평가 형태학 또는 생 화 확 적인 변경 감소 neurotransmission 신호 기능을 도울 수 있다.

근육 수축 반응 elicited 신경 자극과 같은 근육의 막의 직접 자극에 의해 evoked의 응답에 의해 비교 NMJ 기능의 간접 측정으로 제안 되었습니다. 실제로, 막 자극에 의해 패스 neurotransmission 신호, 이후 두 수축 성 반응의 차이 변화는 NMJ에 관찰 될 수 있습니다. 이 방법은 광범위 하 게 쥐3,,45....

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Protocol

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모든 동물 실험은 로마 사피엔자 대학교의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 이탈리아 동물 보호법의 현행판에 따라 수행되었습니다.

1. 실험적 설정

  1. 액추에이터/변환기 1개, 자극기 2개, 체외 근육 장치 1개, 준비 조직 목욕 1개, 흡입 전극 1개, 디지털 오실로스코프 1개, 실체 현미경 1개, 냉광 조명기 1개, 수집 보드 1개, 커넥터 블록 1개 및 개인용 컴퓨터로 구성된 실험 시스템을 설정합니다.
    참고: 여기서 명령 소프트웨어는 LabView에서 프로그래밍되었으며 자극의 높은 유연성, 정확성 및 반복성을 보장하도록 설계되었습니다. 각 자극에 대해 사용자는 펄스 폭, 주파수, 지속 시간을 선택하고 멤브레인으로 전달되는지 아니면 신경을 통해 전달되는지를 결정할 수 있습니다. 사용자는 각 자극 전의 휴식 시간의 길이를 선택할 수도 있습니다.

2. 가자미근과 횡격막근의 NMJ 수축 특성 평가

  1. 시스템 예열
    1. Krebs Ringer buffer14를 준비하고 장착 장치의 수조와 준비 티슈 수조에 넣습니다. 규소 4ml로 준비한 60....

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Results

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우리가 설명 하는 프로토콜은 여러 신경 근육 학 질병 또는 노화 sarcopenia 기능 denervation에 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜 여부 (그리고, 그렇다면, 어떤 수준)를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다 근육 변경 근육 자체 또는 신경 근육 학 전송에서 발생 하는 선택적인 변경 됩니다. 아래 데이터는 우리의 그룹18, 루 경화 증 질병20의 최종 단계에서의 SOD1G93A 유전자 변형 마우스 모델에 의해 이전 작업의 결과입니다. SOD1G93A 유전자 변형 마우스 편 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) overexpresses. 그림 3과 4는 dF/dt 및 tetanic 힘 값 soleus 좌 골 신경 (왼쪽)와 횡 경 막 인할지 신경 (오른쪽) 준비를 보여줍니다. 이러한 결과 근육 자.......

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Discussion

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위에서 설명한 실험 프로토콜에는 측정 하 고 차별 어떤 기능 변경 발생 한 근육에 직접 또는 간접적으로 신경 근육 학 교차로 수준에서의 이상적인 방법을 제공 한다. 이 기술은 NMJ 기능의 간접 측정을 기반으로, 이후 형태학 변화 또는 생 화 확 적인 변화에 어떤 결함 관련 된 경우 설정 하에서 사용할 수 없습니다. 대조적으로, 그것은 어떤 형태 또는 생 화 확 적인 변경 neurotransmission 기능 신호 감소 여부 결정의 효과적인 방법을 제공지 않습니다. 그러나, 힘 측정 완료 근육 목욕에서 제거, 얼룩이, 최적의 길이에 고정, 포함 화합물으로 둘러싸인 고 빠르게 녹는 isopentane에 냉동. 근육 후속 평가-80 ° C에서와 같은 immunohistochemical 및 형태소 분석에 대 한 저장할 수 있습니다.

우리가 여기에서 제안 하는 기술은 결합, 처음으로, NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수를 측정 하는 실험 테스트 프로토콜을 기반으로 합니다.......

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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저자의 연구실에서 작업 피코 로마와 텔 레 톤 (no를 부여에 의해 지원 되었다 GGP14066)입니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
듀얼 모드 레버 시스템 오로라 사이언티픽 Inc.300B액추에이터/트랜스듀서
고출력 바이페이즈 자극기 오로라 사이언티픽 Inc.701B펄스 자극기 (신경)
고출력 바이페이즈 자극기 오로라 사이언티픽 Inc.701C펄스 자극기(근육)
체외 근육 장치 오로라 사이언티픽 Inc.800A
준비 티슈 목욕Radnoti158400
단극 흡입 전극A-M 시스템573000집에서 만든 참조 
오실로스코프 TektronixTDS2014
실체현미경NikonSMZ 800
Cold light illuminator Photonic OpticsPL 3000
수집 보드National InstrumentsNI PCIe-6353
커넥터 블록National InstrumentsNI 2110
개인용 컴퓨터AMD Phenom II x4 970프로세서 3.50 Ghz (Windows 7
포함) LabView 2012 소프트웨어National Instruments
Krebs-Ringer 중탄산염 버퍼 시그마-알드리치K4002 생리적 완충액
중탄산나트륨시그마-알드리치S5761 
염화칼슘 CaCl2Sigma-AldrichC4901무수, 분말, ≥ 97 %
버퍼 HEPES시그마 - 알드리치H3375≥ 99.5% (적정)
접시 60mm x 15mm팔콘353004폴리스티렌
실리콘실가드;184 실리콘 엘라스토머 키트  0.5Kg.
온도조절기DennerleDigitalDuomat 1200
펌프Newa MiniMN 606수족관
내열성 열케이블 LuckyReptile61403-150/60Hz 50W
버킷10폴리프로필렌
O2 + 5%CO2siadMix gas
#5 Forceps Fine Science Tools11252-202 아이템
스프링 가위 - 8mm 블레이드Fine Science Tools15024-10신경 절제
날카로운 가위 고급 과학 도구 14059-11근육 제거
섬세한 가위Wagner02.06.32동물 외부
학생 메스 핸들 #3고급 과학 도구 91003-12 
메스 블레이드 #10파인 사이언스 도구 10010-00
메스 블레이드 #11파인 사이언스 도구 10011-00
나일론 와이어 &오슬래시; 0.16mm임의
리터

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8

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Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

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