상 동성 재조합을 통해 생성 된 유전자 결실 돌연변이는 유전자 기능 연구의 황금 표준이다. 결실 구조물의 신속한 생성을위한 OSCAR (Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids의 One Step Construction) 방법이 기술되어있다. 아그로 박테 리움 매개 곰팡이 형질 전환이 이어진다. 마지막으로, 곰팡이 형질 전환 체에서 PCR을 이용한 유전자 결실 확인 방법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
게놈의 나머지 부분을 그대로두고 관심있는 유전자를 정확하게 삭제하면 살아있는 유기체에서 특정 유전자의 기능을 결정하는 이상적인 제품을 제공합니다. 이 프로토콜에서 정확하고 신속한 삭제 플라스미드 구성의 OSCAR 방법이 설명됩니다. OSCAR는 관심 유전자의 정제 PCR 증폭 5 '및 3'측면과 두 개의 플라스미드, pA-Hyg OSCAR (마커 벡터) 및 pOSCAR (조립체)를 포함하는 단일 재조합 효소 반응이 수행되는 클로닝 시스템에 의존한다 벡터). 올바르게 조립 된 결실 벡터의 확인은 제한 효소지도 작성과 시퀀싱에 의해 수행됩니다. Agrobacterium tumefaciens 는 곰팡이 포자 (ATMT)에 결실 구조의 도입을 매개하는데 사용된다. 마지막으로, PCR 분석은 상 동성 또는 비 상 동성 재조합에 의해 결실 된 결실 구조가 유전자 결실을 나타내는 지 또는이소성 통합. 이 접근법은 Verticillium dahliae 와 Fusarium verticillioides 에서 수많은 종의 유전자를 삭제하는데 성공적으로 사용되었습니다.
서론
유전 적 해부는 개인 또는 유전자 조합의 기능적 중요성을 결정하는 강력한 방법입니다. 특정 유전자의 역할을 이해하기위한 표준 접근법은 다른 유전자에서 변경되지 않은 단일 유전자 돌연변이의 생산이다. 가장 강력하고 최소한의 혼란을주는 접근법은 다른 유전자 기능에 손상을주지 않으면 서 관심 유전자의 오픈 리딩 프레임 (GOI ORF) 유전자를 완전하고 정확하게 삭제하는 것입니다.
삭제 플라스미드 생성을위한 표준 라이 게이션 접근법은 여러 단계가 필요하기 때문에 OSCAR 1 에 대한 합리적인 방법은보다 신속한 시험 관내 접근법을 생산하는 것이 었습니다. 그림 1 은 OSCAR 방식의 어셈블리 프로세스를 보여줍니다. 여기에 설명 된 방법은 이후의 Agrobacterium tumefaciens 매개 transfo와 결합하여 단일 multipart 반응에서 개별 유전자 삭제 벡터의 빠른 건설을 결합의 장점이 있습니다(ATMT). OSCAR는 매우 신속하며 효모 2 에서 Gibson assembly 사용과 같은 다른 전략과 잘 비교됩니다. OSCAR 방법은 여러 종류의 진균류와 함께 성공적으로 사용되었습....
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프로토콜
1. 유전자 측면의 PCR 증폭을위한 프라이머 디자인
- 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 FungiDB 또는 기타 게놈 데이터 자원의 양 측면에있는 유전자 2K 이상을 포함하여 관심 유전자 (GOI)의 게놈 영역을 워드 프로세싱 파일로 다운로드합니다.
- 삭제하고자하는 ORF를 강조 표시하고 코돈을 시작 및 중지합니다.
- 다운로드 된 시퀀스 내에서 인접한 ORF를 식별하고 강조 표시하십시오.
- GOI ORF의 2 kb 5 '말단과 프라이머 디자인 도구 (Materials List 참조)를 사용하여 PCR 프라이머 쌍 O1과 O2를 설계하여 1 kb의 최소 크기의 생성물을 생성하십시오. 인접한 ORF에 영향을 미치지 않도록주의하십시오.
- 2 kb 5 '측면을 Sequence Entry 창에 붙여 넣습니다. "Show Custom Parameters"상자를 클릭하십시오. 다음 맞춤 설계 매개 변수를 입력하십시오 : primer TM 58 (min), 60 (opt) and 62 (max); 프라이머 GC 40 (min), 50 (opt) 및 60 (max); 프라이머 크기 22 (분), 24 (선택) 및 26(최대); Amplicon 크기 1250 (분), 1500 (선택) ....
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결과
단일 반응에서 OSCAR 방법은 선별 마커 카세트를 둘러싼 삭제 대상 유전자의 플랭크를 포함하는 플라스미드를 생성한다. OSCAR을 사용하여 삭제 구문을 생성하는 것은 매우 효율적입니다. 그러나 시스템은 세 가지 단편 (두 개의 유전자 측면과 선별 마커)이 아닌 일부를 포함하는 부분 구조를 생성 할 수 있습니다. 일반적으로 대부분의 대장균 형질 전환 체는 정확한 OSCAR 구조를 포함하고있다. 예를 들어, 그림 2 는 Verticillium dahliae 유전자 VDAG_06812에 대한 OSCAR 결실 구조를 묘사합니다. 이 경우 VDAG_06812의 측면에는 HindIII 또는 KpnI 부위가 없으므로 4,247 bp의 플라스미드 삽입물이 방출되어야합니다. 그림 3 은 비정상적인 구조를 나타내는 레인 5와 11을 제외한 정확한 플라스미드 구조의 HindIII- Kpn.......
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토론
Agrobacterium의 한 단계 건설 - 재조합 준비 - 플라스미드 (OSCAR)는 지속적으로 증가하는 자낭 균 (Ascomycota) 균류에 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법은 Basidiomycota 및 Agrobacterium 매개 형질 전환 및 상동 재조합이 가능하다고 가정하고 다른 진균 성 phyla의 종 (선택 마커 유전자를 유도하는 적절한 프로모터와 함께)에도 쉽게 적용 할 수 있어야한다. 항 곰팡이 화합물의 선택을 다양 화하고 이중 및 고차 돌연변이 체의 생성을 허용하기 위해 추가 마커 벡터가 생성되었습니다. 여기에는 G418, nourseothricin 및 최근에 제초제 인 glufosinate 암모늄과 chlorimuron ethyl 4 에 대한 내성이 포함됩니다.
이 방법은 여기에 제시된 이미지가 주로 파생 된 Verticillium dahliae 와 함께 사용하기 위해 만들어.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 Fusarium verticillioiodes 에서 OSCAR 돌연변이 생성을위한 학부 및 고등학생에게 Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli Crepsac, Jeff Delong, 크리스 킹, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (빅토리아) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , 크리스 벤슨, 루니 스토크 스, 한나 이텔, 제인 헐스, 자시 모하메드, 제임스 로긴스, 켈리 러셀, 그레 니 샤 존스, 크리스틴 셰퍼, 마리암 함머디, 에이브 윌슨, 카트리나 바스 모어, 토니 하퍼, 카린 맥기, 모흐메 모민, Thi Ngoc Le와 Angel Pham.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FungiDB | 데이터베이스/ | ||
| http://fungidb.org/fungidb/ IDT PrimerQuest | IDT | Primer 설계 온라인 소프트웨어/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | 시퀀스 파일 조작 | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli 형질전환체 선택, 구성: 1% 트립톤, 0.05% NaCl, 0.5% 효모 추출물, 1.5% 한천 고형 배지 | ||
| 공동 배양 배지 | ATMT 형질전환 유도(참고 12) | ||
| Aspergillus 최소 배지 with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA 배지 | Acumedia | 7149A | 단일 포자 경사 튜브 |
| PDA-Hyg-Kan 배지 | 곰팡이 ransformant 분리, 150 &mu를 함유하는 PDA; g/mL 하이그로마이신 B 및 100 μ g / mL Kanamycin | ||
| 유리 구슬 | Genlantis | C400100 | 플레이트 확산 |
| 니트로 셀룰로오스 필터 (47mm) | Fisher | 09-719-555 | ATMT를위한 공동 배양 |
| 다양한 원심 분리기 튜브 | 다중 준비 | ||
| 페트리 플레이트 (다양한) | 박테리아 및 곰팡이 | ||
| 배양 pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | 선택 가능한 마커 벡터 |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | 어셈블리 벡터 |
| DH5α One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP 반응 변환 |
| ccdB 생존 대장균 세포 | Life Technologies | A10460 | pOSCAR |
| 목재 이송 스틱 | 유지 보수 식민지 줄무늬 | ||
| 이쑤시개 | 식민지 채취 | ||
| 마이크로 원심 분리기 | 펠릿 박테리아, etc. | ||
| 예비 원심 분리기 | 곰팡이 포자 수집 | ||
| 해부 현미경 | 단일 포자 격리 | ||
| 자동화 세포 카운터 | 포자 현탁액 계산 | ||
| 복합 현미경 | 혈구계 세포 계산 | ||
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | PCR 유전자 측면 생산 정제 |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR 측면 생성 |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamycin | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| 젤레드 | Phoenix Research Products | RGB-4103 | 염색 후 아가로스 젤 |
| Qiagen QIAquick PCR 정제 키트(Cat. 제28104호) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R 또는 OmniMAX Shot_ 1개, Invitrogen의 T1R 2개) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II 효소 혼합물 | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | pOSAR에서 결실 구조를 조립하는 데 사용됩니다 |
참고문헌
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, ....
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재인쇄 및 허가
